• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    納米氧化鈰和碳納米管修飾的過氧化氫傳感器的研制

    2016-07-24 17:24:31常艷兵馮亞娟
    關(guān)鍵詞:辣根氧化酶復(fù)合膜

    常艷兵,馮亞娟,何 瓊

    (曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,云南曲靖655011)

    納米氧化鈰和碳納米管修飾的過氧化氫傳感器的研制

    常艷兵,馮亞娟,何 瓊

    (曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,云南曲靖655011)

    研制了一種基于碳納米管(CNT)、納米CeO2、殼聚糖(CHIT)有機(jī)-無機(jī)復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的酶生物傳感器,該復(fù)合膜結(jié)合了無機(jī)碳納米管、納米CeO2和有機(jī)材料殼聚糖的優(yōu)點(diǎn),固定的辣根過氧化酶較好的保持了其生物活性.在優(yōu)化測(cè)試條件下,連續(xù)加入相同量的H2O2,該傳感器對(duì)H2O2的濃度變化產(chǎn)生迅速靈敏的響應(yīng),當(dāng)過氧化氫溶液濃度在3.2×10-6~2.0×10-3mol/L之間變化時(shí),電極對(duì)其濃度成線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.978.該生物傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),可用于實(shí)際樣品的檢測(cè).

    碳納米管;納米氧化鈰;辣根過氧化酶;過氧化氫;生物傳感器

    納米材料因其特異性在催化、生物醫(yī)藥、磁介質(zhì)和生物電分析領(lǐng)域等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[1],隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,各種納米材料廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器[2-6].

    目前研究最多的電化學(xué)生物傳感器是電化學(xué)酶?jìng)鞲衅鳎傅墓潭ɑ菍⒚甘`在特殊的載體上,不僅能使酶和底物之間進(jìn)行分子交換,又能使酶和整體相互分隔開,保持酶催化特性的方法,該方法具有可反復(fù)使用、壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)[7-9].目前,酶的固定方法有吸附、共價(jià)、交聯(lián)嵌入法、溶膠-凝膠法[10]、固定含酶的生物組織法、交聯(lián)酶聚集體、定向固定和共固定技術(shù)等.這些固定方法復(fù)雜,所用試劑昂貴或溶劑受環(huán)境影響比較大,穩(wěn)定性差、酶易失活.因此,開發(fā)和改善電極表面的吸附性能和建立良好的生物相容性,保持酶的活性,對(duì)傳感器性能的改進(jìn)具有重要的意義[11].將低毒、生物相容性好的無機(jī)納米材料摻雜到生物傳感器的敏感膜上,為生物材料提供合適的微環(huán)境,維持生物組分活性和改善生物傳感器性能,從而研制了葡萄糖氧化酶、辣根過氧化酶等一系列的傳感器[12-15].殼聚糖(CHIT)具有無毒性、無刺激性、良好生物相容性、生物可降解性以及生物活性等諸多優(yōu)良性質(zhì)而在紡織、印染、制藥、食品、生物、環(huán)境保護(hù)等方面被廣泛使用[16-17].

    本實(shí)驗(yàn)將碳納米管和納米CeO2分散在殼聚糖醋酸溶液中,形成有機(jī)-無機(jī)雜化膜,吸附辣根過氧化酶后修飾到電極上制成過氧化氫傳感器,將其用于樣品中過氧化氫的檢測(cè),結(jié)果令人滿意.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器 CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司);超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲波儀器有限公司);納米氧化鈰、碳納米管及殼聚糖復(fù)合膜修飾的玻碳電極作工作電極.

    納米氧化鈰(浙江納米材料應(yīng)用工程技術(shù)中心);碳納米管(深圳納米技術(shù)有限公司);磷酸鹽緩沖溶液(0.067 mol/L,pH=6.47);辣根過氧化酶(HRP,上海生化試劑公司);H2O2(體積分?jǐn)?shù)為30%的水溶液,上海化學(xué)試劑公司);殼聚糖(CHIT,美國(guó)Sigma公司);其它化學(xué)試劑均為分析純,水為二次蒸餾水.

