丹參莖葉提取工藝研究

劉　濤， 焦　芳， 張　敏， 徐騰達(dá)， 周蔚昕

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都　610106)

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丹參莖葉提取工藝研究

劉濤， 焦芳， 張敏， 徐騰達(dá)， 周蔚昕

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都610106)

摘要：目的：優(yōu)選丹參莖葉的提取工藝.方法：采用HPLC測定含量，流動相甲醇—乙腈—甲酸—水(30∶10∶1∶59)，檢測波長286 nm.以丹酚酸B和迷迭香酸提取量的綜合評分為指標(biāo)，通過正交試驗考察溶媒用量、提取時間和提取次數(shù)對丹參莖葉提取工藝的影響.結(jié)果：優(yōu)選的提取工藝為A2B3C2，即12倍量的20%乙醇，提取2次，每次1.5 h.結(jié)論:優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、合理，指標(biāo)成分提取率較高，可為丹參資源的開發(fā)利用提供參考.關(guān)鍵詞： 丹參莖葉；正交；丹酚酸B；迷迭香酸

0引言

中藥材丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，是中藥中應(yīng)用最早、最廣泛的藥物之一，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛之功效[1],臨床常用于心血管疾病、急慢性肝炎等疾病的抗菌消炎[2].丹參根中主要含脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類成分.隨著臨床應(yīng)用范圍的擴大,急需尋找新藥源.丹參傳統(tǒng)用藥部位為根和根莖，棄去莖葉部分，但現(xiàn)代藥理試驗證明丹參莖葉的藥理作用與根、根莖相似,臨床療效也類似[3-4].據(jù)統(tǒng)計，丹參地上部分約占全植株的67%，藥源豐富，對于其開發(fā)和利用意義重大.本課題選擇采收于四川中江縣的丹參莖葉為原藥材，參照文獻(xiàn)[5]的相關(guān)方法，對丹參莖葉提取工藝進(jìn)行了研究，為其生產(chǎn)和使用提供實驗依據(jù).

1儀器與試劑

1.1試劑

實驗所用試劑包括：迷迭香酸對照品(批號，111871-201404)、丹酚酸B對照品(批號，111562-201212)，購自中國食品藥品檢定研究所；丹參莖葉(批號，20141203)，采自中江石泉鄉(xiāng)；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為怡寶純凈水.

1.2儀器

實驗所用儀器為：IChrom5100型高效液相色譜儀，大連依利特儀器有限公司生產(chǎn).

2方法與結(jié)果

2.1迷迭香酸、丹酚酸B含量測定

2.1.1色譜條件.

實驗的色譜條件為：SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相，甲醇—乙腈—甲酸—水(30∶10∶1∶59)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為286 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為室溫.

2.1.2對照品的制備.

取迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加75%甲醇制成每1 mL含迷迭香酸0.0923 mg、丹酚酸B 0.0634 mg的混合對照品溶液.

2.1.3供試品溶液的制備.

取提取液適量，混勻，濾過，作為供試品溶液備用.2.1.4線性關(guān)系考察.

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合對照品溶液2、4、8、10、14、20 μL分別進(jìn)樣，測定峰面積.以峰面積Y對進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，得迷迭香酸線性回歸方程，Y=181.44X-10.493，r=0.9999；丹酚酸B線性回歸方程，Y=59.180X+18.303，r=0.9993.結(jié)果表明，迷迭香酸與丹酚酸B分別在0.1846～1.18460 μg及0.1268～1.2680 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積成良好線性關(guān)系.

2.1.5精密度試驗.

精密吸取迷迭香酸、丹酚酸B混合對照品溶液10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.80%和1.54%，表明精密度較好.

2.1.6穩(wěn)定性實驗.

精密吸取同一供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測定峰面積，迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.51%和1.95%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.1.7重復(fù)性實驗.

取同一批樣品，照“2.1.3”項下的方法制成供試品溶液，平行6份，按照“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算含量，迷迭香酸、丹酚酸B RSD分別為0.75%和1.93%，表明本方法重復(fù)性良好.

2.1.8回收率實驗.

取已知含量的丹參莖葉粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入迷迭香酸對照品4 mL(0.4792 mg/mL)，丹酚酸B對照品2.3 mL(0.1273 mg/mL)，按照“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件測定其含量，計算平均加樣回收率，迷迭香酸、丹酚酸B分別為99.26%、96.45%，其RSD分別為3.52%、1.08%.表明本方法回收率良好.

表1　加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.1.9原藥材含量測定.

取樣品約2.0 g，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件測定含量，測定結(jié)果為，丹酚酸B含量為0.74%，迷迭香酸含量為1.66%.

2.2丹參莖葉提取工藝研究

2.2.1提取溶劑考察.

