不同晶相的草酸鈣晶體引起腎上皮細(xì)胞的毒性差異

孫新園　姚秀瓊　余　凱　歐陽健明（暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州　510632）

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不同晶相的草酸鈣晶體引起腎上皮細(xì)胞的毒性差異

孫新園姚秀瓊余凱歐陽健明＊
（暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州510632）

摘要：采用掃描電子顯微鏡（SEM）、激光共聚焦顯微鏡（LSM）、流式細(xì)胞儀、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）等方法比較研究了尺寸約1.2 μm的一水草酸鈣（COM）和二水草酸鈣（COD）晶體對非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（Vero細(xì)胞）的損傷差異。COM和COD均能引起Vero細(xì)胞的細(xì)胞活力和超氧化物歧化酶（SOD）活力降低、丙二醛（MDA）含量升高以及碘化丙啶（PI）紅染細(xì)胞數(shù)目增多，且均呈現(xiàn)濃度依賴性。在相同晶體濃度時，COM的細(xì)胞毒性明顯比COD強(qiáng)，引起細(xì)胞表面表達(dá)的粘附分子透明質(zhì)酸（HA）比COD多，粘附量也顯著增加。相比于COM晶體，Vero細(xì)胞更容易內(nèi)吞COD晶體。COM與COD晶體對腎上皮細(xì)胞的毒性差異與晶面的離子密度以及細(xì)胞與晶體間的靜電作用等因素密切相關(guān)。本文結(jié)果將有助于從分子水平上和細(xì)胞水平上闡釋草酸鈣結(jié)石的形成機(jī)理。

關(guān)鍵詞：一水草酸鈣；二水草酸鈣；細(xì)胞毒性；濃度效應(yīng)

國家自然科學(xué)基金（No.21371077）資助項目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：toyjm@jnu.edu.cn

0　引言

腎結(jié)石是一種臨床常見的多發(fā)病，腎中結(jié)石的主要組分為草酸鈣（CaOx）［1］，其中一水草酸鈣（COM）的發(fā)生率約是二水草酸鈣（COD）的2倍［2］。COD結(jié)石與高鈣尿［3-4］，低枸櫞酸水平［5］和高pH值［6］有密切的聯(lián)系，而COM結(jié)石經(jīng)常出現(xiàn)在正常尿鈣情況下［7］。

晶體粘附是導(dǎo)致腎結(jié)石形成的重要原因之一［8-9］。研究表明，尿微晶通過腎臟的時間只有5～10 min，在滯留時間內(nèi)，晶體通過生長不足以達(dá)到足夠大的尺寸來堵塞管道。晶體的聚集是導(dǎo)致尿微晶尺寸迅速增大的重要原因［10-11］。細(xì)胞損傷不但會增加尿微晶在細(xì)胞表面的粘附［12-13］，而且能夠促進(jìn)尿微晶在損傷細(xì)胞表面的聚集［14］。研究表明，結(jié)石患者尿液中的COM含量常常高于健康對照者，而COD含量則低于對照者［15］，尿液中存在的這種組分差異的原因還不甚明了。前期我們研究了尺寸分別為50、100 nm，1、3和10 μm的COM和COD晶體對非離子表面活性劑（NP-40）的吸附［16］，表明晶體尺寸越小，比表面積越大，對NP-40的吸附量越大；相同尺寸的晶體，COM的吸附量大于COD。

但草酸鈣晶相不同導(dǎo)致的與腎小管上皮細(xì)胞間作用機(jī)制的差異還有待研究?；诖?，本文比較研究了尺寸約1.2 μm的COM和COD晶體對非洲綠猴腎上皮細(xì)胞（Vero細(xì)胞）的損傷差異及其被細(xì)胞粘附和內(nèi)吞的差異，期望從細(xì)胞和分子水平上闡述尿液中不同晶相草酸鈣晶體對腎上皮細(xì)胞損傷的機(jī)理，為抑制腎結(jié)石形成提供新的啟示。