    1.2 CNT的處理 取100 mg CNT在350℃下煅燒2 h,除去殘余的無定形碳,然后將熱處理后的CNT分散在60 mL硝酸(7.0 mol/L)中,不斷攪拌,140℃回流12 h,以除去殘留的催化劑.離心分離,用去離子水洗滌至上層清液pH值為中性,最后在120℃下干燥2 h,得到純凈的CNT.

    1.3 CeO2/CNT/CHIT溶液的制備 稱取2.5 mg碳納米管和25 mg CeO2納米粉末溶于殼聚糖乙酸溶液中,攪拌1 h,超聲波振蕩15 min,待碳納米管和納米 CeO2粉末均勻分散后得到 CeO2/CNT/ CHIT膜液.

    1.4 H2O2傳感器的制備

    1.4.1 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP電極的制備稱取15 mg辣根過氧化酶,用磷酸鹽緩沖溶液(pH =6.47)配成0.5 mL溶液.取5 μL此溶液和5 μL CeO2/CNT/CHIT膜液混合均勻后液涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面,4℃下干燥過夜,使用前用磷酸鹽緩沖溶液(0.067 mol/L,pH=6.47)洗滌酶電極,除去未固定在電極表面的酶.

    1.4.2 GC/CNT/CHIT/HRP電極的制備 稱取2.0 mg CNT溶于4 mL殼聚糖乙酸溶液中,超聲波振動(dòng)15 min,取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混勻后涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面,4℃下干燥過夜待用.

    1.4.3 GC/CeO2/CHIT/HRP電極的制備 稱取1.0 mg納米CeO2溶于1 mL殼聚糖乙酸溶液中,超聲波振動(dòng)15 min,取5 μL此混合液和5 μL HRP酶混勻后涂于預(yù)處理好的玻碳電極表面,4℃下干燥過夜,電極不用時(shí),置于冰箱中4℃保存.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 循環(huán)伏安行為 為了考察辣根過氧化酶的催化作用,比較了GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP傳感器在不同底液中的循環(huán)伏安行為,如圖1,其中(a)磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.47);(b)含有1.0×10-3mol/L對(duì)苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.47); (c)含有1.0×10-3mol/L對(duì)苯二酚和過氧化氫的磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.47).可見在磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.47)中,酶電極產(chǎn)生較低的背景電流:在含有1.0 mmol/L對(duì)苯二酚的0.067 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.47)中產(chǎn)生一對(duì)氧化還原峰,但背景電流信號(hào)仍比較低;在1.0 mol/L對(duì)苯二酚的0.067 mol/L PBS(pH=6.47)溶液中加入1.0 mmol/L H2O2后氧化峰電流減少還原峰電流明顯增大,證實(shí)HRP對(duì)H2O2具有很好的催化作用.

    同時(shí)考察了掃描速度對(duì)傳感器的影響,當(dāng)掃描速度從20到100 mV/s變化時(shí),傳感器在含有1.0 mmol/L H2O2及1.0 mmol/L對(duì)苯二酚的緩沖溶液中的循環(huán)伏安行為(圖2),從圖2中(a)到(e)隨著掃描速度的增大峰電流逐漸增大.為了考察電流的特性,將峰電流對(duì)掃描速度的平方根作圖(見內(nèi)置圖),從圖中可以看出,峰電流與掃描速度的平方根成正比,說明此電流為擴(kuò)散控制的電流.

