黔產(chǎn)艾納香對鎘脅迫的生理響應及其體內(nèi)鎘分布特征

梁娟++周華芳++任建國

摘要：為探明黔產(chǎn)艾納香對鎘（Cd）脅迫的生理響應及其體內(nèi)Cd分布特征，采用沙培試驗研究不同濃度Cd（0、10、30、60、120 mg/L）處理下艾納香生理生化指標的變化規(guī)律及Cd在其體內(nèi)器官和亞細胞分布特征。結(jié)果表明：隨著Cd脅迫濃度的增加，葉綠素含量整體上逐漸降低，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白含量均有不同程度的升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性呈先升高后降低的變化；艾納香各器官Cd含量隨處理濃度的增加而增加，并表現(xiàn)為根>莖>葉；根、莖和葉細胞中Cd主要分布在可溶組分、細胞壁中，根、莖、葉可溶組分中Cd的分配比例分別為519%～69.7%、45.4%～69.7%、52.5%～57.9%，根、莖、葉細胞壁中Cd的分配比例分別為26.0%～37.8%、244%～45.6%、36.8%～41.4%；隨著Cd處理濃度的增加，細胞壁中Cd含量所占比例呈上升趨勢，而可溶組分所占比例呈下降趨勢?？偟目闯?，黔產(chǎn)艾納香對Cd脅迫具有一定的生理適應性，細胞壁對Cd的滯留和可溶組分對Cd的區(qū)室化可能是其主要的解毒機制。

關(guān)鍵詞：艾納香；鎘（Cd）；器官分布；亞細胞分布；生理響應

中圖分類號： S567.23+9.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0271-04

鎘（Cd）是環(huán)境中繼汞（Hg）、鉛（Pb）之后對環(huán)境、人類健康危害最大的第3種重金屬元素[1]，具有移動性強、毒性大、易吸收積累等特征[2]。Cd是植物生長發(fā)育的非必需元素，但是與其他重金屬相比，卻更容易被植物吸收[3]。大量研究表明，Cd在植物體內(nèi)累積到一定程度后會引起生理代謝紊亂，并抑制生長發(fā)育，嚴重時可導致死亡[4-5]；同時，蓄積在植物可食部分的Cd還可以進入食物鏈威脅人類健康。

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]是制取冰片的藥用植物[6]，其葉、嫩枝、根均可入藥，具有溫中活血、祛風除濕、殺蟲等功效。作為貴州省十大苗藥之一，艾納香是貴州省許多名牌中成藥產(chǎn)品的原料藥[7]，如金骨蓮膠囊、心胃止痛膠囊、咽立爽等[8]。有調(diào)查顯示，貴州省農(nóng)業(yè)土壤中存在Cd的重污染[9]，而且黔產(chǎn)艾納香對Cd也表現(xiàn)出較強的富集作用[10-11]，因此了解Cd脅迫對艾納香生理生態(tài)的影響具有重要的現(xiàn)實意義，但是目前相關(guān)的基礎(chǔ)研究比較缺乏。本研究通過沙培試驗，探討不同濃度Cd對黔產(chǎn)艾納香幾個典型生理指標的影響以及艾納香體內(nèi)Cd的分布特征，以期為艾納香的安全性用藥和無公害種植提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

選取貴州省羅甸縣同一艾納香生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）種植示范基地內(nèi)生長良好、長勢基本一致的艾納香根生春苗作為供試植物。盆栽河沙均用去離子水洗凈、風干備用。