取丹參莖葉粗粉5份，每份100 g，分別加入10倍量的60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、20%乙醇、水，提取2次，每次0.5 h，濾過，濾液合并，作為供試品溶液備用.按照“2.1.1"項下色譜條件測定其含量，結(jié)果如表2所示.

表2　提取溶劑考察

注：綜合評分=丹酚酸B的量*50%+迷迭香酸的量*50%

由表2結(jié)果可見，水提取綜合評分較低，所得的指標(biāo)成分含量明顯低于乙醇提取，而不同濃度乙醇提取效果相差也較大，經(jīng)加權(quán)評分計算，20%乙醇提取的加權(quán)評分值大于其他乙醇濃度提取，故選擇20%乙醇為提取溶劑.

2.2.2正交試驗.

參考已有的文獻(xiàn)資料數(shù)據(jù)和單因素實驗結(jié)果，本研究選取提取次數(shù)(A)、提取時間(B)及溶媒倍量(C)為考察因素，以丹酚酸B和迷迭香酸含量的綜合評分為考察指標(biāo).取干燥丹參莖葉粗粉9份，每份100 g，按照 L9(34)正交設(shè)計表進(jìn)行正交試驗，因素水平見表3，結(jié)果見表4，方差分析見表5.

表3　因素水平表

表4　正交試驗結(jié)果

注：綜合評分=丹酚酸B的量*50%+迷迭香酸的量*50%

表5　方差分析表

由直觀分析及方差分析可知，影響丹參莖葉提取工藝因素順序依次為C>B>A，其中，C對提取工藝有顯著影響，A、B無顯著影響.本研究最終確定提取工藝為，A2B3C2,即，12倍量20%乙醇，提取2次，每次1.5 h.

2.2.3正交驗證實驗.

稱取丹參莖葉粗粉3份，每份為100 g，分別加12倍量20%乙醇，提取2次，每次1.5 h，濾過，濾液合并，搖勻，作為供試品溶液進(jìn)行驗證實驗.實驗結(jié)果得，丹酚酸B的量分別為0.528 g、0.441 g、0.529 g，迷迭香酸的量分別為0.923 g、0.947、1.005 g.結(jié)果表明，所選擇的工藝穩(wěn)定、可行.

3討論

丹參是我國使用最廣泛的中藥之一，傳統(tǒng)藥用部位為根和根莖，在采收時將莖葉部分去除.現(xiàn)代藥理試驗證明其藥理作用與丹參根及根莖相似，且丹參莖葉的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于丹參根及根莖，因此，將其開發(fā)利用可以擴大藥材來源.本實驗從溶媒種類、溶媒倍量、提取時間、提取次數(shù)4個因素出發(fā)，在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗來研究丹參莖葉的提取工藝條件.最終篩選出提取工藝為，12倍量的20%乙醇提取2次，每次1.5h.此工藝條件下，丹酚酸B和迷迭香酸的得率分別為0.499%、0.958%.

本研究還發(fā)現(xiàn)，丹參莖葉采用回流提取法，工藝簡單可行，且溶媒可以回收再利用，大大提高了實驗可行性.迷迭香酸對熱穩(wěn)定，實驗提取率較高，而丹酚酸B熱穩(wěn)定性較差[8]，提取時間不宜過長.

參考文獻(xiàn)：

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[8]晉迎申.丹酚酸B熱穩(wěn)定性研究[J].上海醫(yī)藥,2014,35(21):78-80.

Extraction Technology of Salvia Miltiorrhiza Stem and Leaf

LIUTao,JIAOFang,ZHANGMin,XUTengda,ZHOUWeixin

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The paper is going to optimize the extraction process of Salvia Miltiorrhiza stem and leaf.HPLC is used to determine the content of mobile phase methanol-acetonitrile-formic acid water(30∶10∶1∶59),and the detection wavelength is 286 nm.By using the comprehensive score of salvianolic acid B and the extraction of rosmarinic acid content as the index,the effects of solvent dosage,extraction time and extraction frequency on the stems and leaves of Salvia Miltiorrhiza extraction process are tested through orthogonal test.The results show that the optimal extraction process is A2B3C2,that is,12 times of the amount of 20% ethanol,2 times of extraction with 1.5 h each time.The conclusion drawn in the paper is that the optimized extraction process is efficient and stable.The extraction rate of the index component is comparatively high.Therefore,the optimized extraction process can be used for reference for the development and utilization of Salvia Miltiorrhiza.

Key words:Salvia Miltiorrhiza stem and leaf;orthogonal;salvianolic acid B;rosemarinic acid

文章編號：1004-5422(2016)02-0127-03

收稿日期：2016-04-06.

作者簡介：劉濤(1976 — )， 男， 博士， 高級工程師， 從事中成藥新藥開發(fā)與再評價研究.

中圖分類號：R284.2；S567.5+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A