    2.2 電極的選擇 為了考察不同修飾電極對(duì)H2O2的催化性能,比較了CeO2/CNT/CHIT/HRP、CeO2/CHIT/HRP和CNT/CHIT/HRP 3種過氧化氫傳感器在含有1.0 mmol/L對(duì)苯二酚和0.1 mmol/L H2O2的磷酸鹽緩沖液(pH=6.47)中的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng)見圖3,其中(a)納米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng);(b)納米氧化鈰和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng);(c)碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極的計(jì)時(shí)電流動(dòng)態(tài)響應(yīng).從圖中可以看出3種修飾電極的計(jì)時(shí)響應(yīng)電流由高到低依次為 GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/ CHIT/HRP,表明無機(jī)納米粒子CeO2、CNT與有機(jī)物CHIT一起對(duì)H2O2有協(xié)同催化作用.因此,本實(shí)驗(yàn)選擇GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP作為傳感器用于檢測(cè)H2O2.

    2.3 測(cè)量條件的優(yōu)化

    2.3.1 苯二酚用量對(duì)傳感器的影響 圖4為不同濃度的對(duì)苯二酚存在時(shí)酶電極的響應(yīng)電流.從圖可看出,電流響應(yīng)隨著對(duì)苯二酚濃度的增加而增大,達(dá)到飽和后下降.電子媒介濃度較低時(shí),酶-媒介動(dòng)力機(jī)制將限制響應(yīng)的線性范圍,而電子媒介濃度較高時(shí),背景電流又太大,因此在本實(shí)驗(yàn)選擇使用1.0 mmol/L的對(duì)苯二酚.

    2.3.2 pH的影響 考察了緩沖液pH值在4.92~8.04范圍內(nèi)對(duì)傳感器的影響.如圖5所示,在pH值為6.47時(shí),響應(yīng)電流最大,之后隨pH值的增大響應(yīng)電流反而逐漸減?。虼耍緦?shí)驗(yàn)選擇6.47為最佳pH值.

    2.3.3 工作電位的影響 在不同工作電位下測(cè)定了傳感器的響應(yīng)電流,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,電位在350 mV至-40 mV區(qū)間,傳感器的響應(yīng)電流平緩增加,但幅度不大;從-40 mV降至-300 mV區(qū)間,傳感器的響應(yīng)電流顯著增大.為了避免其它物質(zhì)的干擾,選擇拐點(diǎn)-40 mV作為安培測(cè)量時(shí)的工作電位.

    2.4 傳感器的性能

    2.4.1 傳感器的響應(yīng)性能 在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下向底液中連續(xù)加入等量H2O2,分別用GC/CeO2/CNT/ CHIT/HRP、GC/CeO2/CHIT/HRP、GC/CNT/CHIT/ HRP修飾電極進(jìn)行測(cè)定,其電流計(jì)時(shí)曲線如圖6,校正曲線見內(nèi)置圖,在含有對(duì)苯二酚的硫酸鹽緩沖溶液中連續(xù)加入20 μL 1.0×10-3mol/L H2O2進(jìn)行測(cè)定,其中(a)納米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng);(b)納米氧化鈰和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng);(c)碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2的動(dòng)態(tài)響應(yīng).從圖中可以看出,用納米氧化鈰、殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極和碳納米管、殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極對(duì)H2O2進(jìn)行測(cè)定,響應(yīng)電流較弱,且測(cè)定H2O2溶液的濃度線性范圍較窄,線性較差,相關(guān)系數(shù)較?。眉{米氧化鈰、碳納米管和殼聚糖復(fù)合膜修飾的辣根過氧化酶電極進(jìn)行檢測(cè)時(shí),當(dāng)H2O2的濃度發(fā)生變化,傳感器會(huì)產(chǎn)生迅速靈敏的響應(yīng),說明酶電極有優(yōu)良的電催化行為.響應(yīng)電流值隨H2O2濃度的增加而增大,當(dāng)H2O2達(dá)到一定濃度時(shí)電流也達(dá)到飽和,說明此時(shí)酶的活性位點(diǎn)被底物飽和.測(cè)定H2O2溶液的濃度線性范圍是3.2×10-6~2.0×10-3mol/L,回歸方程為i=0.783+18.67C,相關(guān)系數(shù)為0.978.