1　實(shí)驗部分

1.1材料和儀器

非洲綠猴腎上皮細(xì)胞 （Vero細(xì)胞）（暨南大學(xué)生物制藥基地）；DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，海克隆生物化學(xué)制品（北京）有限公司）。細(xì)胞增生分析試劑盒（CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。碘化丙啶（PI）、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、牛血清白蛋白（BSA）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；生物素化的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（bHABP，MERCK公司），異硫氰酸熒光素-親和素（FITC-Avidin，武漢博士德生物工程有限公司），12、24和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST，中國）。青霉素、鏈霉素（北京普博生物技術(shù)有限公司）。

XL-30型環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM，Phillp公司，荷蘭），樣品噴金處理，測量電壓為15～20 kV日本理學(xué)D/max 2400 （Rigaku）X射線衍射儀，Cu靶，Kα射線（λ=0.154 08 nm），石墨單色器，40 kV，30 mA，掃描范圍5°～55°。激光共聚焦顯微鏡（LSM510 META DUO SCAN，ZEISS，德國）。倒置熒光顯微鏡（IX51）（日本奧林巴斯公司）。酶標(biāo)儀（safireZ，Tecan瑞士）。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）。

1.2晶體的合成及其懸浮液配制

COM、COD晶體的合成及表征參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行其尺寸均分別約為1.2 μm。

CaOx晶體懸浮液配制：先將稱好的晶體鋪平照紫外40 min除菌；然后把COM、COD晶體分別分散在一定體積的無血清培養(yǎng)液中，配制成400 μg· mL-1的晶體懸浮液，超聲5 min后再依次稀釋成50、100和200 μg·mL-1，備用。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

Vero細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代采用胰蛋白酶消化法。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合后用PBS緩沖液洗滌2次，加入0.25%胰酶-EDTA消化液，置37℃培養(yǎng)箱消化3～5 min，消化適度后，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，充分吹打分散細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液。

1.4細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞按濃度為1.0×105cells·mL-1、100 μL每孔接種于96孔培養(yǎng)板中孵育24 h。實(shí)驗?zāi)Ｐ头譃?組：（A）Vero細(xì)胞對照組：不加任何試劑。（B）COM晶體處理組：加入分別含50、100、200和400 μg· mL-1的COM晶體的無血清培養(yǎng)液，孵育6 h；（C COD晶體處理組：加入分別含50、100、200和400 μg·mL-1的COD晶體的無血清培養(yǎng)液，孵育6 h。達(dá)到粘附時間后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，于37℃下孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度（A），各個條件下的Vero細(xì)胞平行測定3個復(fù)孔求A值的平均值。

1.5超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量檢測

細(xì)胞按濃度1.0×105mL-1、500 μL每孔接種于24孔培養(yǎng)板，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液孵育24 h后，改用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育12 h同步化。實(shí)驗?zāi)Ｐ头纸M情況與細(xì)胞活力檢測相同。達(dá)到作用時間后，取上清液，按SOD試劑盒和MDA試劑盒的說明書分別測定SOD活性和MDA含量。

1.6碘化丙啶（PI）染色檢測

細(xì)胞按濃度1.0×105mL-1、100 μL每孔接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞同步化后，按照上述實(shí)驗方法分組。達(dá)到作用時間后，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入4 μmol·L-1PI溶液，37℃孵育10 min；再用PBS洗滌3次，最后每孔加入100 μL PBS，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。當(dāng)細(xì)胞核被染成紅色時說明細(xì)胞已處于中晚期凋亡或壞死狀態(tài)。

