尾巨桉DH32-26組培快繁技術(shù)

盧開成

(廣西國有派陽山林場,廣西寧明 532500)

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尾巨桉DH32-26組培快繁技術(shù)

盧開成

(廣西國有派陽山林場,廣西寧明 532500)

摘要[目的]探索尾巨桉DH32-26組培快繁技術(shù)，為其規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。[方法]采用組織培養(yǎng)手段，以尾巨桉DH32-26半木質(zhì)化萌發(fā)莖段為材料，對外植體誘導(dǎo)及無菌組織培養(yǎng)體系進(jìn)行研究。[結(jié)果]最佳外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，發(fā)芽率為92.3%；最佳增殖培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖個(gè)數(shù)為3.7；最佳生根培養(yǎng)基為改良1/2MS+IBA 0.2 mg/L +ABT 0.3 mg/L，生根率可達(dá)98.3%。[結(jié)論]該研究獲得了尾巨桉初代誘導(dǎo)、增殖和生根適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，初步達(dá)到工廠化生產(chǎn)要求。

關(guān)鍵詞尾巨桉DH32-26; 外植體; 組織培養(yǎng)

尾巨桉DH32-26是廣西國有東門林場從純種子代測試試驗(yàn)和雜交育種試驗(yàn)中選育的優(yōu)良單株之一，具有年儲(chǔ)蓄量高、性狀穩(wěn)定優(yōu)良、抗逆性和適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，通過區(qū)域試驗(yàn)及營林生產(chǎn)中的大規(guī)模推廣應(yīng)用，已通過國家林木良種審定，確定為全國林木良種，并產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)及生態(tài)效應(yīng)[1-2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，木材纖維等原料需求量的日益提升，林木良種選育工作的逐步成熟，我國先后在桉樹、松樹、柚木、杉木和油棕等木本植物的良種選育和組培擴(kuò)繁技術(shù)上取得了很大進(jìn)步，獲得了長足的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益，為林業(yè)發(fā)展作出了突出的貢獻(xiàn)。組培擴(kuò)繁技術(shù)在速度、質(zhì)量以及遺傳穩(wěn)定性方面都具有明顯的優(yōu)勢，目前關(guān)于尾巨桉DH32-26組培技術(shù)的研究鮮見報(bào)道。筆者以尾巨桉DH32-26半木質(zhì)化萌發(fā)莖段為材料，對外植體誘導(dǎo)及無菌組織培養(yǎng)體系進(jìn)行了研究，旨在為尾巨桉的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料尾巨桉DH32-26(Eucalyptusgrandis×E.urophyllaDH32-26)是廣西國有東門林場選育的林木良種。

1.2試驗(yàn)方法選用15年生巨尾桉DH32-26砍伐后樹干基部萌發(fā)的半木質(zhì)化莖段做外植體，取材時(shí)間宜天氣晴朗3 d后，取樣前7 d每日噴淋10%新潔爾滅溶液，10：00采集萌芽條，材料用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈后備用。外植體消毒采用3個(gè)處理： A 75%乙醇30 s + 0.1%氯化汞7 min；B 75%乙醇30 s + 10%次氯酸鈉10 min；C 75%乙醇30 s +飽和次氯酸鈣12 min。 外植體滅菌處理后的材料切成1～2 cm長的莖段，每段帶1個(gè)節(jié)接種至培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。

外植體初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理：A 改良MS+6-BA 1.2 mg/L+NA A 0.6 mg/L； B 改良MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L； C改良MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。增殖培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理： A 改良MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L； B 改良MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L； C 改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.15 mg/L。生根培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理： A 改良1/2MS+IBA 0.3 mg/L+ABT 0.4 mg/L； B 改良1/2MS+IBA 0.2 mg/L+ABT 0.3 mg/L；C 改良1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ABT 0.2 mg/L。所有培養(yǎng)基中均添加瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.5～5.6，在121 ℃高溫滅菌15 min。培養(yǎng)條件為溫度22～26 ℃，光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度2 500～3 500 lx。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(SPSS 19.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

