山東省青島市2015年禽流感監(jiān)測分析

馬清霞，何宇乾，邴啟政，楊勝男，段笑笑，梁建波，周相華（青島市動物疫病預防與控制中心，山東青島　266000）

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山東省青島市2015年禽流感監(jiān)測分析

馬清霞，何宇乾，邴啟政，楊勝男，段笑笑，梁建波，周相華
（青島市動物疫病預防與控制中心，山東青島266000）

摘要：［目的］調(diào)查青島市家禽高致病性禽流感免疫水平，測定該地區(qū)的禽流感流行率，分析流行的風險因素。［方法］在全市家禽養(yǎng)殖場（戶）、農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場和野鳥棲息地隨機抽樣，采用血凝抑制方法測抗體，采用熒光定量RT-PCR方法檢測禽流感病原，同時開展禽流感血清學和病原學檢測。利用GIS、EXCEL軟件，分析青島市禽流感檢測樣品的空間分布、免疫抗體水平、病原流行率及分布。［結(jié)果］青島市家禽H5N1禽流感（Re-6）免疫抗體場戶合格率為76.3%，個體合格率為74.8%；H5N1禽流感（Re-7）免疫抗體場戶合格率為72.5%，個體合格率為71.4%；H5亞型禽流感病原學檢測全部陰性；H9亞型禽流感個體流行率為1.18%，全部來源于農(nóng)貿(mào)市場和屠宰場。［結(jié)論］青島市家禽高致病性禽流感的免疫狀況良好，在所有家禽和野禽活動場點未發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感病毒，表明青島市高致病性禽流感防控效果較好。

關鍵詞：禽流感；流行率；血清學調(diào)查；病原學監(jiān)測

山東省青島市家禽養(yǎng)殖量大、養(yǎng)殖密度高、規(guī)?；潭鹊?。根據(jù)《中國畜牧業(yè)年鑒》（2015年）中的數(shù)據(jù)，截至2015年底，青島市家禽存欄5 020萬只，其中蛋雞1 333萬只、肉雞3 686萬只、水禽248萬只。蛋雞規(guī)模場的場戶占比為4.10%，養(yǎng)殖數(shù)量占全市蛋雞的67.16%。肉雞規(guī)模場的場戶占比為26.20%，養(yǎng)殖數(shù)量占全市肉雞85%。青島市有正大、九聯(lián)、萬福等大型規(guī)?；藴驶怆u養(yǎng)殖企業(yè)，是我國目前最大的現(xiàn)代化肉雞養(yǎng)殖基地、出口備案基地和優(yōu)質(zhì)雞肉原料供應基地。作為港口城市，青島市交通發(fā)達，陸路、水路和航空的運輸頻繁，一旦發(fā)生高致病性禽流感，會對青島市的經(jīng)濟、公共衛(wèi)生和對外貿(mào)易等造成非常大的影響。因此，根據(jù)青島市家禽養(yǎng)殖類型、禽流感發(fā)生的風險點，采取隨機抽樣檢測的方法，調(diào)查全市家禽高致病性禽流感的群體免疫合格率和個體免疫合格率，評估全市禽流感病毒（包括H5、H7和H9亞型）的個體陽性率和群體陽性率，為青島市禽流感防控措施的制定提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料與方法

1.1監(jiān)測對象與范圍

監(jiān)測對象：青島市范圍內(nèi)的雞、鴨、鵝和其它家禽及野生禽鳥。

監(jiān)測范圍：種禽場、規(guī)模商品禽場、散養(yǎng)戶、屠宰場、候鳥主要棲息地和其它重點地區(qū)。

規(guī)模養(yǎng)殖場：蛋雞、水禽存欄2 000只以上，肉雞存欄10 000只以上；散養(yǎng)戶：蛋雞、水禽存欄2 000只以下，肉雞存欄10 000只以下。

1.2抽樣策略與樣本量計算

1.2.1血清學檢測的抽樣策略。以全市所有的家禽養(yǎng)殖場（戶）為抽樣框，按照二階段隨機抽樣策略進行抽樣監(jiān)測。首先根據(jù)估計流行率的抽樣方法隨機抽取養(yǎng)殖場（戶），按照預期抗體合格率為90%、可接受誤差為5%、置信水平95%計算抽樣場（戶）數(shù)，計算得出青島市需要采集130個養(yǎng)殖場（戶）。在每個養(yǎng)殖場點內(nèi)，根據(jù)發(fā)現(xiàn)疫病的抽樣策略，隨機抽取個體。每個場點按照群內(nèi)陽性率10%，置信水平95%，隨機抽樣30份，不足30只的全部采集［1］。