PI定量分析：在未進(jìn)行熒光顯微鏡拍照之前，采用酶標(biāo)儀測定PI的熒光強(qiáng)度。

1.7透明質(zhì)酸（HA）表達(dá)觀察及熒光強(qiáng)度的定量分析

細(xì)胞按濃度1.0×105mL-1、1 mL每孔接種于12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞同步化后，按照上述實(shí)驗方法分組。COM和COD晶體濃度分別為100、200和400 μg· mL-1。達(dá)到作用時間后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，接著用固定液 （由5%冰醋酸、10%福爾馬林和70%酒精組成）固定細(xì)胞20 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min，再加入100 μL 5 μg·mL-1的bHABP溶液（配制在3%牛血清白蛋白溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配），4℃條件下孵育過夜；之后用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；再加入100 μL異硫氰酸熒光素-親和素（FITC-avidin）染色1 h，用PBS洗滌3次，每次5 min，加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液復(fù)染4 min，用PBS洗滌3次，每次5 min；最后用抗淬滅劑封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞表面表達(dá)透明質(zhì)酸的地方為綠色，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色為藍(lán)色。

HA定量分析：HA的熒光強(qiáng)度由儀器附帶的Axiovision軟件（ZEISS，德國）分析，每個樣品對100個細(xì)胞的HA進(jìn)行定量檢測，取平均值。

1.8掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

細(xì)胞種板密度和實(shí)驗分組與HA檢測相同。達(dá)到粘附時間后，吸除上清液，用PBS洗滌3次，2.5%的戊二醛于4℃固定24 h后，用1%OsO4固定，接著用PBS洗滌3次，梯度乙醇（30%、50%、70%、90% 和100%）脫水，最后用乙酸異戊酯固定，固定后的細(xì)胞采用CO2臨界干燥，噴金包被。在SEM下觀察晶體粘附和內(nèi)吞情況。

1.9晶體的粘附量測定

細(xì)胞種板密度和實(shí)驗分組與HA檢測相同，COM和COD晶體濃度分別為50、100、200和400 μg·mL-1。在4℃下作用6 h后，吸除上清液，取出玻片；用PBS洗滌玻片3次，洗去未粘附的晶體；將玻片置于25 mL燒杯中，加入10 mL濃HNO3和1.0 mL HClO4，在電爐上消化至澄清，繼續(xù)加熱至HClO4冒煙，蒸至近干時停止加熱，利用余熱把溶液蒸干，冷卻，加3 mL超純水，混勻待測，同時準(zhǔn)備空白組（即10 mL濃HNO3和1.0 mL HClO4的混合溶液），利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）測定鈣離子的濃度，然后換算成CaOx晶體的粘附量。

2　結(jié)果

2.1草酸鈣晶體的合成與表征

圖1為制備的COM、COD晶體的SEM照片及XRD圖。由于人體內(nèi)產(chǎn)生的草酸鈣晶體多為不規(guī)則的形貌，因此我們未添加其他的添加劑調(diào)控晶體的形貌，從而更好的模擬尿微晶與腎小管上皮細(xì)胞間的作用。所合成的COM晶體主要為六邊形，也存在部分不規(guī)則形貌，其粒徑為（1.2±0.5）μm（圖1a）。在XRD圖中（圖1c），檢測到晶面間距d=0.595、0.365、0.298和0.236 nm的衍射峰，分別歸屬于COM晶體的（101）、（020）、（202）和（130）晶面。COD晶體主要呈四角雙錐形貌及聚集體形貌，粒徑為（1.2±0.4）μm（圖1b）。在XRD圖中 （圖1d），檢測到d=0.618、0.442、0.278和0.224 nm等處分別歸屬于COD晶體（200）、（211）、（411）和（213）晶面的特征吸收峰，表明所合成的晶體均為純相的COM或COD晶體。

2.2細(xì)胞活力、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量變化

圖2a為Vero細(xì)胞與不同濃度的COM、COD作用后的細(xì)胞活力變化。可以看出，COM對Vero細(xì)胞具有明顯的毒性，并呈現(xiàn)濃度依賴性。隨著COM濃度從0 μg·mL-1增加到400 μg·mL-1，細(xì)胞活力從對照組的100%降低到（46.0±3.35）%。相比之下，COD 對Vero細(xì)胞的毒性明顯小于COM晶體，即使?jié)舛葹?00 μg·mL-1的COD與Vero細(xì)胞孵育6 h后，其活力僅降至（91.0±2.33）%。

