基于保護(hù)劑篩選及優(yōu)化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩(wěn)定性

葉雙雙，周麗，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

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基于保護(hù)劑篩選及優(yōu)化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩(wěn)定性

葉雙雙，周麗，周哲敏*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

摘要苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase，PAH)具有治療苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)的潛在藥用價值，而熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性差是限制其應(yīng)用的重要因素。文中考察了多種保護(hù)劑對PAH熱穩(wěn)定性的影響，表明添加10%的甘油可將PAH在50 ℃處理10 min的酶活保留率提高3.1倍，達(dá)到 (98.3±0.8)%，同時海藻糖、棉籽糖和甘露醇均能將PAH酶活保留率提高到78%以上。鑒于甘油在臨床應(yīng)用過程中可能出現(xiàn)不良反應(yīng)，對后3種保護(hù)劑進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，獲得最佳復(fù)合保護(hù)劑組合：2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L 棉籽糖和1.5 mmol/L 海藻糖，可將50 ℃酶活保留率提高3.1倍，達(dá)到 (99.3±1.2)%。10%甘油和復(fù)合保護(hù)劑均能顯著提高PAH在4、20、37 ℃的儲存穩(wěn)定性，其中添加10%甘油或復(fù)合保護(hù)劑使得PAH在37 ℃下儲存半衰期分別延長到129.9 h和237.5 h，比未添加保護(hù)劑的分別提高了1.9倍和4.3倍。該結(jié)果為PAH在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase，PAH)；保護(hù)劑；穩(wěn)定性

苯丙氨酸羥化酶(Phenylalanine hydroxylase, PAH, EC 1.14.16.1)主要功能是催化苯丙氨酸羥化反應(yīng)生成酪氨酸。人體內(nèi)PAH基因突變導(dǎo)致該酶的活性降低或喪失，苯丙氨酸代謝紊亂，最終形成苯丙酮尿癥(phenylketonuria, PKU)[1-2]。目前該疾病患者只能通過攝入低苯丙氨酸或不含苯丙氨酸的配方食品或低蛋白食物[3]來控制疾病。但是這種治療方法會導(dǎo)致患者微量元素缺乏、脂肪酸缺乏和低膽固醇血癥等[4]。如果能將PAH直接添加到食物中，可有效控制苯丙氨酸同時不影響其他營養(yǎng)物質(zhì)攝入。紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)PAH的催化區(qū)域與人類來源PAH幾乎完全一致，能夠在人體溫度和pH條件下催化苯丙氨酸羥化反應(yīng)，且相對其他來源的PAH穩(wěn)定性更高[5]。YEW等[6]運(yùn)用紫色色桿菌PAH成功降低了正常小鼠血液中苯丙氨酸水平，為其在功能食品領(lǐng)域的運(yùn)用提供了參考。然而，穩(wěn)定性低仍然是限制PAH進(jìn)一步應(yīng)用的重要因素[7]。

酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性是影響其在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵因素。在諸多提高酶蛋白穩(wěn)定性的方法中，添加保護(hù)劑不僅能有效提高酶的熱穩(wěn)定性，延長酶類的保存時間，而且工藝簡單，成本低。如GEORGE等[8]在木聚糖酶中分別添加甘油、山梨醇、甘露醇、明膠或海藻糖等，均顯著提高了木聚糖酶在80 ℃條件下的穩(wěn)定性；李群等[9]發(fā)現(xiàn)，添加0.5 mmol/L海藻糖的乙醇脫氫酶在30～60 ℃條件下處理20 min后酶活保留率顯著升高。此外，一些研究者發(fā)現(xiàn)將多種保護(hù)劑組合，可進(jìn)一步提高酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。例如，劉彩琴等[10]在α-半乳糖苷酶中添加復(fù)合保護(hù)劑(1.75 mmol/L海藻糖、1.5 mmol/L甘露醇和2 mmol/L棉籽糖)，使α-半乳糖苷酶在30～60 ℃時酶活保留率提高11.6%～21.7%；COASTA[11]等人在過氧化氫酶中加入由甘油和聚乙烯乙二醇組成的復(fù)合保護(hù)劑提高了其儲存穩(wěn)定性。