    2.4.2 傳感器的重現(xiàn)性 在0.1 mmol/L H2O2溶液中考察了HRP酶電極響應(yīng)電流的重現(xiàn)性,用同一根過氧化氫傳感器連續(xù)測(cè)定16次,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.67%,說明該傳感器具有很好的重現(xiàn)性.

    2.4.3 干擾實(shí)驗(yàn) 為了考察電極的選擇性,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定了草酸、酒石酸、抗壞血酸、谷氨酸、葡萄糖等對(duì)GC/CeO2/CHIT/CNT/HRP電極的影響,結(jié)果見表1.從測(cè)定結(jié)果可以看出,在相同測(cè)定條件下,以上物質(zhì)對(duì)GC/CeO2/CNT/CHIT/HRP電極響應(yīng)電流都沒有明顯干擾.

    表1 干擾物質(zhì)對(duì)電極的影響Table 1 The effects of interfering substances on electrode

    2.5 樣品及加標(biāo)回收檢測(cè) 為了考察該傳感器的實(shí)用性,用其測(cè)定市售利爾康質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫消毒液(溫州康林醫(yī)療器械有限公司)中H2O2的濃度,并與高錳酸鉀氧化還原滴定法測(cè)定的濃度對(duì)比,結(jié)果見表2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用該傳感器和氧化-還原滴定法所測(cè)得的結(jié)果無明顯差異,具有較高的一致性,這表明用該傳感器檢測(cè)H2O2的方法可行.

    在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,向市售利爾康質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫消毒液(以用該過氧化氫傳感器檢測(cè)其平均濃度1.005 0 mmol/L作為計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均濃度)中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫溶液,按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè),加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果列于表3.從檢測(cè)結(jié)果可以看出,回收率較好,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低.

    表2 實(shí)際樣品的測(cè)定Table 2 Determination of H2O2in actual sample(n=5)

    表3 加標(biāo)回收的測(cè)定結(jié)果Table 3 Recovery test of H2O2standards(n=7)

    3 結(jié)語(yǔ)

    本文研制了一種利用CeO2/CNT/CHIT復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的新型H2O2傳感器,這種有機(jī)-無機(jī)復(fù)合膜結(jié)合了兩種材料的優(yōu)勢(shì),用該復(fù)合膜固定的HRP具有更高的生物活性.將傳感器用于檢測(cè)H2O2,獲得了令人滿意的結(jié)果.該傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、制作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),可用于實(shí)際樣品的檢測(cè).

    [1]鄧祥,黃小梅.基于L-半胱氨酸/納米金固定酶的過氧化氫生物傳感器[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,34(2):236-239.

    [2]楊云慧,羅文超,趙曉慧,等.基于石墨烯/鉑納米顆粒復(fù)合材料的過氧化氫無酶?jìng)鞲衅鞯难兄疲跩].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,31(4):11-14.

    [3]楊光明,常艷兵,楊云慧,等.金納米管的制備及其在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào),2010,24(15):81-83.

    [4]常艷兵,楊光明,楊云慧,等.基于Al/Ni雙氫氧化物納米線無酶葡萄糖傳感器的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(5): 670-671.

    [5]曾云龍,李霞飛,黃昊文,等.基于金納米棒-辣根過氧化物酶協(xié)同效應(yīng)的過氧化苯甲酰生物傳感器[J].分析化學(xué)研究

    報(bào)告,2011,39(8):1171-1175.

    [6]楊光明,李麗,楊云慧,等.金屬納米帶的制備及其在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].材料導(dǎo)報(bào),2011,25(3):5-8.

    [7]CONROY P J,HEARTY S,LEONARD P,et al.Antibody production,design and use for biosensor-based applications[J].Seminars in Cell&Developmental Biology,2009,20(1):10-26.

    [8]LIU Y,YU T.Polymers and enzyme biosensors.J.M.S.-Rev[J].Macromolecular Chem Phys,1997,C37:459-00.

    [9]劉佳,殷立峰,江帆,等.電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髟诃h(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].化學(xué)進(jìn)展,2012,24(1):131-133.