1.2試驗方法

試驗于2014年6月在貴州醫(yī)科大學（北京路校區(qū)）內(nèi)進行。用自來水將供試幼苗根部的泥沙沖洗干凈，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，然后移栽至盛有等量河沙的聚丙烯塑料花盆中，每盆定植1株，采用改良Hoagland營養(yǎng)液（pH值5.5～6.5）進行澆灌培養(yǎng)。緩苗7 d后，將存活艾納香苗隨機分成5組，進行Cd脅迫處理。將分析純CdCl2·2.5H2O加入到營養(yǎng)液中，設(shè)置5個Cd處理水平：0（CK）、10、30、60、120 mg/L（以純Cd2+計），每個處理10株苗。人工避雨，自然光照條件，視河沙濕度不定期澆入等體積含相應濃度Cd的營養(yǎng)液。處理 10 d 后，隨機從各組選取5株測定生理生化指標：葉綠素含量、可溶性蛋白的鮮質(zhì)量含量、脯氨酸（Pro）的鮮質(zhì)量含量、丙二醛（MDA）的鮮質(zhì)量含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性（鮮質(zhì)量）。30 d后收獲剩余植株，用自來水、蒸餾水沖洗根部、地上部，再用20 mmol/L EDTA-2Na浸泡根部20 min，以去除根表面吸附的Cd2+；最后再用去離子水沖洗2～3次，吸干植物表面的水分，按根、莖、葉分別取樣，將一部分鮮樣置于 -80 ℃ 冰箱待分析Cd的亞細胞分布，其余樣品于105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒質(zhì)量，研細后過1 mm篩，用于各器官Cd含量的測定。大部分試驗用水為超純水。

1.2.1生理生化指標測定[12]取植株相同部位葉片（植株頂端第4～6張葉）用于測定葉綠素、可溶性蛋白、Pro、MDA含量，SOD活性用根進行測定。葉綠素含量的測定采用95%乙醇浸提法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）比色法，Pro含量的測定采用酸性茚三酮比色法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法。

1.2.2各器官Cd含量測定分別稱取一定量研磨后的根、莖、葉干樣，按體積比加入5 ∶2的HNO3-H2O2混合酸，用Milestone ETH型微波消解儀進行消解，然后用原子吸收光譜儀（contrAA700，德國）測定Cd含量。

1.2.3亞細胞組分Cd含量測定亞細胞組分分離參照Wang等的方法[13]并略作改動，取冷凍的新鮮根、莖、葉樣本，按料液比1 g ∶10 mL加入預冷的提取緩沖液充分研磨成勻漿液。提取緩沖液組成：250 mmol/L蔗糖、pH值7.5的 50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L二硫代蘇糖醇。勻漿液過300目尼龍網(wǎng)，過濾后的殘渣為含細胞壁的殘渣部分，濾液在15 000 r/min下離心30 min，沉淀為細胞器組分，上清液為可溶物質(zhì)組分（含細胞質(zhì)、液泡內(nèi)高分子和大分子有機物質(zhì)、無機離子）。試驗操作均在4 ℃條件進行。細胞壁、細胞器組分參照“1.2.2”節(jié)進行消解和Cd含量的測定；可溶物質(zhì)組分用超純水定容后再用原子吸收光譜儀測定Cd含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)以“均值±標準差（x±s）”表示，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD-t法，α=0.05。采用GraphPad Prism 5軟件完成作圖。

2結(jié)果與分析

2.1Cd脅迫對艾納香生理生化特性的影響

2.1.1Cd脅迫對葉綠素含量的影響從表1可以看出，艾納香葉片內(nèi)葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量隨著Cd處理濃度的增加總體上逐漸降低。當Cd濃度≥10 mg/L時，葉綠素a、總?cè)~綠素含量與CK相比差異顯著（P<0.05）；但葉綠素b含量在Cd濃度增加到30 mg/L以上后，與CK比較差異才顯著（P<0.05）；葉綠素組成（葉綠素a/葉綠素b）隨Cd濃度增加而逐漸增大，但各組間差異不顯著。