污染率=(污染的穗條數(shù)/接種的穗條數(shù))×100%

萌發(fā)率=(萌發(fā)的穗條數(shù)/接種的穗條數(shù))×100%

褐化率=(褐化的穗條數(shù)/接種的穗條數(shù))×100%

出芽率=(出芽的穗條數(shù)/接種的穗條數(shù))×100%

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方式比較由表1可知，滅菌方式B存活率和出芽率最高，滅菌后的外植體生長較好、萌發(fā)較快且出芽較多，優(yōu)勢明顯，為最佳消毒方案。滅菌方式A雖然污染率低，但存活率和出芽率分別較B低42.9%和29.4%，褐化率是B和C的5.9和15.1倍，這說明該方式可有效降低外植體的污染率，但外植體受消毒劑的影響最為敏感，易出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致其死亡。滅菌方式C污染率最高，褐化率最低，存活率和出芽率分別較B低25.2%和7.3%，是次之的處理選擇。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)使用10%次氯酸鈉滅菌時(shí)，可將10 min滅菌過程分成2次5 min滅菌過程(中間使用無菌水清洗數(shù)次)，對黃化、白化和不萌發(fā)現(xiàn)象有一定的抑制作用，且滅菌效果不變。

表1　3種外植體消毒方式對比

注：每個(gè)處理接種100株，取3次以上平均數(shù)。

Note: There were 100 plants for each treatment. The data were the mean value of three repetitions.

2.2桉樹無菌組培體系的建立

2.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基。由表2可知，初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基的細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比以處理B效果最佳，生長快速旺盛，有效芽多且長勢及狀態(tài)良好，莖粗葉壯；處理A激素濃度過高，萌芽率較B低28.2%，外植體基部易形成愈傷團(tuán)塊，葉片卷曲，莖桿矮小；處理C激素濃度偏低，萌芽率較B低15.5%，萌芽正常但長勢較弱。因此，處理B為最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表2　不同外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對比

注：每個(gè)處理接種100株，取3次重復(fù)平均數(shù)。

Note: There were 100 plants for each treatment. The data were the mean value of three repetitions.

2.2.2增殖培養(yǎng)基。由表3可知，增殖培養(yǎng)基的細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比以B處理效果最佳，增殖倍數(shù)適宜，為2.3，芽長勢良好，有效芽多且生長較快；處理A激素濃度過高，增殖倍數(shù)較B低37.8%，莖芽伸長較B短26.9%，且易出現(xiàn)愈傷團(tuán)和玻璃化，難以馴化，即使很快擴(kuò)大繁殖，也會(huì)成為無效芽；處理C激素濃度偏低，增殖倍數(shù)較B低67.6%，莖芽伸長較B短15.4%，萌芽正常，但生長慢數(shù)量少，降低了擴(kuò)繁速度，對育苗生產(chǎn)進(jìn)度有很大影響。因此，處理B為最佳增殖培養(yǎng)基。

2.2.3生根培養(yǎng)基。由表4可知，生根培養(yǎng)基的生長素IBA和NAA濃度配比以處理B效果最佳，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根繁多，平均根長可達(dá)2.45 cm，苗木生長旺盛、長勢均一，移栽后成活率可達(dá)85%；處理A生長素濃度過高，生根率較B低8.4%，平均生根條數(shù)較B低31.1%，易出現(xiàn)培養(yǎng)基褐化、根基部膨大現(xiàn)象，部分不生根，苗木較弱且長勢參差不齊，移栽后成活率較低、長勢較弱；處理C生長素濃度偏低，生根率較B低12.2%，平均生根條數(shù)較B低40.0%，根系較弱，側(cè)根少，苗木生長緩慢，細(xì)弱，長勢參差不齊，移栽后成活率較低且生長較慢。因此，處理B為最佳生根培養(yǎng)基。

表3　不同增殖培養(yǎng)基對比

注：試驗(yàn)結(jié)果取3次平均數(shù)。

Note: The data were the mean value of three repetitions.

表4　不同生根培養(yǎng)基對比

注：試驗(yàn)結(jié)果取3次平均數(shù)，試驗(yàn)時(shí)間為接種后15 d。

Note: The data were the mean value of three repetitions. Test time as 15 d after inoculation.