    [10]黃淑芳,姜忠義,吳洪,等.溶膠-凝膠法固定化酶的問題與解決途徑[J].高分子通報(bào),2003,4(5):28-29.

    [11]MIAO Y Q,TAN S W.Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on immobilization of peroxidase in chitosan matrix cross-linked with glutaraldehyde[J].The Analyst,2000,125(9):1591-1594.

    [12]張一,田甜,孫艷紅,等.無機(jī)納米材料的生物催化活性[J].科學(xué)通報(bào),2014,59(2):158-160.

    [13]ZHAO J,HENKENS R W,STONEHUERNER J G.Direct electron transfer at horseradish peroxidase-colloidal gold modified electrodes[J].J Electroanalytical Chemistry,1992,327(1/2):109-119.

    [14]范慧敏,鄧春艷,陽(yáng)明輝,等.基于新型二氧化錳-碳納米管復(fù)合材料的高靈敏過氧化氫傳感器[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(4):459-463.

    [15]劉艷,牛衛(wèi)芬,徐嵐.基于層層自組裝技術(shù)制備石墨烯/多壁碳納米管共修飾的過氧化氫傳感器的研究[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2011,39(11):1676-1681.

    [16]OKUMA H,WATANABE E.Flow system for fish freshness determination based on double multi-enzyme reactor electrodes[J].Biosensors and Bioelectronics,2002,17(5):367-372.

    [17]葉光輝.殼聚糖的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廣州化工,2015,43(2):21-24.

    [18]GRABAR K C,F(xiàn)REEMAN R G,HOMMER M B.Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J].Analytical

    Chemistry,1995,67(4):735-743.

    Study on the Hydrogen Peroxide Biosensor Modified by Cerium Oxide Nanoparticles and Carbon Nanotube

    CHANG Yanbing,F(xiàn)ENG Yajuan,HE Qiong

    (School of Chemistry and Chemical Engineering,Qujing Normal College,Qujing 655011,Yunnan)

    We presented an novel enzyme biosensor based on Carbon nanotube(CNT),CeO2nanoparticles and chitosan of inorganic-organic complex film as immobilization matrix with good stability.This material combined the advantages of inorganic CNT,CeO2nanoparticles and organic polymer CHIT,and it maintained a good biological activity that fixed horseradish peroxidase.While adding the same amount of H2O2continuously under the condition of optimization test,the sensor produces high sensitive response to H2O2concentration change.When the concentration of hydrogen peroxide solution changes from 3.2×10-6to 2.0×10-3mol/L,there is a linear relation between electrode and its concentration,and the correlation is 0.978.This biosensor has a fast response,a high sensitivity,a good reproducibility.It can be used for the actual sample testing.

    carbon nanotube(CNT);Cerium oxide nanoparticles;HRP;hydrogen peroxide;biosensor

    O657.15

    A

    1001-8395(2016)04-0571-05

    10.3969/j.issn.1001-8395.2016.04.021

    (編輯 周 俊)

    2015-05-29

    云南省教育廳科學(xué)研究基金(2013Y014)和云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201310684002)