圖1　COM、COD的SEM圖像（a，b）和XRD圖（c，d）Fig.1　SEM images（a，b）and XRD patterns（c，d）of COM and COD crystals

圖2　Vero細(xì)胞與COM、COD粘附6 h后細(xì)胞生化指標(biāo)變化Fig.2　Changes of biochemical indicators in Vero cells after exposure to COM and COD crystals for 6 h

SOD是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的抗氧化酶，對機(jī)體內(nèi)的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。生物體內(nèi)SOD活性的的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力［17］。從圖2b可見，Vero細(xì)胞粘附COM后SOD活力隨著晶體濃度的增加而顯著下降，說明COM的濃度越高，對細(xì)胞的損傷越大。而Vero細(xì)胞粘附COD后SOD活力降低不顯著。

與SOD一樣，MDA也是反映細(xì)胞損傷程度的一項重要的生化指標(biāo)。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量變化可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度［18］。Vero細(xì)胞粘附COM后，MDA含量隨著晶體濃度的增加而逐步升高（圖2c）；而Vero細(xì)胞粘附COD后MDA含量增加很緩慢，說明COM晶體對細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷較大，而COD晶體較小。

圖2中3個生化指標(biāo)的檢測結(jié)果表明，COM對細(xì)胞造成過氧化損傷顯著大于COD。有文獻(xiàn)表明COM晶體作用于腎上皮細(xì)胞將誘發(fā)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS可以介導(dǎo)一系列炎癥的發(fā)生，激活許多信號分子如p38細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）、蛋白N-末端激酶 （JNKp）和轉(zhuǎn)錄因子NF-кB等［19］。這些物質(zhì)可以導(dǎo)致基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)和上調(diào)，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和損傷分子KIM-1［20］，一系列的級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞功能大大受損，造成細(xì)胞死亡。

2.3Vero細(xì)胞與COM、COD粘附后經(jīng)碘化丙啶（PI）染色的結(jié)果

PI是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑，在綠色光（540 nm）的激發(fā)下會發(fā)出明亮的紅色熒光（600 nm）。PI不能透過正常細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，但是能透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。與DNA結(jié)合的PI發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)度是未結(jié)合PI的20～30倍。被染色的細(xì)胞核越多，說明細(xì)胞的死亡率越高［21］。

Vero細(xì)胞與COM，COD晶體粘附后經(jīng)PI染色的結(jié)果如圖3所示。隨著COM濃度增大，被PI染色的細(xì)胞核越來越多（圖3a～d），說明COM對細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷后，導(dǎo)致了Vero細(xì)胞的死亡率增大。由于對照組細(xì)胞被PI染色的很少，故沒有給出其熒光顯微鏡圖片。而COD晶體濃度增大后引起的紅染細(xì)胞核數(shù)量遠(yuǎn)比COM的少（圖3e～h）。說明COM 對Vero細(xì)胞的致死率大于COD晶體。此結(jié)果與細(xì)胞損傷后的生化指標(biāo)檢測結(jié)果（圖2）一致。

圖3　Vero細(xì)胞與不同濃度的COM、COD粘附6 h后PI染色結(jié)果Fig.3　Fluorescence images of Vero cells stained by PI after incubating with COM and COD with different concentrations for 6 h

2.4Vero細(xì)胞與COM、COD粘附后透明質(zhì)酸（HA）表達(dá)量變化

透明質(zhì)酸（HA）是一種細(xì)胞膜表面的主要粘附分子之一［22］，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，細(xì)胞表面表達(dá)的HA越多。圖4為激光共聚焦顯微鏡觀察的Vero細(xì)胞與COM、COD粘附后的HA表達(dá)情況。與100 μg· mL-1的COM晶體粘附6 h后，Vero細(xì)胞周圍呈現(xiàn)明顯的綠色熒光；綠色熒光隨著晶體濃度的增加而增強(qiáng)，尤其是當(dāng)濃度為400 μg·mL-1時，Vero細(xì)胞周圍出現(xiàn)明亮的綠色熒光，強(qiáng)度為971±27，表明此時表達(dá)了大量的HA分子。然而，Vero細(xì)胞與低濃度的COD粘附后的綠色熒光很弱，只有在晶體濃度400 μg·mL-1時，才出現(xiàn)明顯的綠色熒光，但比相同濃度的COM晶體的弱。