1.2.2病原學檢測的抽樣策略

病原學檢測采用基于風險的抽樣策略。在養(yǎng)殖場點，同時開展血清學和病原學檢測。根據(jù)文獻中的禽流感風險分析結(jié)果，結(jié)合青島市家禽屠宰場、野鳥棲息地和農(nóng)貿(mào)市場的數(shù)量和分布，在每個區(qū)市選取交易量最大的3個農(nóng)貿(mào)市場，共21個，在膠州市的大沽河入?？?、平度市大澤山、即墨市流浩河濕地、黃島區(qū)的狄家河水庫等4個野鳥遷徙路徑和候鳥棲息地，2個家禽定點屠宰場進行禽流感病原學檢測。在每個場點內(nèi)，根據(jù)發(fā)現(xiàn)疫病的抽樣方法，隨機抽取動物個體。每個場點按照群內(nèi)陽性率10%，置信水平95%，試驗敏感性為100%，每個場點隨機抽樣30份，不足30只的全部采集［1-2］。

1.3樣品來源及場點分布

在全市范圍內(nèi)，隨機抽取130個養(yǎng)殖場（戶）和21個農(nóng)貿(mào)市場、4個野鳥棲息地和2個家禽屠宰場。具體分布見圖1。

圖1　禽流感檢測的場點數(shù)分布

1.4血清學檢測

在家禽養(yǎng)殖場采集咽喉/泄殖腔棉拭子的同時，翅下靜脈采集全血，分離血清。依據(jù)GB/T 18936-2003標準中的血凝抑制試驗（HI）方法，使用H5亞型禽流感血凝抗原（Re-6和Re-7）和陽性血清（Re-6和Re-7）（哈爾濱畜牧獸醫(yī)研究所，批號分別為2014013、2014010和2014001、2014002），測定H5亞型禽流感免疫抗體水平和H7亞型HI抗體滴度。HI抗體滴度在24以上的判為免疫抗體合格或抗體陽性，場戶內(nèi)合格率≥70%的判為抗體合格場戶或抗體陽性場戶。

1.5病原學檢測

采集家禽養(yǎng)殖場家禽的咽喉/泄殖腔棉拭子，野鳥新鮮糞便，屠宰場家禽的肺臟或氣管，農(nóng)貿(mào)市場殺雞用的砧板、刀具、脫毛器上的殘留物，用棉簽擦拭或采集雞籠上的雞糞等樣品。

依據(jù)GB/T 19438.1-2004、GB/T19438.2-2004、GB/T 19438.3-2004和GB/T 19438.4-2004標準，利用禽流感通用型和H5、H7、H9亞型禽流感熒光定量RT-PCR試劑盒檢測禽流感病毒核酸（凱杰生物科技有限公司生產(chǎn)，批號分別為20150102、20150516、20150602和20150512）。

對棉拭子樣品和糞便樣品，每個樣品取200 μL上清液，每5個樣品混為1個樣品。首先用禽流感通用型熒光RT-PCR方法篩檢，對陽性樣品，再進行H5亞型、H7亞型和H9亞型禽流感分型檢測。

1.6數(shù)據(jù)分析

個體免疫合格率=（接種禽流感疫苗后免疫合格的動物數(shù)/實際接種動物數(shù)）×100%

群體免疫合格率=（個體免疫合格率＞70%的場戶數(shù)/實際接種的場戶數(shù)）×100%

個體陽性率=（禽流感陽性個體數(shù)/檢測動物數(shù)）×100%

群體陽性率=（禽流感陽性場戶數(shù)/所有檢測場戶數(shù)）×100%

2　結(jié)果

2.1禽流感血清學檢測

2.1.1免疫抗體檢測。在全市范圍內(nèi)，隨機抽取130個養(yǎng)殖場（戶），其中，散養(yǎng)戶數(shù)占49%，規(guī)模場數(shù)占51%。共采集樣品1 909份，其中來源于蛋雞散養(yǎng)戶421份、蛋雞規(guī)模場1 008份、種雞場240份、水禽規(guī)模場150份、肉雞規(guī)模場90份。經(jīng)檢測，全市家禽H5亞型禽流感的整體免疫合格率在70%以上，詳見表1。進一步分析不同養(yǎng)殖類型的免疫抗體水平發(fā)現(xiàn)，種雞場、蛋雞規(guī)模場和蛋雞散養(yǎng)戶的H5亞型免疫抗體均較高，而肉雞規(guī)模場和水禽規(guī)模場的免疫抗體較低，詳見表2。