常用的酶保護(hù)劑有多元醇、糖類、氨基酸、鹽類、蛋白質(zhì)、大分子聚合物等[12-17]，這些保護(hù)劑對酶的作用機(jī)制是使酶表面完全水化和保護(hù)劑完全結(jié)合之間建立其一種平衡，從而改變?nèi)芤旱臒崃W(xué)性質(zhì)，發(fā)揮保護(hù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用[18-20]。本研究選取多種適用于醫(yī)藥領(lǐng)域的保護(hù)劑，考察它們對PAH熱穩(wěn)定性的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳保護(hù)劑組合，并比較了最佳保護(hù)劑在不同溫度下的儲存效果。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

菌種：EscherichiacoliBL21(DE3)/pET24a-pah由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[7]。

保護(hù)劑：海藻糖、乳糖、蜜二糖、棉籽糖、甘油、山梨醇、甘露醇、CaCl2、山梨酸鉀、NaCl、白蛋白、L-半胱氨酸、明膠。

發(fā)酵培養(yǎng)基：2YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨15 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 10 g/L)。

1.1.2主要儀器

SW-CJ-2D超凈工作臺，美國Thermo公司；超聲破碎儀，美國SONICS公司；CF16RXⅡ離心機(jī)，日本HITACHI公司；HYG-A全溫立式搖床，江蘇太倉設(shè)備廠；AKTAXPRESS蛋白純化儀，通用電氣醫(yī)療機(jī)械集團(tuán)；HiTrap FF DEAE 1mL陰離子柱，通用電氣醫(yī)療器械集團(tuán)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PAH的制備

以E.coliBL21(DE3)/pET24a-pah作為出發(fā)菌株，當(dāng)菌種OD600值=0.6時，添加終濃度0.6 mmol/L 的IPTG，24 ℃ 200 r/min條件下發(fā)酵24 h。菌種發(fā)酵培養(yǎng)后離心(8 000 r/min，4 ℃，5 min)收集細(xì)胞。用適當(dāng)體積20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl重懸后用超聲破碎儀破碎，離心(12 000 r/min，4 ℃，30 min)取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，經(jīng)DEAE陰離子交換柱純化目的蛋白[7]，獲得較純的目的蛋白。

1.2.2PAH酶活測定方法

PAH酶液稀釋至0.5 mg/mL，取50 μL加到250 μL 100 mmol/L HEPES(pH 7.5)緩沖液中，然后在該體系中加入50 μL濃度為10 mmol/L的苯丙氨酸、50 μL濃度為50 mmol/L的DTT、50 μL濃度為50 μmol/L FeSO4、50 μL濃度為2 mmol/L的DMPH4，37 ℃處理10 min，加入500 μL甲醇終止反應(yīng)。15 000 r/min離心30 min，取上清，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，利用HPLC檢測產(chǎn)物生成量[7]。

1.2.3保護(hù)劑的篩選

將所選的各種類型的保護(hù)劑以一定的比例與PAH混合，50 ℃處理10 min后立即用冰水冷卻，測定殘存酶活。以處理前PAH活性作為100%，分別計(jì)算不同條件下的酶活力保留率。

(1)

1.2.4復(fù)合保護(hù)劑組分優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定保護(hù)劑種類和濃度，進(jìn)行三因素四水平(采用L16(43)的正交表，如表1)的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化保護(hù)劑配方。

1.2.5保護(hù)劑對PAH儲存穩(wěn)定性的影響

儲存實(shí)驗(yàn)分別在4、20、37 ℃(分別屬于保鮮溫度、常溫及PAH最適反應(yīng)溫度)進(jìn)行。在酶液中分別添加不同的保護(hù)劑，對照組不添加任何保護(hù)劑，每隔12 h或24 h取樣測定酶活保留率。

表1　復(fù)合保護(hù)劑正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2結(jié)果與分析

2.1保護(hù)劑種類對PAH熱穩(wěn)定性的影響

選取可應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域的保護(hù)劑加入到PAH中，50 ℃保溫10 min后測定殘留PAH活性，比較各保護(hù)劑對PAH熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表2所示。