    常艷兵(1980—),男,副教授,主要從事電分析化學(xué)及生物傳感器方面的研究,E-mail:chang-yanbing@126.com

    猜你喜歡
    辣根氧化酶復(fù)合膜
    HPV16E6與吲哚胺2,3-二氧化酶在宮頸病變組織中的表達(dá)
    我愛我的狗!
    復(fù)合膜修復(fù)兔顱頂骨骨缺損的X射線評(píng)估
    PVA/CuSO4·5H2O復(fù)合膜的制備及其結(jié)構(gòu)與性能研究
    小麥多酚氧化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究
    聚乙烯醇/淀粉納米晶復(fù)合膜的制備及表征
    生物降解復(fù)合膜的制備及其性能研究
    金葵:走向世界的小小辣根
    辣根的栽培技術(shù)
    茶葉多酚氧化酶及其同工酶的研究進(jìn)展
    茶葉通訊(2014年2期)2014-02-27 07:55:39
    日韩大片免费观看网站 | 国产熟女欧美一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在现免费观看毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久久久久成人| 中文字幕av成人在线电影| 国产私拍福利视频在线观看| 岛国在线免费视频观看| 国产v大片淫在线免费观看| av专区在线播放| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 天美传媒精品一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本五十路高清| 亚洲精品色激情综合| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产成人aa在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 51国产日韩欧美| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美zozozo另类| 成年女人永久免费观看视频| 床上黄色一级片| 亚洲内射少妇av| 久久久精品欧美日韩精品| 两个人视频免费观看高清| av卡一久久| 国产在视频线精品| 秋霞在线观看毛片| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久国产电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇的逼水好多| 在线a可以看的网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久精品91蜜桃| 色视频www国产| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本免费一区二区三区高清不卡| 婷婷色麻豆天堂久久 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩av不卡免费在线播放| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜福利视频1000在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产成人精品久久久久久| 在线免费观看的www视频| 97热精品久久久久久| 亚洲图色成人| 全区人妻精品视频| 亚洲内射少妇av| 熟女人妻精品中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 日本与韩国留学比较| 我要看日韩黄色一级片| 女人被狂操c到高潮| 国产精品99久久久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 在现免费观看毛片| 18+在线观看网站| 久久精品人妻少妇| 舔av片在线| 51国产日韩欧美| 国产精品人妻久久久久久| 日本五十路高清| 免费大片18禁| 欧美另类亚洲清纯唯美| 高清午夜精品一区二区三区| 国产成人福利小说| 成年免费大片在线观看| 91狼人影院| 日韩欧美精品v在线| 精品免费久久久久久久清纯| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av天堂中文字幕网| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 51国产日韩欧美| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 1024手机看黄色片| 亚洲性久久影院| 国产 一区精品| 日韩av在线大香蕉| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久精品94久久精品| 久久草成人影院| 亚洲欧美日韩东京热| 黄片wwwwww| 亚洲五月天丁香| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美成人a在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产伦在线观看视频一区| 永久免费av网站大全| 麻豆国产97在线/欧美| 51国产日韩欧美| av在线亚洲专区| 91av网一区二区| 欧美激情在线99| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 22中文网久久字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 特大巨黑吊av在线直播| av天堂中文字幕网| 丰满乱子伦码专区| 亚洲人与动物交配视频| 岛国毛片在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 精品人妻熟女av久视频| 九草在线视频观看| 精品一区二区免费观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产高清有码在线观看视频| 国产色爽女视频免费观看| 91久久精品电影网| 校园人妻丝袜中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 两个人的视频大全免费| 免费观看性生交大片5| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 插逼视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 免费看av在线观看网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 中文字幕av在线有码专区| 午夜福利在线在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产高清三级在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜福利在线观看吧| 午夜精品一区二区三区免费看| 三级经典国产精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲图色成人| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 免费大片18禁| 成人午夜高清在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 中文字幕久久专区| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 两个人的视频大全免费| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲av中文av极速乱| 免费观看性生交大片5| 国产综合懂色| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产免费视频播放在线视频 | 国产成人精品久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩综合久久久久久| 国产av不卡久久| 韩国av在线不卡| 久久久久久久久久久免费av| 国产亚洲91精品色在线| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人a区在线观看| 午夜日本视频在线| 能在线免费看毛片的网站| 午夜视频国产福利| 国产成人91sexporn| 久久久国产成人免费| 日韩成人伦理影院| 精品午夜福利在线看| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩成人av中文字幕在线观看| videos熟女内射| 