2.1.2Cd脅迫對Pro、可溶性蛋白含量的影響由圖1-A、圖1-B看出，隨著Cd處理濃度增加，艾納香葉片內(nèi)的可溶性蛋白、Pro含量總體上呈升高趨勢，表明Cd脅迫能促進可溶性蛋白、Pro的合成。在30 mg/L及以下的Cd處理濃度下，可溶性蛋白、Pro含量與CK相比差異不顯著；Cd濃度增加至60 mg/L時，可溶性蛋白含量達最大值，與CK相比增加了48.2%；在60、120 mg/L Cd處理濃度下，與其他各處理間Pro含量差異均顯著（P<0.05）。

2.1.3Cd脅迫對MDA含量、SOD活性的影響由圖1-C可知，Cd處理組的艾納香葉片內(nèi)的MDA含量均較CK組有所增加，但各組間差異不顯著。當Cd處理濃度≤60 mg/L時，艾納香根部的SOD活性均較CK有所增加，但差異不顯著；在Cd處理濃度增加至120 mg/L時，SOD活性表現(xiàn)出明顯的降低，與其他處理之間差異均顯著（P<0.05）（圖1-D）。表明低濃度的Cd使SOD活性增強，高濃度Cd抑制SOD活性。

2.2Cd在艾納香體內(nèi)的器官分布

由表2可知，除了對照組的葉中Cd含量未檢出外，其他處理組的根、莖、葉中的Cd含量均隨著Cd處理濃度的增加而增加，且各器官各處理組的Cd含量差異都顯著（P<0.05）。艾納香各器官Cd含量的分布大小為：根>莖>葉。

2.3Cd在艾納香體內(nèi)的亞細胞分布

由表3可知，Cd在艾納香根、莖、葉亞細胞組分中的分布均表現(xiàn)為：可溶組分（F3）>細胞壁（F1）>細胞器（F2），根、莖、葉中F3、F1 2個部分總的Cd含量分別占總量的 88.1%～95.7%、91.0%～94.2%、90.6%～94.7%?？梢奀d主要積累在細胞壁和可溶部分，細胞器中含量相對較少。隨著Cd處理濃度的增加，各組分中的Cd含量均逐漸增加；

根、莖、葉可溶組分中Cd的分配比例隨著Cd處理濃度的增加總體上呈下降趨勢，細胞壁中Cd的分配比例卻隨著Cd處理濃度的增加總體上呈上升趨勢。

3討論與結(jié)論

植物在逆境脅迫下，當其質(zhì)膜受損后，細胞會啟動一系列的響應機制，具體表現(xiàn)為電解質(zhì)、某些小分子有機物的滲漏、酶活性的改變、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加（如脯氨酸、可溶性糖）以及葉綠素含量降低等[14]。

葉綠素含量是衡量植物葉片生理功能的重要生理指標，其變化既可以反映植物葉片光合作用的強弱，也可用以表征植物組織、器官的衰老狀況[15]。本研究結(jié)果顯示，隨著Cd處理濃度的提高，艾納香葉綠素含量總體上呈現(xiàn)下降趨勢，這與以往相關(guān)研究結(jié)果一致[14，16]。Cd脅迫導致葉綠素含量降低與其間接抑制葉綠素的合成以及直接破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)[17-18]。各處理組間的葉綠素組成（葉綠素a/葉綠素b）差異無統(tǒng)計學意義，可能是因為Cd對艾納香葉片捕光系統(tǒng)中色素的影響速率相似[19]。

可溶性蛋白大多是參與植物體內(nèi)各種代謝的酶類，其含量增多有助于維持植物細胞的正常代謝，從而提高植物的抗逆性[20]。Pro作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其積累有著對逆境適應的意義，被認為是測定各種逆境脅迫的理想指標[21]。在本研究中，隨著Cd處理濃度的增加，艾納香葉片內(nèi)可溶性蛋白、Pro含量呈上升趨勢，有助于維持細胞的正常代謝，從而緩解Cd的傷害。李清飛等在研究麻瘋樹、大豆幼苗等其他植物時也得到了相似的結(jié)果[16，22]。但張瓊等卻發(fā)現(xiàn)，隨著Cd處理濃度的增加，Pro含量呈現(xiàn)先升后降的變化[23]，其原因可能是植物抗逆性能力的有限性，低濃度的Cd能通過促進體內(nèi)Pro的積累來維持正常代謝，高濃度的Cd會使細胞機能喪失，導致Pro含量的下降。

