藥用地衣長(zhǎng)松蘿和皮果衣提取物抗魚病真菌對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

王炳哲

研究的目的和意義

水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的種類比較多，相關(guān)的病害防治任務(wù)就非常艱巨。目前水霉（Saprolegnia）和綿霉（Achlya）兩個(gè)屬中的一些種類常引起水產(chǎn)動(dòng)物得病，通常稱為水霉病。水霉病流行很廣泛。在魚類的繁殖過程當(dāng)中，水霉病是最為嚴(yán)重的病害。

如果能通過地衣粗提液的抑菌作用，尋找出高效、天然的抗真菌藥物，將會(huì)創(chuàng)造出很好的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。本實(shí)驗(yàn)選擇長(zhǎng)松蘿和皮果衣這兩種地衣的丙酮浸提液和松蘿酸不同溶劑的溶液對(duì)幾種常見魚害真菌進(jìn)行抑制的對(duì)比研究，所得的結(jié)果可為進(jìn)一步研究提供參考，并為研制新的抑制病原菌藥物提供信息。

實(shí)驗(yàn)方法

松蘿酸母液及地衣粗提液的制備

松蘿酸母液的制備：稱取松蘿酸20mg，加20mL的丙酮，搖勻，置于4℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

地衣粗提液的制備：取實(shí)驗(yàn)用地衣材料，除去雜草枯枝等雜質(zhì)，分別稱取2g樣品剪碎或壓碎，置于帶磨口塞子的廣口玻璃瓶中，加入30mL的丙酮，密封，搖勻，室溫浸提約5h，過濾，蒸發(fā)得20mL的地衣浸提液。置于4C保溫環(huán)境中，保存?zhèn)溆谩Ｒ砸掖?、乙酸乙酯為溶劑制備的浸提液方法同上?/p>

菌株的分離培養(yǎng)及鑒定

魚病相關(guān)真菌的來源：長(zhǎng)期放養(yǎng)魚類的水體、水系（岔河水系）中病魚和觀賞魚。

魚體分離：在超凈工作臺(tái)無菌環(huán)境下，用75%酒精棉球擦拭患病魚體表2～3s，用無菌水沖洗干凈，用解剖刀切取魚背部、腹部、尾部肌肉（厚度3～4 mm），用鑷子取魚鱗片，放置于PDA培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)部位做5個(gè)重復(fù)。置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，直至菌絲長(zhǎng)出后，在超凈臺(tái)取菌絲進(jìn)行鏡檢，菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后進(jìn)行純化，純化后得純菌落，4℃保藏。

蓖麻籽富集法：挑選蓖麻籽10粒，煮10min，然后5粒脫皮，5粒劃破，接著再煮5min。將處理好的餌料分別放入培養(yǎng)皿中，每皿放1粒蓖麻籽，倒入岔河水樣及養(yǎng)魚水體水樣30mL浸沒餌料，置于25℃溫箱中培養(yǎng)，每例水樣5個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)2天后，把培養(yǎng)皿洗凈，用清水換取水樣，以減少其他雜菌的污染。逐日觀察，發(fā)現(xiàn)蓖麻籽上有菌絲長(zhǎng)出時(shí)，將長(zhǎng)有菌落的蓖麻籽放入75%的酒精中3～5s，迅速取出，再用無菌水沖洗3次，放入培養(yǎng)皿中，加30mL含100mg/L鏈霉素的自來水，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日鏡檢，直至菌絲長(zhǎng)出。菌絲長(zhǎng)出后，鏡檢，在超凈臺(tái)將菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上。接種好后，置于25℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后，進(jìn)行純化，反復(fù)純化后得純菌落，4C保藏。

菌株的鑒定：通過菌落形態(tài)、菌絲顯微結(jié)構(gòu)等初步鑒定菌株種類。

其他檢測(cè)

除前2項(xiàng)檢測(cè)外，還依據(jù)文獻(xiàn)，做了供試地衣中松蘿酸的檢測(cè)、抑菌活性的測(cè)定和最小抑菌濃度的檢測(cè)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)用SPSS16.0進(jìn)行ANOVA分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

結(jié)果與分析

供試地衣中松蘿酸的檢測(cè)

對(duì)供試地衣中松蘿酸進(jìn)行定性研究，檢測(cè)結(jié)果表明：TLC結(jié)果樣點(diǎn)顯色比較清晰，與松蘿酸對(duì)照，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)松蘿含有松蘿酸，而皮果衣不含有松蘿酸。用微量結(jié)晶法所得結(jié)果和薄層層析法測(cè)得結(jié)果一致。

