環(huán)介導等溫擴增技術(shù)研究進展

宋玉財，王　彬，王官曉，李　鵬，劉洪明，于曉云，于小川，徐曉靜，王俊卿（. 山東省煙臺市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺　64003；. 煙臺市牟平區(qū)龍泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東煙臺　64003）

?

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)研究進展

宋玉財1，王彬1，王官曉1，李鵬2，劉洪明1，于曉云1，于小川1，徐曉靜1，王俊卿1
（1. 山東省煙臺市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東煙臺264003；2. 煙臺市牟平區(qū)龍泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東煙臺264003）

摘要：環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）是由Notomi等建立的一種核酸擴增技術(shù)。該方法最大的優(yōu)點是能夠在63～65 ℃的等溫條件下擴增特定DNA序列，并在30～60 min內(nèi)觀察到結(jié)果。LAMP已經(jīng)成功用于許多病毒的檢測，本文主要概述了LAMP技術(shù)原理及發(fā)展現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導等溫擴增技術(shù)；原理；發(fā)展現(xiàn)狀

1　LAMP技術(shù)原理

1.1LAMP引物相關(guān)

LAMP反應(yīng)需要4條引物，分別針對靶序列上6個不同位置，包括一對外引物F3、B3和一對內(nèi)引物FIP（Forward inner primer）、BIP（Backward inner primer）。FIP由F1C區(qū)和F2區(qū)構(gòu)成，BIP由B1c區(qū)和B2區(qū)構(gòu)成［1］。圖1為各引物所在位置示意圖。

引物設(shè)計是LAMP反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵。現(xiàn)在通常使用日本榮研株式會社的在線LAMP引物設(shè)計程序Primer Explore（http：//www. primerexplorer.jp/e/）完成設(shè)計工作。Tm值、引物末端穩(wěn)定性、GC含量、二級結(jié)構(gòu)和引物間距等幾個方面都會影響到引物的品質(zhì)。之后的報道證實在添加一對環(huán)狀引物后，可縮短大約一半的LAMP反應(yīng)時間。

1.2LAMP反應(yīng)擴增原理

圖1　LAMP引物位置示意圖

在LAMP反應(yīng)的開始，F(xiàn)IP引物中的F2片段首先與模板F2c區(qū)互補結(jié)合，在Bst DNA聚合酶作用下，由模板鏈的3’端向5’端延伸，而后F3引物與模板的F3c結(jié)合。因為Bst DNA聚合酶具有鏈置換的功能，沿著F3引物擴增出的新鏈將之前的互補鏈置換下來。接著BIP引物的B2片段再與這條被置換下的互補鏈的B2c區(qū)結(jié)合，過程與之前的F引物相同。一個循環(huán)下來就可以得到LAMP反應(yīng)的起始莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖2）。在起始結(jié)構(gòu)形成后，循環(huán)便只需要兩條內(nèi)引物參與進行，最終產(chǎn)物是一系列含有不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA混合物（圖3）。

圖2　LAMP反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)

圖3　含不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA示意圖

2　LAMP的產(chǎn)物檢測

LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物可以通過多種方式來獲得驗證。第一種，它和PCR產(chǎn)物一樣可以通過瓊脂糖凝膠電泳的方式，與PCR產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)確定大小的單一條帶不同，LAMP產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)下呈現(xiàn)出特有的階梯狀條帶。第二種，也是最適用于基層臨床檢測的判斷方法，可以向LAMP產(chǎn)物中添加SYBR Green I等核酸染料，即能直接通過肉眼來觀察結(jié)果。以SYBR Green I為例，不擴增的情況反應(yīng)管內(nèi)液體為橙紅色，而有擴增產(chǎn)物的情況，反應(yīng)管內(nèi)的液體則是黃色的。如果肉眼觀察還不能肯定結(jié)果，只需將反應(yīng)管置于紫外燈下，在黑暗中呈現(xiàn)明亮熒光的說明模板發(fā)生了擴增。第三種，在核酸合成過程中，dNTP不斷析出焦磷酸根離子，剛好與體系中的Mg2+作用生成焦磷酸鎂沉淀。這本來是副反應(yīng)的產(chǎn)物，卻再次提供了一個肉眼判斷結(jié)果的方式。LAMP反應(yīng)完成之后，將反應(yīng)管離心，如果在管底側(cè)發(fā)現(xiàn)白色沉淀，即代表了陽性結(jié)果。因為肉眼觀察總有誤差，2001年日本研制出專用的終點濁度儀來代替肉眼確定結(jié)果，此后又設(shè)計出了LAMP實時濁度儀，對定量觀察反應(yīng)各時刻的擴增情況提供了條件。

