經(jīng)皮電刺激夾脊穴對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及炎癥反應的影響

陳春梅

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經(jīng)皮電刺激夾脊穴對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及炎癥反應的影響

陳春梅

［摘要］目的觀察經(jīng)皮電刺激對脊髓損傷后大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、核因子-κB（NF-κB）及白細胞介素-6（IL-6）表達的影響。方法90只健康成年Sprague-Dawley大鼠分為正常對照組（A組，n=30）、經(jīng)皮電刺激組（B組，n=30）和對照組（C組，n=30）。采用Allen法復制大鼠T9急性脊髓損傷模型，于術(shù)后1d、3d和7d對各組大鼠行后肢運動功能BBB評分和斜板試驗；免疫組織化學染色檢測脊髓GFAP、NF-κB及IL-6的表達。結(jié)果術(shù)后3d、7d，B組大鼠BBB評分和斜板試驗成績均明顯優(yōu)于C組（t＞3.349，P＜0.01）。術(shù)后各時間點，B組GFAP、NF-κB及IL-6表達均顯著低于C組（t＞20.815，P＜0.001）。結(jié)論經(jīng)皮電刺激可有效抑制炎癥反應，抑制脊髓損傷后大鼠脊髓組織GFAP的表達，從而促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復。

［關(guān)鍵詞］脊髓損傷；經(jīng)皮電刺激；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；核因子-кB；白細胞介素-6；大鼠

［本文著錄格式］陳春梅.經(jīng)皮電刺激夾脊穴對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及炎癥反應的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（6）：660-666.

CITED AS：Chen CM.Effect of transcutaneous electrical stimulation on Jiaji acupoint on expression of glial fibrillary acidic protein and inflammation in rats after spinal cord injury［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（6）：660-666.

急性脊髓損傷（spinal cord injury）是臨床上常見的嚴重創(chuàng)傷類型，發(fā)生率隨交通事故的增加有逐年上升的趨勢，且具有高致殘率、低死亡率、高治療費用等特點，給社會和個人造成沉重負擔。脊髓損傷后病理生理改變分為原發(fā)性的機械損傷及由此引發(fā)的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷被認為是瞬間發(fā)生的，是急性期的不可逆的反應；繼發(fā)性損傷則是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生的，是漸進性的，被認為是可以逆轉(zhuǎn)的。繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，由于繼發(fā)性水腫、炎癥反應、局部缺血，細胞因子、生長因子及過氧化基因異常變化等對脊髓產(chǎn)生的毒害作用［1］。

現(xiàn)代研究認為，治療脊髓損傷的關(guān)鍵在于繼發(fā)性損傷的治療，在脊髓損傷后早期及時地應用有效的治療措施，減少繼發(fā)性損傷，能夠有效促進損傷脊髓的功能恢復［2-3］。脊髓損傷后，膠質(zhì)細胞大量增生，膠質(zhì)瘢痕形成與炎癥反應增強是加重神經(jīng)損傷和功能障礙的主要原因。電刺激在脊髓功能恢復中具有一定的促進作用，但電刺激對脊髓損傷后炎癥反應和膠質(zhì)瘢痕形成的影響報道較少。

本實驗探討經(jīng)皮電刺激對大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、核因子-κB（nuclear factor Kappa B，NF-κB）及白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）表達的影響，進而探究經(jīng)皮電刺激對脊髓損傷后早期中樞神經(jīng)功能恢復的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級健康成年Sprague-Dawley大鼠90只，雌雄不拘，體質(zhì)量（230±20）g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按照隨機數(shù)字表隨機分為正常對照組（A組，n=30）、經(jīng)皮電刺激組（B組，n=30）和對照組（C組，n=30）。各組再分為1d、3d、7d 3個亞組，每個亞組10只。

1.2試劑和儀器

戊巴比妥鈉（德國進口分裝）：北京化學試劑公司。兔抗鼠NF-κB多克隆抗體、兔IgG兩步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。兔抗鼠IL-6多克隆抗體、兔抗鼠GFAP多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。BX53F正置熒光顯微鏡（SN：IE38873）：日本奧林巴斯公司。Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件：USA Media Cybernetics。SZD-Ⅱ型電子針療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。自制數(shù)字式脊髓損傷動物模型制備儀。

1.3模型制備

A組不做任何處理。B組、C組大鼠術(shù)前常規(guī)行行為學測試，確認其運動功能正常后，用1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠俯臥固定于手術(shù)臺上，背部去毛，碘伏常規(guī)消毒。以T9為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，沿緊靠棘突的兩邊切開背部肌肉，去除椎板，暴露脊髓，采用Allen法，用自制數(shù)字式脊髓損傷動物模型制備儀打擊制備脊髓損傷模型，打擊強度為10g×25mm。打擊后即刻見大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽搐，尾部甩動，隨后完全松弛，標志模型制備成功?？p合傷口。術(shù)后獨籠飼養(yǎng)；協(xié)助大鼠排尿，每天早晚各1次，至排尿反射恢復。每天注射青霉素1ml和生理鹽水2ml，抗菌和補充體液，持續(xù)至大鼠取材為止。在此期間注意觀察皮膚有無壓瘡或感染，下肢有無潰爛。