在重金屬脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)（ROS）攻擊膜脂上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)過氧化反應[24]。MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等活性物質(zhì)交聯(lián)，形成不溶性化合物（脂褐素）沉積，干擾細胞的正常生命活動[25]，通常作為衡量脂質(zhì)過氧化損傷的指標。同時，植物體內(nèi)也將通過抗氧化酶[SOD、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等]和非酶物質(zhì)[谷胱甘肽（GSH）、疏基（SH）等]消除ROS。在抗氧化酶中，SOD是一種重要的活性氧防御酶，在消除ROS過程中起重要作用。本研究中，Cd處理組的艾納香葉片內(nèi)MDA含量均較對照組有所增加，但是各組間差異不顯著，表明葉片細胞膜還沒有受到明顯的傷害，其完整性、功能性尚好；隨著Cd處理濃度增加，根的SOD活性先升高后降低，表明低濃度Cd能使SOD活性增強，高濃度Cd可能破壞了清除ROS酶系統(tǒng)的平衡。

Cd被植物吸收后，大部分富集在根部，遷移到地上部的一般較少[26]。大量研究顯示，根部是植物富集Cd的主要部位，它作為植物對Cd脅迫的一種有效應對機制，能限制Cd向植物地上部遷移，從而減輕對地上部分的毒害作用[27-28]。在本研究中，艾納香各器官Cd含量大小為：根>莖>葉，說明根也是艾納香積累Cd的主要器官，這可能是艾納香抵御Cd毒害的機制之一。

細胞壁被認為是保護原生質(zhì)體免受重金屬毒害的第一道屏障，細胞壁的多糖分子、蛋白質(zhì)分子含有大量的羧基、羥基、氨基酸殘基和醛基等親金屬離子的配位基團，可與進入植物體內(nèi)的金屬離子配位而貯存部分金屬離子，從而減少金屬離子進入原生質(zhì)體，以維持細胞的正常生理代謝功能[29]。植物可溶組分包括細胞質(zhì)、液泡2個部分，液泡是植物細胞代謝副產(chǎn)品和囤積廢物的場所，它含有多種能與重金屬離子結(jié)合而使金屬離子在細胞內(nèi)被區(qū)隔化的物質(zhì)（蛋白質(zhì)和有機酸等）。因此，細胞壁對重金屬的滯留、可溶組分對重金屬的區(qū)室化被認為是植物解毒的2個重要途徑[30]。在本研究中，艾納香根、莖、葉亞細胞組分中Cd的分布表現(xiàn)為：可溶組分>細胞壁>細胞器，表明可溶組分的液泡區(qū)室化可能是艾納香解毒的原因之一。隨著Cd處理濃度的增加，艾納香根、莖、葉的細胞壁中Cd所占比例呈上升趨勢，而可溶組分中Cd所占比例呈下降趨勢，表明細胞壁對Cd的固持作用增強，減少了進入可溶組分中的Cd，也限制了Cd向活性較強的細胞器中轉(zhuǎn)運，這種方式可能也起到了重要的解毒作用。

綜上所述，在本試驗條件下，Cd脅迫能降低黔產(chǎn)艾納香葉綠素含量，提高可溶性蛋白、Pro、MDA的積累，使SOD活性發(fā)生改變。根是積累Cd的主要器官，細胞中的Cd則主要分布在細胞壁、可溶組分中。說明黔產(chǎn)艾納香對鎘脅迫具有一定的生理適應性，細胞壁對Cd的滯留和可溶組分對Cd的區(qū)室化可能是其主要解毒機制。

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