上述結(jié)果表明，COM、COD與Vero細(xì)胞作用后，都可以誘導(dǎo)粘附分子HA的表達(dá)，其表達(dá)量均呈現(xiàn)濃度依賴性；且相同濃度下，COM處理組中細(xì)胞表面表達(dá)的HA的量明顯高于COD處理組，因此COM損傷后的細(xì)胞更容易粘附更多的晶體，形成結(jié)石的風(fēng)險更大。

圖4　Vero細(xì)胞與不同濃度COM、COD粘附后透明質(zhì)酸（HA）的表達(dá)Fig.4　Hyaluronan（HA）expression in Vero cells after exposure to COM and COD crystals with different concentrations

圖5　Vero細(xì)胞與不同濃度COM晶體粘附的SEM照片F(xiàn)ig.5　SEM images of Vero cells after exposure to different concentrations of COM crystals

2.5Vero細(xì)胞與COM、COD粘附后的SEM觀察

在低濃度（100 μg·mL-1）時，COM晶體處理組中就有較多的晶體粘附在Vero細(xì)胞的表面（圖5a），同時，細(xì)胞的微絨毛也粘附有COM晶體（圖5a中箭頭所示）。隨著晶體濃度的增大，不但粘附量逐漸增加，而且晶體的聚集程度也逐漸增加（圖5b，5c）。

相比之下，Vero細(xì)胞與COD的粘附量要小得多。低濃度時（100 μg·mL-1）時，粘附的COD晶體較少且?guī)缀醪痪奂?。隨著COD晶體濃度的增加，粘附的晶體數(shù)量有所增大 （圖6b）；當(dāng)濃度升高到400 μg·mL-1時，粘附的COD晶體也會發(fā)生聚集，但只是多個小晶體松散的堆積在一起（圖6c中白色箭頭所示）。同時可以明顯的觀察到Vero細(xì)胞對COD晶體的內(nèi)吞（圖6b，7b），而在COM晶體與細(xì)胞作用時，內(nèi)吞現(xiàn)象不明顯（圖7a）。

圖6　Vero細(xì)胞與不同濃度COD晶體粘附的SEM照片F(xiàn)ig.6　SEM images of Vero cells after exposure to different concentrations of COD crystals

圖7　Vero細(xì)胞對COM（a）和COD b）晶體內(nèi)吞的觀察Fig.7　SEM observation of COM（a）and COD（b）endocytosis by Vero cells

圖8　ICP法測定不同濃度COM，COD晶體在Vero細(xì)胞表面的粘附量Fig.8　Quantitative analysis of adhesion amount of COM and COD with different concentrations to Vero cells using ICP-AES method

2.6COM、COD的粘附量測定

Vero細(xì)胞內(nèi)吞COM和COD晶體為主動運(yùn)輸?shù)倪^程，而在4℃的環(huán)境下晶體的內(nèi)吞過程會受到抑制。為了證實(shí)SEM觀察的Vero細(xì)胞與COM、COD晶體粘附量的差異，在4℃的條件下，我們采用ICP檢測了不同濃度的COM和COD晶體在細(xì)胞表面的粘附量（圖8）。當(dāng)晶體濃度從50 μg·mL-1增加到100、200和400 μg·mL-1，細(xì)胞表面粘附的COM從（35.5±5.5）μg·cm-2持續(xù)增加到（48.6±11.6）、（74.3± 22.7）、（109.9±11.4）μg·cm-2。而 COD的粘附量從（22.9±2.3）μg·cm-2依次增加到 （31.3±6.8）、（34.7± 9.1）、（40.0±6.8）μg·cm-2。由此可見，在相同晶體濃度時，COM晶體在Vero細(xì)胞表面的粘附量均比COD晶體的高，尤其在400 μg·mL-1時，兩者粘附量的差值達(dá)69.9 μg·cm-2。

