魚鱗膠原蛋白基抗菌凝膠的抑菌效果

葉忱,王喆,鐘青萍

1(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州,510642)2(中國科學院 深圳先進技術研究院醫(yī)藥所，廣東 深圳,518055)

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魚鱗膠原蛋白基抗菌凝膠的抑菌效果

葉忱1,2,王喆2,鐘青萍1 *

1(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州,510642)2(中國科學院 深圳先進技術研究院醫(yī)藥所，廣東 深圳,518055)

摘要采用96孔板法探究了牛至精油、溶菌酶和茶多酚3種天然抑菌劑對大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC),同時采用吸光度法測定了抑菌率。結果發(fā)現(xiàn)，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對E. coli的MIC分別為2.5 μL/mL、6.25 mg/mL和0.156 mg/mL，MBC分別為2.5 μL/mL、25 mg/mL和0.156 mg/mL,抑菌率分別為87.53%、49.26%和79.81%；對S.aureus的MIC分別為1.25 μL/mL、12.5 mg/mL和0.156 mg/mL，MBC分別為2.5 μL/mL、25 mg/mL和0.156 mg/mL，抑菌率分別為83.22%、51.16%和75.22%?？梢娞砑?種天然抑菌劑的魚鱗膠原蛋白凝膠對E.coli和S.aureus均有明顯的抑制作用，且MIC均是：茶多酚<牛至精油<溶菌酶，抑菌率均是：牛至精油>茶多酚>溶菌酶，抑菌效果均是：茶多酚>牛至精油>溶菌酶。因此，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠具有較好的抑菌效果和應用前景。

關鍵詞天然抑菌劑；最小抑菌濃度(MIC)；最小殺菌濃度(MBC)；魚鱗膠原蛋白凝膠；96孔板

近年來隨著人們的衛(wèi)生、安全意識的增強，抑菌劑的選擇逐漸傾向于既可以抑制細菌的生長又健康安全的天然抑菌劑。其中牛至精油是從牛至中提取的揮發(fā)性植物精油，含有芳香酚類、萜類、鞣酸、樹脂等多種化學成分，具有很強的殺菌抑菌及抗氧化作用[1-3]。溶菌酶是一種天然縮氨酸蛋白質抑菌劑，通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細菌的細胞壁分解而抑制細菌活性，可作為抑菌酶添加到包裝材料中[4-5]。茶多酚是茶葉中酚類物質及衍生物的總稱，其中主體兒茶素類為2-苯基苯并吡喃的衍生物[6-7]，現(xiàn)代科學已證實它有止渴提神、延緩衰老[8-9]、抗腫瘤和抗輻射[10]等作用，是很強的天然抗氧化劑，同時對微生物具有較強的抑制作用[11-14]，現(xiàn)已大量應用于食品、醫(yī)療、日用化工、輕工等多方面[15-19]。

本文以魚鱗膠原蛋白凝膠為基質，分別添加具有抑菌活性的牛至精油、溶菌酶和茶多酚制成抗菌凝膠，用做可食涂膜包裝。本研究采用96孔板法探究魚鱗膠原蛋白抗菌凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。相比于傳統(tǒng)的試管二倍梯度稀釋法，96孔板法更清晰直觀，操作簡易，工作效率高。本文旨在為牛至精油、溶菌酶和茶多酚作為天然抑菌劑應用于可食抗菌包裝中提供參考。

1材料與方法

1.1菌株、材料與試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli, ATCC25922)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, ATCC25923)，由中國科學院深圳先進技術研究院人體組織與器官退行性研究中心提供。

魚鱗膠原蛋白凝膠，中國科學院深圳先進技術研究院人體組織與器官退行性研究中心；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，廣東環(huán)凱試劑有限公司；牛至精油，蘇州詩妍生物日化有限公司；溶菌酶，成都艾科達化學試劑有限公司；茶多酚，上海易蒙斯化工科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

Thermo Scientific Multiskan GO全波長讀數(shù)儀，北京金業(yè)德祥生物科技有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；GR110DR Zealway 110L智能滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1標準曲線的繪制

細菌的菌濃度與吸光度(OD)值之間存在線性關系[20]。測定不同稀釋度的細菌懸液在600 nm處OD值，采用平板菌落計數(shù)方法確定不同稀釋度細菌懸液的濃度，最后以OD值為縱坐標，以菌濃度為橫坐標作出標準曲線。

