響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素

向江波，鄧建朝，楊賢慶*，李來好，戚勃，胡曉，榮輝，楊少玲

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

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響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素

向江波1，2，鄧建朝1，楊賢慶1*，李來好1，戚勃1，胡曉1，榮輝1，楊少玲1

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

摘要文中采用響應(yīng)面微波提取法對長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的提取工藝進(jìn)行研究。單因素和Box-Behnken設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：微波功率、乙醇濃度、料液比、萃取時間、萃取溫度對長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素提取率有顯著影響。優(yōu)化的提取工藝為微波功率200 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比為1∶30 (g∶mL)，萃取時間為20 min，萃取溫度為45℃，在此條件下長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素提取率為91.9%，模型的R2=98.4%。與未經(jīng)微波處理的傳統(tǒng)方法超聲法、回流法和水浴法相比，微波處理最高可使長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素提取率提高79.8%，超聲法、回流法和水浴法蕨藻紅素的提取率分別為微波提取的71.8%、85.69%和55.77%，且提取時間長，消耗溶劑大。

關(guān)鍵詞長莖葡萄蕨藻；蕨藻紅素；微波輔助提??；響應(yīng)面提取法

廣闊的海洋占地球面積的 70% 以上，蘊(yùn)藏著豐富的生物資源。海藻是海洋生物資源的重要組成部分[1-2]。近年來眾多報道表明很多海藻成分復(fù)雜，除富含維生素、礦物質(zhì)、氨基酸及糖類外，還含有多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和多萜類等活性物質(zhì)。多年研究表明海藻具有護(hù)膚美容，抗菌消炎，抗腫瘤，抗病毒，抗衰老，減肥消脂和增強(qiáng)免疫力等一系列功能[3-5]。長莖葡萄蕨藻藻是海藻的一種，長莖葡萄蕨藻中含有能被人體良好利用的活性物質(zhì)蕨藻紅素[6]。蕨藻紅素，一種雙吲哚生物堿，是一種重要的抗氧化和抗炎癥的生物活性成分。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7]報道，蕨藻紅素具有良好的延緩花朵衰老，延緩果實(shí)成熟，除草劑，脫草劑，競爭性抑制生長激素等功效。因此，蕨藻紅素的提取能夠很大程度的提升長莖葡萄蕨藻的價值。

近年以來，微波提取技術(shù)已經(jīng)在天然活性產(chǎn)物領(lǐng)域被廣泛采用，微波具有很強(qiáng)的穿透力，而且能和一些水分子、有機(jī)物質(zhì)等極性分子相互作用，進(jìn)而造成植物細(xì)胞壁內(nèi)部壓力增加，這個壓力的增加導(dǎo)致植物細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)植物內(nèi)部物質(zhì)的釋放，提高單位質(zhì)量的提取率。傳統(tǒng)提取方法主要依靠熱傳遞，與傳統(tǒng)項(xiàng)目相比，微波提取具有低耗能、耗時少等優(yōu)勢特點(diǎn)，與此同時，微波還具有高效率，易操作等優(yōu)勢。因此，微波提取被廣泛應(yīng)用于生化提取工藝中[8-10]。響應(yīng)面分析法(RSM)作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和工藝參數(shù)的有效方法，縮短了試驗(yàn)時間，它的回歸方程具有更高的精密度，并且能夠探究多個變量之間的關(guān)系，已經(jīng)在化學(xué)工程，生物工程，食品工程等領(lǐng)域廣泛廣泛采納[11-12]。目前，蕨藻紅素的提取工藝參數(shù)主要是通過正交試驗(yàn)獲取[13]。但是正交試驗(yàn)不能精確探究出多因素之間的相互關(guān)系，文中以南海長莖葡萄蕨藻為研究對象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法(RSM)對長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素的微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的蕨藻紅素提取工藝。

1材料與方法

1.1材料與試劑

長莖葡萄蕨藻藻，隸屬綠藻門(Chlorophyta)、蕨藻科 (Caulerpaceae)、蕨藻屬 (Caulerpa)，拉丁名為C.lentillifera。采于南海，晾曬后裝入封口袋密封，帶回實(shí)驗(yàn)室作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品。色譜純甲醇，美國Sigma-Aldrich；乙醇 廣州化學(xué)試劑廠(分析純)；實(shí)驗(yàn)用水均符合GB/T6682 一級水的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器