3　LAMP技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

LAMP是2000年由日本學者Notomi等人開發(fā)出的一種新型體外核酸擴增技術(shù)，它能在1小時內(nèi)65 ℃左右的等溫條件下把數(shù)拷貝的DNA擴增到至少109拷貝。該報道還驗證了LAMP技術(shù)同時適用于RNA為模板的情況，添加反轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶共同作用即可。2002年，Nagamine等［2］發(fā)現(xiàn)多增加一對環(huán)引物（LF、LB）可以加速LAMP反應(yīng)進程，其中LF位于模板F1c區(qū)和F2c區(qū)之間，而LB位于B1c區(qū)和B2c區(qū)之間。

LAMP技術(shù)自發(fā)明以來，在動植物病原微生物檢測、動物胚胎性別確定以及轉(zhuǎn)基因食品檢測等多個領(lǐng)域都有了進一步的應(yīng)用。其中在豬病診斷方向，2005年，Thekisoe等［3］率先使用LAMP方法對實驗感染豬的伊氏錐蟲進行了檢測。2006年，Dukes等［4］建立了檢測口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）的RT-LAMP方法。同年，Toriniwa等［5］建立了用于檢測日本乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus， JEV）的實時定量RTLAMP方法。2008年，Blomstr?m等［6］建立了豬水泡病病毒（Swine vesicular disease virus， SVDV）的一步法RT-LAMP。同年，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所的Chen等［7-8］分別建立了檢測PCV2 的LAMP和高致病性PRRSV的RT-LAMP快速診斷方法；另外一名國內(nèi)學者En［9］建立了檢測PRV 的LAMP方法。2009年，Chen［10-11］又分別建立了檢測豬瘟病毒（Classical swine fever virus， CSFV）的RT-LAMP和檢測PPV的LAMP方法。2010年，鑫婷等［12］建立了檢測豬呼吸與繁殖綜合癥病毒的RT-LAMP方法。2013年，申世川等［13］建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型（porcine circocirus type 2，PCV-2）的LAMP方法。2014年，張莉等［14］建立了檢測豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）的LAMP方法。同年， 李彬等［15］建立了檢測豬Hoko virus 的LAMP方法。2015年，時建立等［16］建立了檢測豬霍亂沙門氏菌的LAMP方法。

LAMP還可與其他技術(shù)結(jié)合，發(fā)展出一系列的檢測方法。2003年，Maruyama等［17］研發(fā)出原位LAMP技術(shù)，成功檢測了大腸桿菌O157： H7中的stx2基因。與原位PCR技術(shù)相比，該法對細胞的損傷更小。2004年，Hataoka等［18］將LAMP與聚甲基丙烯酸甲酯電泳芯片結(jié)合應(yīng)用于基因檢測方向。同年，F(xiàn)ukuta等［19］建立了免疫捕捉反轉(zhuǎn)錄LAMP技 術(shù)（Immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification， IC/RTLAMP），用于檢測菊花中的番茄斑萎病毒，此法比同時應(yīng)用的IC/RT-PCR靈敏100倍以上。2006年，國內(nèi)學者申建維［20］率先建立了多重LAMP檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA和種特異性基因femA的方法，利用兩類分子信標熒光探針分別與兩種待測基因擴增產(chǎn)物結(jié)合，檢測兩者的熒光值。2007年，Iseki等［21］通過在引物中添加限制性內(nèi)切酶酶切位點建立的多重LAMP方法，用以鑒別檢測牛巴貝斯焦蟲和雙芽巴貝斯焦蟲。2013年，史亞東等建立了檢測隱孢子蟲的LAMP方法。

4　小結(jié)

LAMP技術(shù)是一種新型核酸擴增技術(shù)。與其他檢測方法相比該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增高效快速、步驟簡單、鑒定簡便等優(yōu)點。但LAMP技術(shù)也有缺點，它的原理較為復雜，特別是引物的設(shè)計相當專業(yè)；由于敏感性高，假陽性困擾結(jié)果的判定，無法做多重擴增；在定量能力方面不如熒光定量PCR等。隨著對LAMP研究的深入，該技術(shù)將進一步優(yōu)化完善，LAMP技術(shù)將會在病原微生物檢測方面發(fā)揮越來越重要的作用。

參考文獻：

［1］ Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loopmediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Res，2000，28（1）：63.