菌株的鑒定

經(jīng)河北師大微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定，初步確定菌株種類為：鐮刀菌Fusariumsp（菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)見圖1）、兩性綿霉Achlyabisexualis、Pythiumsp和多枝橫梗霉Lichemiaramose。

松蘿酸對(duì)真菌的抑制作用

按照文獻(xiàn)提到的抑菌實(shí)驗(yàn)方法，制備含藥培養(yǎng)基，測(cè)試用乙醇、丙酮、乙酸乙酯作溶劑的松蘿酸溶液對(duì)供試菌株的抑制作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：接種48h后以乙醇、丙酮、乙酸乙酯為溶劑的松蘿酸溶液對(duì)4種供試真菌均有一定的抑制作用。從抑制初期觀察，松蘿酸的乙醇溶液對(duì)供試菌株的抑制效果低于松蘿酸丙酮、乙酸乙酯溶液。圖2給出了不同溶劑的松蘿酸溶液對(duì)鐮刀菌生長(zhǎng)的抑菌率。

兩種地衣粗提液對(duì)真菌的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：接種48h的平均數(shù)據(jù)測(cè)量結(jié)果，2種地衣的丙酮浸提液對(duì)供試菌株的生長(zhǎng)初步顯示出抑制作用，低濃度菌落的直徑大于高濃度菌落的直徑。對(duì)于同一菌株不同的地衣丙酮浸提液對(duì)其抑制活性不相同。

結(jié)論

以乙醇、丙酮、乙酸乙酯為溶劑的3種松蘿酸溶液的抑菌結(jié)果表明：不同溶劑的松蘿酸溶液對(duì)供試菌株均有不同的抑菌作用，丙酮、乙酸乙酯作溶劑的抑菌效果強(qiáng)于乙醇溶劑。

通過2種地衣的丙酮粗提液對(duì)7種供試菌株的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制，結(jié)果顯示：2種地衣丙酮粗提液對(duì)供試菌株的抑制作用不同，長(zhǎng)松蘿丙酮粗提液對(duì)供試菌株的抑菌效果好，皮果衣粗提液的抑菌效果差，說明長(zhǎng)松蘿是因?yàn)槠渲泻兴商}酸導(dǎo)致抑菌作用良好。

對(duì)供試地衣中的松蘿酸進(jìn)行定性研究，采用微量結(jié)晶法和薄層層析法，這兩種方法結(jié)果顯示一致，即長(zhǎng)松蘿含有松蘿酸，而皮果衣中不含松蘿酸。

創(chuàng)新點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)研究了松蘿酸及2種地衣粗提液對(duì)魚病真菌的抑制作用，證明了是地衣中的松蘿酸對(duì)魚病真菌有較強(qiáng)抑制作用。地衣和地衣粗提物可以作為真菌抑制劑，提供了解決化學(xué)農(nóng)藥殘留、開展真菌的生物防治的新材料。

地衣長(zhǎng)松蘿粗提物對(duì)來自漁業(yè)生產(chǎn)的幾種常見真菌生長(zhǎng)具有抑制的作用，且抑制作用一般隨著濃度增加而增加，對(duì)農(nóng)業(yè)、漁業(yè)的進(jìn)一步研究推廣提供了參考數(shù)據(jù)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)皮果衣粗提物對(duì)部分供試菌株的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，具體原因有待進(jìn)一步的研究。

松蘿酸乙醇溶液對(duì)鐮刀菌和多枝橫梗霉有抑制作用，而松蘿酸乙醇溶液對(duì)兩性綿霉、腐霉在200mg/L、400 mg/L濃度時(shí)有促進(jìn)作用；松蘿酸乙酸乙酯溶液對(duì)多枝橫梗霉抑制效果最好。

該項(xiàng)目獲得第30屆全國(guó)青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競(jìng)賽項(xiàng)目中學(xué)組植物學(xué)一等獎(jiǎng)。

專家評(píng)語(yǔ)

該項(xiàng)目用不同方法從地衣長(zhǎng)松蘿和皮果衣中提取有效成分，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)松蘿的提取物對(duì)導(dǎo)致魚病的真菌生長(zhǎng)有抑制作用，為魚病的天然產(chǎn)物防治提供了參考。學(xué)生在研究中得到了訓(xùn)練，研究報(bào)告書寫規(guī)范，顯示出較強(qiáng)的創(chuàng)新能力，建議進(jìn)一步開展魚病防治研究。