3　討論

為了比較COM和COD兩種晶相的晶體與腎小管上皮細(xì)胞間的作用機(jī)制的差異，我們通過CCK-8 和PI染色的方法對細(xì)胞的活力進(jìn)行了分析；通過SOD和MDA含量變化對細(xì)胞的氧化損傷進(jìn)行了評估；并通過SEM和ICP方法觀察和檢測了晶體粘附和內(nèi)吞的差異。COM和COD晶體都可以誘導(dǎo)Vero細(xì)胞的損傷，且呈現(xiàn)濃度依賴性。在相同晶體濃度下，COM晶體表現(xiàn)出比COD晶體更高的細(xì)胞毒性，且COM晶體更容易粘附和聚集在細(xì)胞的表面。

3.1COM的細(xì)胞毒性顯著大于COD

相同濃度下，COM晶體表現(xiàn)出了明顯高于COD晶體的細(xì)胞毒性，尤其是高濃度的COM晶體不僅會造成細(xì)胞的過氧化損傷，引起SOD活性的顯著降低和MDA含量的明顯升高（圖2b，2c），同時還嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞的死亡 （圖3）。高濃度的COM晶體更容易產(chǎn)生聚集（圖5），晶體的聚集會加重對腎上皮細(xì)胞產(chǎn)生的損傷作用。有研究者通過觀察草酸鈣結(jié)石病人的病理組織切片，發(fā)現(xiàn)靠近鈣化和聚集晶體的區(qū)域的上皮細(xì)胞均明顯遭到破壞［23］。而COD晶體造成的細(xì)胞損傷明顯減弱，導(dǎo)致的細(xì)胞死亡率較小［24］。

由于COM和COD晶相的不同，兩種晶體在晶體結(jié)構(gòu)、晶面性質(zhì)以及結(jié)晶水含量等方面都存在差異，這就導(dǎo)致它們表現(xiàn)出的細(xì)胞的毒性存在明顯的不同。有研究表明，COM和COD晶體的主要晶面（圖9）與羧基的粘附力大小呈現(xiàn)以下規(guī)律：COM（101）＞COD（100）＞COM（010）＞COD（101）［25］，歸因于這4個晶面的鈣離子密度依次降低：COM的（101）和（010）晶面分別有5.42和3.33個Ca2+/nm2；COD的（100）和（101）晶面則分別有4.39和2.25個Ca2+/nm2［26］。這種晶面性質(zhì)的不同可能是導(dǎo)致COM和COD晶體的細(xì)胞毒性存在差異的主要原因，這為COM和COD的病理行為及它們各自晶面的粘附強(qiáng)度之間建立了一個重要的聯(lián)系。COM的最主要晶面（101）面與腎上皮細(xì)胞間的粘附力最強(qiáng)，導(dǎo)致在細(xì)胞表面的大量粘附和聚集，加劇了結(jié)石形成的風(fēng)險。對于COD晶體，其粘附力最強(qiáng)的（100）晶面面積較小，而粘附力最弱（101）晶面面積最大，因此COD晶體與細(xì)胞作用時的總的粘附力下降，導(dǎo)致COD與細(xì)胞膜間的粘附不牢固，形成的聚集體不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易被腎小管中的尿液沖走，從而降低了結(jié)石形成的風(fēng)險［26-27］。

圖9　微米級COM、COD的晶體結(jié)構(gòu)模型圖Fig.9　Model diagram of crystal structure of micron-grade COM and COD