1.4經(jīng)皮電刺激干預

B組大鼠均采用固定狀態(tài)下電刺激，于術(shù)后6h開始治療，將大鼠俯臥，四肢及頭部固定于自制鼠板上，行經(jīng)皮電刺激20min，每天1次。正極接T7雙側(cè)夾脊穴位置的皮膚，負極接T11雙側(cè)夾脊穴位置的皮膚。參數(shù)設(shè)置：連續(xù)波脈沖電流，電流強度以背部肌肉輕微抖動為宜，刺激頻率50Hz。

C組同樣固定于和經(jīng)皮電刺激組相同的固定裝置上，時間點與B組相同，但不予電刺激。

A組不做任何處理。

1.5運動功能評定

于造模后1d、3d、7d，各組進行以下測試。

1.5.1BBB（Basso-Beattie-Bresnahan）評分［4］

大鼠置寬大活動場地，采用雙人盲法觀察其后肢運動情況，聯(lián)合考察大鼠后肢的運動，軀干的位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置。取左右兩側(cè)評分的平均值作為最后評分。

1.5.2斜板試驗［5］

大鼠置自制斜板上，墊一橡膠墊，將大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行，大鼠頭朝斜板抬高側(cè)，斜板傾斜角度從0°開始緩慢上升。記錄大鼠停留在斜板上維持至少5s時的最大角度，每次測試3遍，取平均值。采用雙人盲法。

1.6組織取材與切片制備

各組各取10只大鼠，于運動功能評測后，以1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。打開胸腔，充分暴露心臟和主動脈根部。從左心室插管到主動脈根部，剪開右心耳，經(jīng)左心室快速灌注肝素生理鹽水約200ml，至肝臟及鞏膜蒼白。4%多聚甲醛150～200ml灌注40min。以損傷處為中心切取脊髓組織約1cm，4%多聚甲醛固定24h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)橫切，厚5 μm，用于免疫組織化學染色。

1.7免疫組織化學染色

非生物素二步法進行GFAP、NF-κB及IL-6免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，行高壓熱抗原修復，用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加GFAP抗體（1：500）、NF-κB一抗（1：200）和IL-6一抗（1：100），4℃冰箱過夜。次日用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60min，在切片上加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應，顯色充分，及時用0.01mol/L PBS漂洗；蘇木素復染，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每張切片在顯微鏡400倍下隨機拍攝5個不重復的視野，采用Image- Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件測定每個視野中累積光密度和其分布面積，計算平均積分光密度值。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結(jié)果

2.1運動功能評定

A組大鼠BBB評分為21分。B組3d和7d BBB評分均明顯高于1d（P＜0.01），且7d明顯高于3d（P＜0.01）。C組1d和3d BBB評分無顯著性差異（P＞0.05），7d評分明顯高于1d和3d。術(shù)后各時間點B組和C組低于A組。術(shù)后1d，兩組評分無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后3d、7d，B組評分顯著高于C組（P＜0.01）。見表1。

表1　兩組大鼠BBB評分比較

A組斜板試驗角度為（66.10±1.12）°。B組斜板試驗角度術(shù)后3d和7d均顯著大于1d（P＜0.001）。C組斜板試驗角度各時間點無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后各時間點B組和C組低于A組。術(shù)后1d，B組與C組斜板試驗角度無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后3d、7d，B組角度明顯大于C組（P＜0.01）。見表2。

表2　兩組大鼠斜板試驗比較（°）

2.2GFAP表達

免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，損傷處星形膠質(zhì)細胞呈局灶性增生，胞質(zhì)豐富且染色加深，體積增大，細胞形態(tài)不一，突起增多，隨著損傷后時間延長，細胞數(shù)目增多。脊髓損傷區(qū)GFAP的表達在A組可見少許（圖1）；在B組表達較少，分布比較均勻；在C組大部分為空洞，空洞周圍有強的GFAP表達，分布相對不均勻（圖2）。脊髓損傷1d后星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的GFAP表達明顯增高，1～7d內(nèi)呈現(xiàn)進行性增高趨勢（P＜0.01）。脊髓損傷后1d、3d、7d，B組和C組表達明顯高于A組（0.77±0.0.04）。B組脊髓損傷后1d、3d、7d內(nèi)損傷處GFAP表達顯著少于C組（P＜0.001）。見表3。