1.3.2配制抑菌工作液

在無菌環(huán)境下分別稱取20 μL牛至精油、200 mg溶菌酶和20 mg茶多酚，加入5 g膠原蛋白，并用營養(yǎng)肉湯配制成濃度分別為20 μL/mL的牛至精油工作液、200 mg/mL的溶菌酶工作液和20 mg/mL的茶多酚抑菌工作液。

1.3.3最小抑菌濃度(MIC)

在無菌的96孔板A-F排每孔中各加入180 μL營養(yǎng)肉湯，吸取180 μL預先配制的牛至精油抑菌工作液至D1孔中混合均勻，D1孔濃度即為10 μL/mL；從D1孔吸取180 μL溶液到D2孔，依次稀釋到D11孔，D11孔棄去180 μL溶液(吸取前注意混合均勻)，D12孔為空白對照；以相同的條件分別在E、F排添加溶菌酶和茶多酚抑菌工作液；接下來在D、E、F每孔中加入10 μL菌懸液(104CFU/mL)，最后在37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察，同時做3次平行實驗。抑菌液濃度最低且澄清的孔所對應的即為最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.4最小殺菌濃度(MBC)

將濃度高于MIC(包括MIC)的孔中溶液各吸取100 μL涂布平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，仍無菌生長的平板所對應的濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.5吸光度測定抑菌率

(1)

1.3.6數(shù)據(jù)分析

采用Microcal Origin 8.1和SPSS 17.0進行方差分析和顯著性分析。

2結果與分析

2.1標準曲線

細菌菌懸液的OD值與其濃度存在線性正比關系。在600 nm處測定細菌菌懸液的OD值，再根據(jù)活菌計數(shù)法計算每毫升菌懸液中的細菌數(shù)目，以OD值為縱坐標，菌濃度為橫坐標，得到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液濃度與OD值的標準曲線，如圖1、圖2所示。

圖1　大腸桿菌懸液濃度與OD值的標準曲線Fig.1　The standard curve between E. coli suspension concentration and OD values

圖2　金黃色葡萄球菌懸液濃度與OD值的標準曲線Fig.2　The standard curve between S.aureus suspension concentration and OD values

由圖1可知，大腸桿菌的菌懸液標準曲線關系式為：y=0.302x+ 0.029，擬合度R2為0.999，說明該曲線的可信度高。由圖2可知，金黃色葡萄球菌的菌懸液標準曲線關系式為：y=0.026x+ 0.122，擬合度R2為0.999，說明該曲線的可信度高。根據(jù)這2條標準曲線，在實驗中可以根據(jù)OD值制備出實驗所需濃度的菌懸液。

2.2最小抑菌濃度(MIC)

如圖3所示，可以分別觀察到添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的抑菌效果。由圖可知，牛至精油(D行)、溶菌酶(E行)和茶多酚(F行)工作液所對應的第3個孔(D行)、第5個孔(E行)和第7個孔(F行)澄清，且效果明顯。由此可得出結論，含有牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為2.5 μL/mL、6.25 mg/mL和0.156 mg/mL。

圖3　魚鱗膠原蛋白抗菌凝膠對大腸桿菌的最小抑菌濃度Fig.3　MIC of the scale collagen antimicrobial gel for E. coli注：A、B和C排為空白對照，即僅添加了牛至精油工作液、溶菌酶工作液和茶多酚工作液；D、E和F排則是：工作液+大腸桿菌菌懸液(104CFU/mL)。

如圖4所示，可以分別觀察到添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。由圖4可知，牛至精油(D行)、溶菌酶(E行)和茶多酚(F行)工作液所對應的第4個孔(D4)、第4個孔(E4)和第7個孔(F7)澄清，且效果明顯。由此可得出結論：含有牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為1.25 μL/mL、12.5 mg/mL和0.156 mg/mL。

圖4　魚鱗膠原蛋白抗菌凝膠對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Fig.4　MIC of the scale collagen antimicrobial gel for S.aureus注：A、B和C排為空白對照，即僅添加了牛至精油工作液、溶菌酶工作液和茶多酚工作液；D、E和F排則是：工作液+金黃色葡萄球菌菌懸液(104 CFU/mL)。

2.3最小殺菌濃度(MBC)

2.3.1含牛至精油的魚鱗膠原蛋白凝膠最小殺菌濃度(MBC)

圖5中編號1～3牛至精油濃度分別為10、5、2.5 μL/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，1～3號平板仍無菌生長，由此可知，含牛至精油的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度為2.5 μL/mL。

圖5　含牛至精油的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.5　MBC of the scales collagen gel containing oregano essential oil for E. coli