常壓微波輔助合成萃取儀(MAS-Ⅱ)，上海新儀器微波化學(xué)科技有限公司；真空泵(AP-9925)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水機(jī)(MILLIQ)，美國Millipore有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A)，上海亞榮生化儀器廠；(HH-4)數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；(SB25-12DTD)超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；分析天平，瑞士 Mettler-Toledo 公司；高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；Agilent1100 高效液相色譜儀(配有DAD檢測器)美國 Agilent 公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1提取工藝

將采集的長莖葡萄蕨藻用清水超聲清洗干凈,除去泥沙等雜質(zhì)，45 ℃烘干,粉碎后過60目篩子,稱取一定量的海藻,用一定體積的乙醇在一定的微波條件下提取,過濾,乙醇定容,高效液相色譜測試。

1.3.2測定方法

1.3.2.1蕨藻紅素的液相條件

色譜條件：色譜柱為Athena C18-WP，4.6mm×250mm，5μm；流動相甲醇-0.2%冰乙酸(體積比80∶20)；檢測器 88232UV 紫外檢測器；檢測波長315 nm；流速0.8 mL/min；柱溫 30℃；進(jìn)樣量20 μL[14]。

1.3.2.2蕨藻紅素的提取率計算方法

采集的長莖葡萄蕨藻經(jīng)過清洗、干燥、粉碎后，準(zhǔn)確稱取 3.0 g,在一定條件下微波提取，提取溶液定容至100 mL,由高效液相色譜儀測得蕨藻紅素的峰面積A。根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計得出的蕨藻紅素的提取的最優(yōu)工藝組合，在最優(yōu)的工藝組合下，等量的長莖葡萄蕨藻經(jīng)過微波提取后，測定目標(biāo)峰峰面積；將濾渣進(jìn)行二次提取，測定目標(biāo)峰峰面積；如此重復(fù)操作，直至提取物中目標(biāo)峰面積接近為零，表明長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素已提取完全。將多次提取的目標(biāo)峰峰面積相加Amax即為3.0 g長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素總量，各單工藝條件下提取一次的蕨藻紅素的目標(biāo)峰峰面積為A，得出各提取條件下蕨藻紅素的提取率(提取率=A/Amax)[13]。

1.3.3單因素實(shí)驗(yàn)

參考有關(guān)文獻(xiàn)中蕨藻紅素的提取條件，選定微波功率、乙醇濃度、料液比、萃取時間、萃取溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別對單個因素選5個水平，來考察單因素對長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的提取率的影響。

1.3.3.1微波功率對蕨藻紅素提取率的影響

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品3.0 g，按照料液為1∶30 (g∶mL)、 90%的乙醇在萃取時間15 min、萃取溫度為45℃、分別在微波功率100、200、300、400和500 W下進(jìn)行萃取，提取液經(jīng)抽濾后，定容至100 mL，由高效液相色譜法測定蕨藻紅素的峰面積，計算出提取率，以3次實(shí)驗(yàn)平均值來表示提取率，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。隨著微波功率的升高蕨藻紅素的提取率依次升高，在升高至200 W之后，蕨藻紅素的提取率是隨著微波功率的升高反而下降，因此選取200 W為最優(yōu)微波功率。

圖1　微波功率對蕨藻紅素提取率的影響Fig.1　The effect of power on the caulerpin extraction rate

1.3.3.2乙醇濃度對蕨藻紅素提取率的影響

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品3.0 g，按照料液比為1∶30 (g∶mL)、萃取時間15 min、萃取溫度45 ℃、微波功率200 W，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%和100%進(jìn)行萃取，提取液經(jīng)抽濾后，定容至100 mL，由高效液相色譜法測定蕨藻紅素的峰面積，計算出提取率，以3次實(shí)驗(yàn)平均值來表示提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。隨著乙醇濃度的升高蕨藻紅素的提取率依次升高，在升至90%之后，蕨藻紅素的提取率是隨著乙醇濃度的升高反而下降，因此選取乙醇濃度90%為最佳萃取濃度。

圖2　乙醇濃度對蕨藻紅素提取率的影響Fig.2　The effect of ethanol concentration on the caulerpin extraction rate