3討論與結(jié)論

該研究采用75%乙醇和10%次氯酸鈉分別消毒處理30 s和10 min效果最好，存活率可達(dá)39.7%，出芽率為82.7%。外植體采集后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行清洗消毒并接種至初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可最大程度地保持枝條活性、減少創(chuàng)口污染、提高萌芽率，其他桉樹外植體研究也得到類似結(jié)論[3]。外植體木質(zhì)化程度對污染率、出芽率和褐化程度有很大影響，木質(zhì)化程度越高，消毒后受消毒劑影響傷害越小，但內(nèi)生菌生長旺盛，容易產(chǎn)生二次污染；新生頂芽材料嬌嫩，受消毒劑傷害最大，但活性高、內(nèi)生菌含量少，成活后污染率低；枝條中上部半木質(zhì)化的莖段介于二者之間，消毒劑耐受力強(qiáng)，出芽率高，污染率低，是最佳的外植體材料[4]。

不同細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比對外植體誘導(dǎo)馴化有顯著影響，初代和增殖培養(yǎng)均以處理B最佳，初代培養(yǎng)接種5～7 d后芽開始萌動(dòng)，10 d左右基部有綠色突起，25～20 d誘導(dǎo)出芽。該試驗(yàn)結(jié)果表明，初代和增殖培養(yǎng)中激素濃度過高均易導(dǎo)致變異畸形和玻璃化；濃度過低導(dǎo)致生長緩慢甚至無法萌動(dòng)；激素濃度適宜時(shí)有效芽最多，生長水平達(dá)到最佳。其他樹種組織培養(yǎng)也得到一致的結(jié)論[5-7]，即細(xì)胞分裂素和生長素濃度配比對保證較高增殖倍數(shù)和較好質(zhì)量嫩芽極其重要，細(xì)胞分裂素濃度過高時(shí)增殖倍數(shù)較高，但芽長勢下降，愈傷褐化玻璃化程度加劇，有效芽減少，配比適宜時(shí)效果最佳。

在生根培養(yǎng)試驗(yàn)中，處理B最佳，接種4 d后芽基部開始形成根原基突起，5～8 d后出現(xiàn)小根，10～15 d長出發(fā)達(dá)的根系。在良好的光照條件下，根系莖葉發(fā)達(dá)健壯，苗木木質(zhì)化程度好，25 d后移栽成活率可達(dá)95%，這與其他研究結(jié)果一致[8-10]。在工廠化生產(chǎn)中，為了抑制培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象，可適當(dāng)加入抗壞血酸(0.01～0.02 mg/L為宜)和活性炭(40 mg/L為宜)，加入過少無法抑制褐化，加入過量則容易影響到pH調(diào)控和培養(yǎng)基固化。

外植體誘導(dǎo)、無菌體系以及工業(yè)化生產(chǎn)模式的建立，是一個(gè)復(fù)雜艱難的過程，隨著技術(shù)瓶頸的突破和工業(yè)城市的進(jìn)展，如何加快誘導(dǎo)速度、縮短培養(yǎng)周期、降低生產(chǎn)成本和選育推廣優(yōu)良品系等都成為亟待解決的問題，有待于更多的試驗(yàn)研究和應(yīng)用推廣。

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作者簡介盧開成(1972- )，男，廣西那坡人，工程師，從事植物組織培養(yǎng)研究。

收稿日期2016-04-10

中圖分類號S 722.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-133-03

Rapid Propagation Technology ofEucalyptusgrandis×E.urophyllaDH32-26

LU Kai-cheng

(Guangxi Paiyangshan State Forest Farm,Ningming,Guangxi 532500)

Abstract[Objective] To research the rapid propagation technology of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26,and to provide references for the large-scale production. [Method] Half lignification ger mination stem section of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26was used as the research material. By using the means of tissue culture,we carried out explant induction and sterile tissue culture system in order. [Result] The optimal explant induction medium was improved MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L,with the ger mination rate being more than 92.3%. The optimal proliferation medium was improved MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L,with number of bud proliferates was 3.7. The best medium that the root induce was improved 1/2 MS + IBA 0.2 mg/L+ABT 0.3 mg/L,the rooting rate was 98.3%. [Conclusion] This research obtains the optimal culture mediums and cultivation conditions of initial induction,proliferation and rooting of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26,so as to preli minarily meet the requirements of industrialized production.

Key wordsEucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26; Explant; Tissue culture