［2］ Nagamine K， Hase T， Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers［J］. Mol Cell Probes，2002，16（3）：223-229.

［3］ Thekisoe O M， Inoue N， Kuboki N， et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification （LAMP），PCR and parasitological tests for detection of Trypanosoma evansi in experimentally infected pigs ［J］.Vet Parasitol，2005，130（3）：327-330.

［4］ Dukes J P， King D P， Alexandersen S. Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus［J］.Arch Virol，2006，151（6）：1093-1106.

［5］ Toriniwa H， Komiya T. Rapid detection and quantification of Japanese encephalitis virus by real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification［J］.Microbiol Immunol，2006，50（5）：379-387.

［6］ Blomstr?m A L， Hakhverdyan M， Reid S M， et al. A one-step reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay for simple and rapid detection of swine vesicular disease virus［J］.J Virol Methods，2008，147（1）：188-193.

［7］ Chen H T， Zhang J， Sun D H， et al. Rapid detection of porcine circovirus type 2 by loop-mediated isothermal amplification［J］.J Virol Methods，2008，149（2）：264-268.

［8］ Chen H T， Zhang J， Sun D H， et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Virol Methods，2008，153（2）：266-268.

［9］ En F X， Wei X， Jian L， et al. Loop-mediated isothermal amplification establishment for detection of pseudorabies virus［J］.J Virol Methods，2008，151（1）：35-39.

［10］ Chen H T， Zhang J， Ma L N， et al. Rapid pre-clinical detection of classical swine fever by reverse transcription loopmediated isothermal amplification［J］.Mol Cell Probes，2009，23（2）：71-74.

［11］ Chen H T， Zhang J， Yang S H， et al. Rapid detection of porcine parvovirus DNA by sensitive loop-mediated isothermal amplification［J］.J Virol Methods，2009，158（1）：100-103.

［12］ 鑫婷，侯紹華，賈紅，等. 豬呼吸與繁殖綜合癥病毒RT-LAMP檢測方法的建立［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010（1）：1.

［13］ 申世川，王一成，袁秀芳，等.豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報，2013（1）：20.

［14］ 張莉，鄢明華，李秀麗，等.豬流感病毒LAMP檢測方法的建立［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014（7）：30.

［15］ 李彬，杜露平，何孔旺，等.豬Hokovirus LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2014（2）：40.

［16］ 時建立，彭喆，郭立輝，等.豬霍亂沙門氏菌LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用［J］.中國動物檢疫，2015（8）：22.

［17］ Maruyama F， Kenzaka T， Yamaguchi N， et al. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loop-mediated isothermal amplification［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69（8）：5023-5028.

［18］ Hataoka Y， Zhang L， Mori Y， et al. Analysis of specific gene by integration of isothermal amplification and electrophoresis on poly （methyl methacrylate） microchips［J］. Anal Chem，2004，76（13）：3689-3693.

［19］ Fukuta S， Ohishi K， Yoshida K， et al. Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt virus from chrysanthemum［J］.J Virol Methods，2004，121（1）：49-55.

［20］ 申建維，王旭，范春明，等.多重分子信標環(huán)介導等溫擴增快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［J］.中華醫(yī)院感染學，2006，16（7）：729-733.

［21］ Iseki H， Alhassan A， Ohta N， et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification （mLAMP）method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites［J］.J Microbiol Methods，2007，71（3）：281-287.

（責任編輯：杜憲）

Research Progress of Loop Mediated Isothermal Amplification Technology

Song Yucai1，Wang Bin1，Wang Guanxiao1，Li Peng2，Liu Hongming1，Yu Xiaoyun1，Yu Xiaochuan1，Xu Xiaojing1，Wang Junqing1
（1.Yantai Animal Health Supervision Institution，Yantai，Shandong 264003；2. Longquan Veterinary Station，Yantai，Shandong 264003）

Abstract：Loop-mediated isothermal amplification（LAMP） is an amplification method developed by Notomi et al and has been applied successfully for the detection of many viruses，with advantages of amplifying specific DNA under 63～65℃，observing results within an hour. LAMP technology principle and its development status were introduced in this paper.

Key words：LAMP；principle；development status

中圖分類號：S851.3

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X2016-06-0060-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.018