1.3.3.3料液比對蕨藻紅素提取率的影響

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品3.0 g,按照萃取時間15 min、萃取溫度為45℃、微波功率200 W、乙醇濃度90%，分別在料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60 (g∶mL)進(jìn)行萃取，提取液經(jīng)抽濾后，定容至100 mL，由高效液相色譜法測定蕨藻紅素的峰面積，計算出提取率，以3次實(shí)驗(yàn)平均值來表示提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。隨著料液比的升高蕨藻紅素的提取率依次升高，在升高至1∶40 (g∶mL)之后，1∶50 (g∶mL)和1∶60 (g∶mL)對提取率的影響變化不顯著(P>0.05)[15]?？紤]到提取成本及后續(xù)純化難度，最優(yōu)料液比以1∶30 (g∶mL)為宜。

圖3　料液比對蕨藻紅素提取率的影響Fig.3　The effect of solid-to-liquid ratio on the caulerpin extraction rate

1.3.3.4萃取時間對蕨藻紅素提取的影響

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品 3.0 g，按照料液比 1∶30 (g∶mL)、萃取溫度為45 ℃、微波功率 200 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，萃取時間選取 5、10、15、20和25 min 5個點(diǎn)，提取液經(jīng)抽濾后，定容至100 mL，由高效液相色譜法測定蕨藻紅素的峰面積，計算出提取率，以3次實(shí)驗(yàn)平均值來表示提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，隨著萃取時間的增加蕨藻紅素的提取率依次升高，當(dāng)萃取時間達(dá)到20 min時提取率達(dá)到最大值，之后隨著萃取時間的增加，蕨藻紅素的提取率降低，因此選取20 min為最佳萃取時間。

圖4　萃取時間對蕨藻紅素提取率的影響Fig.4　The effect of extraction time on the caulerpin extraction rate

1.3.3.5萃取溫度對蕨藻紅素提取率的影響

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品3.0 g，按照料液比 1∶30 (g∶mL)、萃取時間 20 min、微波功率 200 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，萃取溫度 選取30、40、50、60和70 ℃5個點(diǎn)，提取液經(jīng)抽濾后，定容至100 mL，由高效液相色譜法測定蕨藻紅素的峰面積，計算出提取率，以3次實(shí)驗(yàn)平均值來表示提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。隨著溫度的升高蕨藻紅素的提取率依次升高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時提取率達(dá)到最大值，因此選取40 ℃為最佳萃取溫度。

圖5　萃取溫度對蕨藻紅素提取率的影響Fig.5　The effect of temperature on the caulerpin extraction rate

2結(jié)果與討論

2.1因素的選擇及方案

綜合1.4的單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料液比 1∶30 (g∶mL)，微波功率 200 W， 根據(jù) Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理[16]，選取對長莖葡萄蕨藻蕨藻紅素提取影響較顯著的萃取溫度T、乙醇濃度C、萃取時間t這3個因素(分別以A、B和C)，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法確定最佳提取工藝條件，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平表

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微波溫度T=X1、乙醇濃度C=X2、微波時間t=X3為自變量，以長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素的提取率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)1～12為析因?qū)嶒?yàn)，13～17為中心實(shí)驗(yàn)，其中區(qū)域的中心點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計實(shí)驗(yàn)誤差，對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，分析結(jié)果見表3，3個因子X1、X2、X3經(jīng)過擬合得到的回歸方程為：Y=84.54+0.25×X1-1.05X2+0.68×X3-9.2×X1×X2+1.08×X1×X3-1.76X2×X3-2.91×X12-0.45×X22-9.01×X32,由表3的分析結(jié)果可知，整體模式極為顯著(“Pr >F” 值 <0.001)；失擬項(xiàng)不顯著(“Pr >F” 值 =0.629 4>0.05)，說明擬合回歸方程對試驗(yàn)的擬合性良好。模型的R2=98.44%，說明實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。

圖6～圖8準(zhǔn)確的給出了各個影響因子相互作用的等值線分析圖和響應(yīng)面的3D圖，從響應(yīng)面的等值線和響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出，在所選的范圍內(nèi)是存在極值的，既是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)，也是響應(yīng)面的最高點(diǎn)。圖6表明，單個X1和X2都對響應(yīng)值有很大的影響，但是作用在一塊時時對提取率的影響沒那么大，并且X2對響應(yīng)值Y的影響是高于X1的。X1和X2在編碼值0以上都得到了很好的響應(yīng)值，這與ANOVA分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基本一致的，圖7表明，X1和X3的相互作用比較強(qiáng)，編碼值較大的X1和X3反而卻導(dǎo)致響應(yīng)值Y值減少，這也與ANOVA的分析結(jié)果是吻合的。圖8表明，X3在編碼值為0跟編碼值在0上下浮動對響應(yīng)值Y的影響是微小的，X1在編碼值以上時，響應(yīng)值Y是增加的，X1與X3的相互作用也較強(qiáng)，經(jīng)過Design-expert分析出最大響應(yīng)值(Y)時對應(yīng)的編碼值是X1=1.00，X2=-1.00，X3=0.195。與之對應(yīng)的長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的最佳提取條件是X1=45 ℃，X2=85%，X3=20.195,理論提取的最佳值為92.01%。