表3　兩組大鼠脊髓組織GFAP比較（IOD）

2.3IL-6表達

A組可見少量陽性表達（0.24±0.08）；各時間點B組和C組IL-6均高于A組。脊髓損傷后1d，B組、C 組IL-6表達增高，C組顯著高于B組（P＜0.001）；3d時B組、C組IL-6表達達高峰（P＜0.001），C組顯著高于B組（P＜0.001）；C組3d后逐漸下降，至7d時C組仍顯著高于B組（P＜0.05）。見表4、圖1、圖3。

表4　兩組大鼠脊髓組織IL-6比較（IOD）

2.4NF-κB表達

A組可見NF-κB少量表達（0.29±0.0.06）。各時間點B組和C組NF-κB表達均高于A組。脊髓損傷后1d，B組、C組NF-κB表達增高，C組顯著高于B組（P＜0.001）；3d時B組、C組NF-κB表達達高峰（P＜0.001），C組顯著高于B組（P＜0.001）；7d與3d比較無顯著性差異（P＞0.05），7d時C組仍顯著高于B組（P＜0.05）。見表5、圖1、圖4。

表5　兩組大鼠脊髓組織NF-κB比較（IOD）

圖1　A組大鼠脊髓組織GFAP、IL-6、NF-κB的表達（免疫組織化學染色，400×）

圖2　B組和C組大鼠脊髓組織GFAP的表達（免疫組織化學染色，400×）

圖3　B組和C組大鼠脊髓組織IL-6的表達（免疫組織化學染色，400×）

圖4　三組大鼠脊髓組織NF-κB的表達（免疫組織化學染色，400×）

3　討論

脊髓的解剖與生理功能同中醫(yī)描述的督脈相似，督脈起于胞中，下出會陰，經(jīng)脊柱正中，直上頸項至頭頂，下達鼻柱到上唇系帶處為止，與任脈相會。因而脊髓損傷的病機為“督脈損傷”。針灸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，用于脊髓損傷歷史悠久。多數(shù)作者認為，給予微電流以產(chǎn)生弱的直流電場持續(xù)刺激，是最佳的促進脊髓再生的方法［6-8］。夾脊電針是在受損脊髓節(jié)段形成“夾脊電場”：針刺穴位調(diào)理督脈，疏通經(jīng)絡(luò)；現(xiàn)代脈沖電療電場促進血管形成和神經(jīng)組織發(fā)育再生。近年發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮電刺激能夠促進內(nèi)源性神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）表達，抑制IL-1α和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α表達，從而促進神經(jīng)功能恢復［9-10］。

GFAP是星形膠質(zhì)細胞的一種標志蛋白，為其主要細胞骨架成分，相對分子質(zhì)量為50～52 kDa，存在于正常星形膠質(zhì)細胞和反應性星形膠質(zhì)細胞中，它在神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的維持和血腦屏障中起重要作用，其表達的高低可反映星形膠質(zhì)細胞的功能狀態(tài)，如星形膠質(zhì)細胞增殖和肥大的程度［11］。當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，星形膠質(zhì)細胞發(fā)生反應性增生，出現(xiàn)GFAP表達上調(diào)。脊髓損傷后膠質(zhì)細胞反應性增生具有雙重作用［12-13］。星形膠質(zhì)細胞一方面能提供特殊的軸突再生促進因子或誘導因子，促進或誘導軸突再生；另一方面也可產(chǎn)生阻礙軸突再生的抑制因子或形成局部瘢痕［14-16］。所以抑制星形膠質(zhì)細胞過度反應性增生，從而抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，將為神經(jīng)元軸突再生和功能的修復提供較好的微環(huán)境。本實驗結(jié)果也提示，脊髓損傷后1～7d內(nèi)GFAP表達呈進行性增高趨勢，且各時間點B組與C組有顯著性差異（P＜0.05），提示經(jīng)皮電刺激能抑制GFAP的表達，抑制星形膠質(zhì)細胞過度反應性增生，從而可能創(chuàng)造有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境，減少膠質(zhì)瘢痕的形成。

NF-κB由p65和p50兩個亞基組成，在靜息狀態(tài)下與抑制因子κB（inhibitor of NF-κB，IκB）結(jié)合為三聚體形式以非活性狀態(tài)存在細胞漿中，細胞外危險信號刺激下激活κB激酶（κB kinase，IKK），進而使κB發(fā)生磷酸化降解，NF-κB的p50/65亞基游離于胞漿內(nèi)，活化NF-κB進入細胞核，啟動多種蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯［17］。危險信號激活NF-κB，誘導神經(jīng)細胞產(chǎn)生p53、c-Myc、cyclin D1等促凋亡因子，發(fā)生凋亡；也可促進炎性因子IL-1、IL-6、IL-8等釋放［18-20］。有學者認為，NF-κB激活促進凋亡和炎癥反應導致神經(jīng)元死亡［21］。NF-кB是眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)表達的主要轉(zhuǎn)錄因子，在細胞炎性反應、神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)、巨噬細胞活化、細胞凋亡［22-23］等過程中起著重要作用。脊髓損傷后NF-κB的活化和再活化在炎癥反應中起關(guān)鍵作用，介導損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應、細胞死亡等過程。有研究表明，阻斷NF-кB的活化可減輕脊髓損傷后引起的一系列繼發(fā)性損傷［24］。本研究結(jié)果提示，大鼠脊髓損傷后脊髓組織中NF-κB的活性立即出現(xiàn)顯著上調(diào)，并隨著時間的推移逐漸增強，3d 為NF-κB活性表達的高峰期，7d時活性表達已不同程度減弱，但仍維持在較高水平，且B組NF-κB表達顯著低于對照組，表明脊髓損傷早期應用電刺激治療，可以有效抑制NF-κB表達，減輕脊髓組織炎癥反應。