国产乱人视频| av卡一久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 美女黄网站色视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产乱人视频| 国产亚洲精品久久久com| 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久精品热视频| 免费看av在线观看网站| ponron亚洲| av视频在线观看入口| 亚洲av成人精品一区久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 国产人妻一区二区三区在| 天天一区二区日本电影三级| 国产高清视频在线观看网站| av线在线观看网站| 成人三级黄色视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产亚洲精品av在线| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产免费一级a男人的天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 看片在线看免费视频| 黄片wwwwww| 麻豆成人午夜福利视频| 少妇高潮的动态图| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久久成人免费电影| 成人av在线播放网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 99在线人妻在线中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美精品免费久久| 岛国毛片在线播放| 久久久精品94久久精品| 国产一区有黄有色的免费视频 | 亚洲自偷自拍三级| 欧美高清性xxxxhd video| 午夜福利高清视频| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av二区三区四区| 国产私拍福利视频在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产一级毛片七仙女欲春2| av在线播放精品| 国产探花在线观看一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 欧美一区二区亚洲| 免费人成在线观看视频色| 热99在线观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 永久网站在线| 成人无遮挡网站| 尾随美女入室| 丰满乱子伦码专区| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av免费在线观看| 久久草成人影院| 日韩人妻高清精品专区| 2021少妇久久久久久久久久久| 搞女人的毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品人妻少妇| 成人av在线播放网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 天堂√8在线中文| 高清毛片免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 男人的好看免费观看在线视频| 高清视频免费观看一区二区 | 在线免费观看不下载黄p国产| 在线观看66精品国产| 乱人视频在线观看| 少妇的逼水好多| 黑人高潮一二区| 欧美极品一区二区三区四区| 日本午夜av视频| 久久久国产成人免费| 在线a可以看的网站| 18禁在线播放成人免费| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲av成人av| 国产久久久一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品久久视频播放| 成年版毛片免费区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费观看精品视频网站| 久久久成人免费电影| 国产一级毛片在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲成人av在线免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 搞女人的毛片| 国产成年人精品一区二区| 最近的中文字幕免费完整| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产 一区 欧美 日韩| 大话2 男鬼变身卡| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美精品自产自拍| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久99热这里只有精品18| 国产v大片淫在线免费观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 一区二区三区高清视频在线| 亚洲av免费高清在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 免费大片18禁| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 天美传媒精品一区二区| 免费看光身美女| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 久久久色成人| av在线蜜桃| 久久国内精品自在自线图片| 全区人妻精品视频| 国产精华一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品久久久久久久末码| 亚洲成人av在线免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲成av人片在线播放无| 国产一区二区在线av高清观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 一级爰片在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩精品有码人妻一区| av线在线观看网站| 久久这里只有精品中国| av黄色大香蕉| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产av不卡久久| 国产色婷婷99| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产免费又黄又爽又色| 国产黄a三级三级三级人| 免费观看精品视频网站| 97在线视频观看| 成人一区二区视频在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 看黄色毛片网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 秋霞伦理黄片| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品久久视频播放| 九九在线视频观看精品| 丰满少妇做爰视频| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线观看av片永久免费下载| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 色尼玛亚洲综合影院| 热99在线观看视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 七月丁香在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品午夜福利在线看| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品午夜福利在线看| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品午夜福利在线看| 日韩视频在线欧美| 久久久久久国产a免费观看| 秋霞伦理黄片| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品一区www在线观看| 欧美人与善性xxx| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日韩亚洲欧美综合| 欧美激情久久久久久爽电影| 男女国产视频网站| 日本一本二区三区精品| 欧美97在线视频| 99久久成人亚洲精品观看| 熟女电影av网| 免费观看人在逋| 日本一本二区三区精品| 中文欧美无线码| 插阴视频在线观看视频| 伦精品一区二区三区| 国产精品,欧美在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲av日韩在线播放| 