表3　響應(yīng)面ANOVA的分析結(jié)果

圖6　Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.6　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

圖7　Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.7　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

圖8　Y=f(X2,X3)的響應(yīng)面和等高線分析圖Fig.8　The response surface and contour maps of Y=f(X2,X3)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面提取蕨藻紅素的可行性，采用響應(yīng)面得到的最優(yōu)值的提取條件去進(jìn)行長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的驗(yàn)證試驗(yàn)，同時考慮到實(shí)際的操作性和生產(chǎn)的便利，以料液比1∶30 (g∶mL),微波功率 200 W,萃取溫度 45℃，乙醇濃度85%,萃取時間 20 min。3次平均實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際的平均提取率為91.9%，3次試驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.479%，0.486%，0.457%，重現(xiàn)性好。與理論值相差0.11%。因此得出結(jié)論，用微波輔助提取響應(yīng)面優(yōu)化長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素是可行的，得到的蕨藻紅素的提取是具有實(shí)際應(yīng)用價值的。

2.3其他提取方法

準(zhǔn)確稱取清潔干燥過的樣品 3.0 g，加入相應(yīng)體積 85% 的乙醇，按照表4的條件分別用超聲、回流和水浴加熱提取方法提取長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素，3次實(shí)驗(yàn)取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，超聲法、回流法和水浴法蕨藻紅素的提取率分別為微波提取的71.8%、85.69%和55.77%，且提取時間長，消耗溶劑大。

表4　其他提取蕨藻紅素的方法

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于微波提取長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的提取實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微波萃取溫度、萃取時間和乙醇濃度的平方項(xiàng)對長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素提取影響顯著，說明萃取溫度、萃取時間和乙醇濃度對長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素的提取不是簡單的線性關(guān)系?；貧w方程和回歸方程的分析以及驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明，此方法合理可行，得到長莖葡萄蕨藻中蕨藻紅素的最佳提取條件為：料液比 1∶30 (g∶mL),微波功率 200 W,萃取溫度 45 ℃，乙醇濃度85%,萃取時間 20 min，長莖葡萄蕨藻中的蕨藻紅素的實(shí)際提取率為91.9%。

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Optimization of microwave-assisted extraction of cauperpin fromCaulerpalentilliferaby response surface method

XIANG Jiang-bo1，2, DENG Jian-chao1, YANG Xian-qing1*，LI Lai-hao1,QI Bo1, HU Xiao1, RONG Hui1, YANG Shao-ling1

1(National center for aquatic products processing technology research and development, Key laboratory of the ministry of agriculture of aquatic products processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Guangzhou 510300,China)2(Food college, Shanghai ocean university, Shanghai 201306，China)

ABSTRACTThe extraction technology of caulerpin from the Caulerpa lentillifera was studied. The microwave extraction and response surface methodology (RSM) were applied. According to the single factor and Box-Behnken design, the microwave power, ethanol concentration, the ratio of solid to liquid, extraction time, extraction temperature shows significant effects; the optimized extraction technology parameters are: microwave power 200 W, 90% ethanol as extraction solvent, material-liquid ratio of 1∶30 (g∶mL), extraction time 20 minutes and the extraction temperature 45 ℃. Under the above conditions, the extraction rate of caulerpin from the caulerpa lentillifera is 85%. The model’s square of R2 is 98.4%, the experimental results indicate that the optimized extraction of caulerpin from the caulerpa lentillifera by microwave assistant extracting and response surface methodology (RSM) is feasible. It provides a theoretical basis for improving the extraction rate of caulerpin.

Key wordsCaulerpa lentillifera; caulerpin; microwave extraction; response surface methodology (RSM)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606037

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21205138)；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(A201401C02)；廣東省科技計劃項(xiàng)目(2013B021100013)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014YD05，2010TS17) ；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014YD05，2010TS17，2014TS24)

收稿日期：2015-09-24，改回日期：2015-12-22

第一作者：碩士研究生(楊賢慶研究員為通訊作者,E-mail: yxqgd@ 163. com)。