圖6中編號1～4牛至精油濃度分別為10、5、2.5、1.25 μL/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，1～3號平板仍無菌生長，由此可知，含牛至精油的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為2.5 μL/mL。

圖6　含牛至精油的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.6　MBC of the scales collagen gel containing oregano essential oil for S.aureus

2.3.2含溶菌酶的魚鱗膠原蛋白凝膠最小殺菌濃度(MBC)

圖7中編號1～5溶菌酶濃度分別為100、50、25、12.5、6.25 mg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，1～3號平板仍無菌生長，由此可知，含溶菌酶的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度為25 mg/mL。

圖7　含溶菌酶的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.7　MBC of the scales collagen gel containing lysozyme for E. coli

圖8中編號1～4溶菌酶濃度分別為100、50、25、12.5 mg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，1～3號平板仍無菌生長，由此可知，含溶菌酶的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為25 mg/mL。

圖8　含溶菌酶的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.8　MBC of the scales collagen gel containing lysozyme for S.aureus

2.3.3含茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠最小殺菌濃度(MBC)

圖9中編號1～7茶多酚濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，1～7號平板仍無菌生長，由此可知，含茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度為0.156 mg/mL。

圖9　含茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.9　MBC of the scales collagen gel containing tea polyphenols for E.coli

圖10中編號1～7茶多酚濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，1～7號平板仍無菌生長，由此可知，含茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為0.156 mg/mL。

圖10　含茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)Fig.10　MBC of the scales collagen gel containing tea polyphenols for S.aureus

2.4抑菌率

2.4.1三種抑菌劑對大腸桿菌的抑菌率

由表1可知，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌的抑菌率分別為87.53%、49.26%和79.81%?？梢娞砑舆@3種抗菌劑的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌抑菌效果明顯，且抑菌率為：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。

表1　三種抑菌劑在大腸桿菌最小抑菌濃度下

2.4.2三種抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑菌率

由表2可知，添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是83.22%、51.16%和75.22%?？梢娞砑舆@3種抗菌劑的魚鱗膠原蛋白凝膠對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，且抑菌率為：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。

表2　三種抑菌劑在金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度下

3結論

添加牛至精油、溶菌酶和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對試驗所用的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定程度的抑制作用，且隨著添加量的增加，抑菌能力增強。最小抑菌濃度為：茶多酚<牛至精油<溶菌酶，抑菌率為：牛至精油>茶多酚>溶菌酶。由此可知：添加牛至精油和茶多酚的魚鱗膠原蛋白凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力優(yōu)于溶菌酶，本實驗的研究結果為牛至精油、溶菌酶和茶多酚在可食抗菌包裝的應用提供一定的參考。

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Antibacterial effects of scale collagen protein-based antibacterial gel

YE Chen1,2, WANG Zhe2, ZHONG Qing-ping1*

1(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)2(Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China)

ABSTRACT96-well plate method was used to determine minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, while the inhibition rate was determined by the absorbance method. It was found that the MICs of oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols for E. coli were 2.5 μL/mL, 6.25mg/mL and 0.156 mg/mL, the MBCs were 2.5 μL/mL, 25 mg/mL and 0.156 mg/mL, wherein inhibition rates were 87.53%, 49.26% and 79.81%. The MICs of S.aureus were 1.25 μL/mL, 12.5 mg/mL and 0.156 mg/mL, the MBCs were 2.5μL/mL, 25mg/mL and 0.156mg/mL, wherein inhibition rates were 83.22%, 51.16% and 75.22%, respectively. Results indicated that scale collagen gel enriched with three natural antibacterial agents had significant inhibition effects against E. coli and S.aureus, the order of MICs for E. coli and S.aureus was as follows: tea polyphenols < oregano essential oil < lysozyme. The order of their antibacterial rate was as follows: oregano essential oil> tea polyphenols> lysozyme. The order of their inhibitory effects was as folows: tea polyphenols > oregano essential oil >lysozyme. This study showed that the scale collagen gel enriched with oregano essential oil, lysozyme and tea polyphenols had strong antibacterial effects and application prospects.

Key wordsnatural antibacterial agents; MIC; MBC; scale collagen gel; 96-well plate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606019

基金項目：國家自然科學基金項目(31271956)；深圳市2014年科技研發(fā)基礎研究項目(JCYJ20140901003939008)；2014年青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)"成長之星"項目(KC2014JSQN0009A)

收稿日期：2015-12-07，改回日期：2016-02-29

第一作者：碩士研究生(鐘青萍教授為通訊作者，E-mail：zhongqp@scau.edu.cn)。