2.1.2H7亞型抗體檢測。對130個場戶的1 969份來源于蛋雞規(guī)模場、肉雞散養(yǎng)戶、水禽規(guī)模場的家禽血清樣品，檢測H7亞型抗體，其中有49份樣品為陽性，來源于7個養(yǎng)殖場戶。H7亞型抗體的場戶陽性率為5.38%，個體陽性率為2.48%。其中規(guī)模場的場戶陽性率為7.57%，散養(yǎng)戶的場戶陽性率為3.12%。

2.2病原學檢測結(jié)果

隨機選擇130個家禽養(yǎng)殖場（戶），采集1 909份咽喉/泄殖腔棉拭子。包括64個散養(yǎng)戶（421份）、49個蛋雞規(guī)模場（1 008份）、8個種雞場（240份）、6個水禽場（150份）和3個規(guī)模肉雞場（90份），同時在禽流感高風險場點，隨機選取21個農(nóng)貿(mào)市場（110份）、4個野鳥棲息地（120份）、2個屠宰場（60份），共采集290份棉拭子樣品。

表1　禽流感的免疫抗體水平

表2　不同養(yǎng)殖類型的禽流感的免疫抗體水平

對來源于上述157個場點的2 199份家禽的咽喉/泄殖腔棉拭子、糞便樣品進行禽流感通用熒光定量RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)26份陽性，分別來源于2個農(nóng)貿(mào)市場和1個家禽屠宰場。進一步分型檢測發(fā)現(xiàn)全部為H9亞型。綜合檢測結(jié)果，青島市H9亞型禽流感個體陽性率為1.18%，場戶陽性率為2.00%。110份農(nóng)貿(mào)市場樣品中，有9份H9亞型禽流感陽性，農(nóng)場市場的H9亞型禽流感個體陽性率為7% ，場戶陽性率為10%。

3　討論

本次以2015年秋季集中檢測的一個時間點進行橫斷面檢測［3-4］，利用獸醫(yī)流行病學知識，在不同風險區(qū)域采取二階段隨機抽樣，調(diào)查青島市家禽禽流感流行狀況和免疫水平。在風險較低的養(yǎng)殖場（戶），根據(jù)估計流行率策略，結(jié)合血清學檢測進行隨機抽樣；在風險較高的農(nóng)貿(mào)市場、野鳥棲息地、水禽場等場點，根據(jù)發(fā)現(xiàn)疫病的策略，采用基于風險的抽樣。

根據(jù)本次血清學檢測結(jié)果，青島市家禽禽流感免疫抗體場戶合格率和個體合格率均在70%以上，說明禽流感免疫狀況良好。進一步分層分析發(fā)現(xiàn)，蛋雞規(guī)模場和散養(yǎng)戶抗體合格率均在80%以上，規(guī)模肉雞場和水禽場的抗體水平則較低。通過調(diào)查得知，青島市部分出口備案肉雞場只免疫H9亞型禽流感，不免疫H5亞型高致病性禽流感。水禽場盡管按程序進行禽流感免疫，但水禽對禽流感疫苗的體液免疫較差，導致免疫抗體水平不高［5］。本次檢測在部分養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)H7亞型血清學陽性場群，其對應的棉拭子檢測為核酸陰性。經(jīng)臨床觀察，這些雞群無異常。

在蛋雞規(guī)模場、規(guī)模肉雞場、種雞場、散養(yǎng)戶和水禽場等養(yǎng)殖場點的樣品中未檢測出禽流感病毒，說明養(yǎng)殖場所沒有被禽流感病毒污染。這進一步說明，青島市家禽養(yǎng)殖場所發(fā)生禽流感的風險較低。