99九九线精品视频在线观看视频| 天堂影院成人在线观看| 成人三级黄色视频| 日韩亚洲欧美综合| h日本视频在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲人与动物交配视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 成人二区视频| 日韩制服骚丝袜av| 精品久久久噜噜| 长腿黑丝高跟| 久久久欧美国产精品| 日韩强制内射视频| 特级一级黄色大片| av卡一久久| 高清午夜精品一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品无大码| 中文字幕制服av| 久久99热这里只有精品18| 久久人妻av系列| 日韩欧美三级三区| 波多野结衣巨乳人妻| 偷拍熟女少妇极品色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 性色avwww在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产人妻一区二区三区在| 日日啪夜夜撸| 18禁动态无遮挡网站| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲精品456在线播放app| 在线观看一区二区三区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲性久久影院| 日韩av在线大香蕉| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲人与动物交配视频| av国产免费在线观看| 在线播放国产精品三级| 国产成人精品婷婷| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲最大成人av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一个人免费在线观看电影| 白带黄色成豆腐渣| 在现免费观看毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 黑人高潮一二区| 国产在线男女| 一区二区三区四区激情视频| 欧美日韩综合久久久久久| 老司机影院成人| 午夜日本视频在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲国产欧美在线一区| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产精品成人综合色| av.在线天堂| 成人性生交大片免费视频hd| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 九九爱精品视频在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品一区www在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久久久久久丰满| 高清av免费在线| 欧美+日韩+精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 18禁动态无遮挡网站| 综合色丁香网| 老司机影院毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 欧美色视频一区免费| 久久99精品国语久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 高清视频免费观看一区二区 | 国产高清三级在线| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲av二区三区四区| 久久久国产成人免费| 日韩欧美精品v在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国国产精品蜜臀av免费| 看免费成人av毛片| 精品欧美国产一区二区三| 国产极品天堂在线| 亚洲精品一区蜜桃| 国国产精品蜜臀av免费| 99久久九九国产精品国产免费| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲乱码一区二区免费版| 又爽又黄a免费视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲av二区三区四区| 乱系列少妇在线播放| 日本色播在线视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 免费观看性生交大片5| 亚洲第一区二区三区不卡| 青春草国产在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产精品久久久久久久电影| 少妇人妻精品综合一区二区| 在线观看一区二区三区| av专区在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品一二三区在线看| 日日撸夜夜添| 久久亚洲国产成人精品v| 丰满少妇做爰视频| 只有这里有精品99| 高清在线视频一区二区三区 | 午夜精品一区二区三区免费看| 青青草视频在线视频观看| 全区人妻精品视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 在现免费观看毛片| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人美女网站在线观看视频| 精品免费久久久久久久清纯| av在线蜜桃| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美精品国产亚洲| 日韩国内少妇激情av| 日韩亚洲欧美综合| eeuss影院久久| 成人一区二区视频在线观看| 色播亚洲综合网| 午夜福利高清视频| 色尼玛亚洲综合影院| 国产视频首页在线观看| 插逼视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲av免费在线观看| 内射极品少妇av片p| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品人妻视频免费看| 国产免费又黄又爽又色| 欧美zozozo另类| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲最大成人av| 在线天堂最新版资源| 久久久国产成人精品二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产成人freesex在线| 国产淫片久久久久久久久| 午夜a级毛片| 麻豆一二三区av精品| 久久午夜福利片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 乱系列少妇在线播放| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产精品三级大全| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品一二三区在线看| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲欧美日韩东京热| 水蜜桃什么品种好| 日韩制服骚丝袜av| 国产午夜精品论理片| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久久久久久亚洲| a级一级毛片免费在线观看| 久久6这里有精品| ponron亚洲| 国产乱人偷精品视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 少妇高潮的动态图| 免费黄色在线免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 联通29元200g的流量卡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 简卡轻食公司| 日韩一本色道免费dvd| 美女高潮的动态| 久久久成人免费电影| 国产欧美日韩精品一区二区| 日本免费a在线| 国产午夜福利久久久久久| 美女高潮的动态| 国产精品,欧美在线| 国产又色又爽无遮挡免| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久色成人| av在线观看视频网站免费| 亚洲人成网站在线播| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 日本五十路高清| 亚洲av不卡在线观看| 色吧在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 在线免费观看不下载黄p国产| 美女黄网站色视频| 国产精品国产高清国产av| a级毛色黄片| 九色成人免费人妻av|