IL-6作為炎性細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，促進激活的巨噬細胞分化和浸潤，還可以上調(diào)黏附分子和其他細胞因子的表達，從而加強炎性反應。有研究表明，脊髓損傷后1h，受傷大鼠脊髓組織中IL-6的表達即明顯升高［25- 26］，損傷區(qū)增多的IL- 6可促進TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，進而促進炎性細胞浸潤到損傷局部，抑制神經(jīng)功能的恢復［27-28］。正常情況下，一定濃度IL-6是維持神經(jīng)細胞正常生長和生存的基礎(chǔ)，并影響神經(jīng)細胞的分化、生長和生存。脊髓損傷后，產(chǎn)生過量的IL-6可促進星形膠質(zhì)細胞活化，誘導硫酸軟骨素蛋白多糖表達上調(diào)，促進膠質(zhì)瘢痕的形成，抑制軸突生長［29］。并且損傷局部繼發(fā)性炎癥反應導致IL-1β、IL-6和TNF-α等過量細胞因子產(chǎn)生，是引起脊髓組織漸進性潰變壞死，形成脊髓空洞的主要原因。在脊髓損傷早期抑制IL-6表達，可以減輕免疫炎癥反應，促進損傷后神經(jīng)功能的再生與修復，加快脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1d、3d、7d，B組脊髓組織中IL-6的表達均明顯減弱，提示經(jīng)皮電刺激可通過抑制IL-6的表達，有效控制脊髓損傷后的炎癥反應，進而促進大鼠運動功能的恢復。

綜上所述，經(jīng)皮電刺激在脊髓損傷修復中既能在脊髓損傷后抑制GFAP的表達，又能抑制脊髓損傷后NF-κB和IL-6的表達，從而減少受傷脊髓中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增生和膠質(zhì)瘢痕的形成，抑制脊髓損傷后的炎癥反應，促進脊髓損傷后運動功能的恢復。本實驗為經(jīng)皮電刺激在脊髓損傷修復中的臨床應用提供理論依據(jù)。

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Effect of Transcutaneous Electrical Stimulation on Jiaji Acupoint on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Inflammation in Rats after Spinal Cord Injury

CHEN Chun-mei

Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404120，China

Correspondence to CHEN Chun-mei.E-mail：kylw2014@163.com

Abstract：Objective To observe the effect of transcutaneous electrical stimulationon on Jiaji acupoint（Ex-B 05）on the expression of glial fibrillary acidic protein（GFAP），nuclear factor kappa B（NF-κB）and interleukin-6（IL-6）in rats with spinal cord injury（SCI）.Methods Ninety healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group（group A，n=30），transcutaneous electrical stimulation treatment group（group B，n=30）and control group（group C，n=30）.Allen's method was used to establish the model of acute SCI in T9.All of them were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scale and Slanting Board Test，and the expression of GFAP，NF-κB and IL-6 of the spinal cord were detected with immunohistochemistry one，three and seven days after operation.Results The results of BBB scale and Slanting Board Test were better in group B than in group C three and seven days after SCI（t＞3.349，P＜0.01）.The expression of GFAP，NF-κB and IL-6 was lower in group B than in group C at all the time points after SCI（t＞20.815，P＜0.001）.Conclusion Transcutaneous electrical stimulation can inhibit the inflammation and the expression of GFAP in spinal cord after SCI，and improve the motor function in rats after SCI.

Key words：spinal cord injury；transcutaneous electrical stimulation；glial fibrillary acidic protein；nuclear factor kappa B；interleukin-6；rats

［中圖分類號］R651.2

［文獻標識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）06-0660-07

DOI：10.3969/j.issn.1006-9771.2016.06.008

作者單位：重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶市404120。

作者簡介：陳春梅（1976-），女，漢族，四川岳池縣人，講師，主要研究方向：中醫(yī)中藥教學與臨床方面。E-mail：kylw2014@163.com。

收稿日期：（2015-09-28修回日期：2016-04-13）