青島市處于候鳥遷徙路徑上，全市有山林、湖泊、濕地、水庫等79處，有391種野鳥。本次隨機選取4個候鳥、野鳥秋季遷徙經(jīng)過的濕地，采集新鮮、濕潤的野鳥糞便進行禽流感檢測，但未檢測出禽流感病毒，說明在青島市由野鳥引發(fā)家禽禽流感的風險較低。

活禽市場（或農(nóng)貿(mào)市場）提供了病毒從禽類傳播到包括人在內(nèi)的哺乳動物的條件。2013年，當活禽市場關閉后，新發(fā)的H7N9感染病例幾乎為0，但活禽市場開放后又出現(xiàn)了新發(fā)病例［6］。本次檢測的21個農(nóng)貿(mào)市場的環(huán)境、籠具和砧板棉拭子樣品中，有8份H9亞型禽流感陽性，分別來源于2個農(nóng)貿(mào)市場。家禽屠宰場也是禽流感病毒檢出率較高的地方。本次檢測在青島市2個大型家禽屠宰場中，發(fā)現(xiàn)其中1家有H9亞型禽流感陽性。

綜上，盡管在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中沒有檢測出禽流感病毒，但在全市家禽養(yǎng)殖的末端環(huán)境中仍存在禽流感病毒，為避免流通環(huán)節(jié)的H9亞型禽流感病毒污染養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，家禽養(yǎng)殖場應嚴格做好生物安全防護措施，對進出養(yǎng)殖場的人員、車輛嚴格控制和消毒，對養(yǎng)殖場的雞蛋、糞便等產(chǎn)品做好消毒和無害化處理；嚴格控制養(yǎng)殖場飼料、獸藥來源；養(yǎng)殖場做好封閉管理，嚴防家禽與野鳥接觸。

參考文獻：

［1］沈朝建，王幼明. 獸醫(yī)流行病學調(diào)查與監(jiān)測：抽樣技術手冊［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

［2］沈朝建，劉麗蓉，康京麗，等.以風險為基礎調(diào)查或監(jiān)測證明無疫的樣本量與敏感性計算［J］. 中國獸醫(yī)雜志，2014，50（3）：94-96.

［3］張海明，彭聰，劉華. 獸醫(yī)流行病學調(diào)查中的抽樣方法概述［J］. 中國動物檢疫，2015，32： 55-59.

［4］陳繼明. 重大動物疫病監(jiān)測指南［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2008.

［5］薛峰，張評滸，劉曉文，等. H5亞型禽流感疫苗免疫肉雞、水禽后抗體消長規(guī)律的研究［J］. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2005，26：1-3.

［6］Yu H，Wu J T，Cowling B J，et al. Effect of closure of live poultry markets on poultry-to-person transmission of avian influenza A H7N9 virus： an ecological study［J］. Lancet，2014，383： 541-548.

（責任編輯：朱迪國）

Surveillance and Analysis of Avian Influenza in Qingdao City of Shandong Province in 2015

Ma Qingxia，He Yuqian，Bing Qizheng，Yang Shengnan，Duan Xiaoxiao，Liang Jianbo，Zhou Xianghua
（Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center，Qingdao，Shandong 266000）

Abstract：［Objective］This paper aims to investigate HPAI immunity level of poultry， to determine avian influenza prevalence and to analyzes corresponding risk factors in Qingdao. ［Methods］ Antibody was tested by hemagglutination inhibition and pathogens of avian influenza through fluorescent quantitative RT-PCR. Spatial distribution of test samples，immune antibody level of the avian influenzas as well as prevalence and distribution of pathogens， were analyzed by GIS and EXCEL. ［Results］ A total of 1969 serology samples from 130 sites and 21992 etiological samples from 17 sites were collected in poultry farms（households），farmer's markets，slaughter houses and wild bird habitats in Qingdao. The immunity qualified rate of poultry farms（households）and individual qualified rate against H5N1（Re-6）were 76.3% and 74.8%， while those against H5N1（Re-7）were 72.5% and 71.4%， respectively. The 100% negative of H5 subtype HPAI and 1.18% individual prevalence of H9 subtype HPAI were reported by etiological test.These H9 AI viruses were from farmer's markets and slaughter houses. ［Conclusion］ HPAI immunity was good in Poultry and no HPAI virus was discovered in all places of poultry and wildfowl in Qingdao.

Key words：avianinfluenza；prevalence；serosurvey；pathogenic surveillance

中圖分類號：S851.3

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）06-0018-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.006