3.2Vero細(xì)胞內(nèi)吞COM、COD晶體存在差異

SEM結(jié)果可以明顯的觀察到細(xì)胞對COD晶體的內(nèi)吞（圖6b，7b），而這種現(xiàn)象在COM晶體處理組中不明顯。細(xì)胞的內(nèi)吞作用是機(jī)體自我保護(hù)的一種機(jī)制，以去除表面潛在的粘附和聚集位點(diǎn)。內(nèi)吞的晶體會在細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中緩慢溶解，而不再暴露在過飽和的腎管流體中作為晶體聚集的一個位點(diǎn)［28］。細(xì)胞對COM晶體的內(nèi)吞作用弱于COD晶體這可能是因為COM的粘附對細(xì)胞產(chǎn)生較嚴(yán)重的過氧化損傷（圖2b，2c），細(xì)胞膜破裂（圖3），導(dǎo)致細(xì)胞正常的內(nèi)吞功能也受到損害。COM晶體也可能影響了內(nèi)吞相關(guān)蛋白如CLC-5的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)吞作用減弱，細(xì)胞清除晶體的能力降低，從而削弱了細(xì)胞膜表面抗晶體粘附和聚集的能力［29］。

4　結(jié)論

不同晶相的COM和COD晶體都能引起Ver細(xì)胞的細(xì)胞活力和SOD活性降低、MDA含量升高以及PI紅染細(xì)胞數(shù)目增多，且均呈濃度依賴性。在相同晶體濃度時，COM的毒性和損傷作用明顯比COD強(qiáng)，使得Vero細(xì)胞表達(dá)的粘附分子HA比COD多，更易引起晶體在細(xì)胞表面的聚集。同時Vero細(xì)胞內(nèi)吞COD晶體的能力比COM強(qiáng)，進(jìn)一步減弱了COD對細(xì)胞的損傷作用。尿液中COM和COD晶體的大量產(chǎn)生都會引起腎上皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致晶體在細(xì)胞表面的粘附和聚集。而相同濃度下，COD晶體的產(chǎn)生會極大地減弱晶體對腎臟的損傷，降低結(jié)石形成的風(fēng)險。探索抑制COM晶體形成而促進(jìn)COD晶體形成的藥物可能是降低結(jié)石風(fēng)險的重要途徑。本文對不同晶相、不同濃度的草酸鈣晶體作用于腎上皮細(xì)胞時毒性差異的研究，將會為腎結(jié)石的預(yù)防和治療提供一定的啟示。

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中圖分類號：R69；R329.2+8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-4861（2016）05-0818-09

DOI：10.11862/CJIC.2016.097

收稿日期：2016-01-14。收修改稿日期：2016-03-04。

Toxicity Difference of Calcium Oxalate of Different Crystal Phases on Renal Epithelial Cells

SUN Xin-YuanYAO Xiu-QiongYU KaiOUYANG Jian-Ming＊
（Institute of Biomineralization and Lithiasis Research，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Abstract：Scanning electron microscope（SEM），laser confocal microscope（LSM），flow cytometry，inductively coupled plasma emission spectrometer（ICP）methods were used to comparatively study the cell injury differences on the African green monkey kidney epithelial（Vero）cells by calcium oxalate monohydrate（COM）and dihydrate （COD）crystals with a size about 1.2 μm.Both COM and COD could decrease the cell viability and superoxide dismutase（SOD）activity，increase malondialdehyde（MDA）content and the number of red dye cells staining with propidium iodide（PI）in a dose-dependent manners.Compared to COD crystals，COM crystals induced significantly higher toxicity under the same crystal concentration，and COM crystals caused more adhesion molecules hyaluronic acid（HA）expression and higher adhesion amount than COD crystals.The ability of the Vero cells to endocytose COD crystal was stronger than that of COM.The cytotoxicity difference between COM and COD was closely related to ion density of crystal face and electrostatic interactions between the cell and crystals.The results in this paper can help to explain the formation mechanism of calcium oxalate stones at the molecular level and cellular level.

Keywords：calcium oxalate monohydrate；calcium oxalate dihydrate；cytotoxicity；concentration effect