表2　單一保護(hù)劑對PAH熱穩(wěn)定性的影響

由表2可知，中性鹽對PAH的保護(hù)效果較差，其中NaCl對PAH無顯著保護(hù)效果，CaCl2、山梨酸鉀對酶活有明顯的抑制作用；而糖類、多元醇、蛋白類、聚合物和氨基酸對PAH的熱穩(wěn)定性都有一定的促進(jìn)作用，其中甘油效果最好，添加10%或者20%的甘油后，PAH酶活保留率分別高達(dá) (98.3±0.8)%、(98.9±0.6)%，相比未添加保護(hù)劑的對照組(酶活保留率為 (24.3±2.6)%)提高了3.1倍左右，棉籽糖，海藻糖，甘露醇保護(hù)效果略次于甘油，處理之后的酶活保留率均高于78%。

已有研究[13]認(rèn)為，鹽中金屬離子能夠結(jié)合酶的帶電基團(tuán)，從而提高酶的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽類對PAH沒有顯著的效果，CaCl2、山梨酸鉀甚至對PAH活性產(chǎn)生顯著抑制，可能是因?yàn)镻AH活性中心結(jié)合一個Fe2+才能發(fā)揮催化作用，當(dāng)加入其他金屬離子時會干擾Fe2+與酶的活性中心結(jié)合，導(dǎo)致酶活下降。

酶的熱穩(wěn)定性，主要取決于酶分子的空間結(jié)構(gòu)。通常情況下，高溫會導(dǎo)致維系酶分子空間結(jié)構(gòu)的氫鍵或疏水鍵遭到破壞，失去原有的空間構(gòu)象，最終失去原有的生物活性。當(dāng)添加甘油、海藻糖、棉籽糖或甘露醇至酶液中，它們的羥基能夠與酶分子表面的酰胺基之間形成氫鍵[21]，因此能有效提高酶的熱穩(wěn)定性。

2.2保護(hù)劑濃度對PAH熱穩(wěn)定性的影響

在不同濃度保護(hù)劑下，50 ℃保溫10 min，PAH活性殘留率如圖1所示。表明棉籽糖的最佳質(zhì)量體積百分濃度為1.0%，相對酶活為 (94.0±1.8)%，高于同濃度下的海藻糖、甘露醇和甘油。甘油在高濃度(體積分?jǐn)?shù)≥10%)下對PAH具有良好的穩(wěn)定作用，相對酶活為98%左右，直到甘油濃度提高至50%仍未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

圖1　保護(hù)劑濃度對PAH熱穩(wěn)定性的影響Fig.1　Effects on thermostability of PAH in the presence of protective additive with different concentrations

2.3復(fù)合保護(hù)劑對PAH熱穩(wěn)定性的影響

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10%甘油即表現(xiàn)出非常顯著的保護(hù)效果，但是甘油在臨床應(yīng)用中也會出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，如曾出現(xiàn)由于10%復(fù)方甘油引起血紅蛋白尿的病例[22]；口服甘油合劑導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀[23]；甘油灌腸劑也可能對患者產(chǎn)生不良反應(yīng)[24]等。而將多種保護(hù)效果略差的保護(hù)劑進(jìn)行合理組合，同樣可達(dá)到顯著提高酶穩(wěn)定性的效果。因此選取甘露醇(A)、棉籽糖(B)、海藻糖(C)三種保護(hù)劑設(shè)計(jì)三因素四水平實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化獲得最佳保護(hù)劑組合。結(jié)果如表3所示。

由表3極差分析可以看出甘露醇對PAH熱穩(wěn)定性作用最顯著，海藻糖、棉籽糖效果相似。根據(jù)K值得出PAH最佳保護(hù)劑配方為A1B1C2，即2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L棉籽糖、1.5 mmol/L海藻糖。

將上述獲得的最佳復(fù)合保護(hù)劑添加到PAH中，在50 ℃條件下處理10 min，測定殘余酶活，表明酶活保留率達(dá)到 (99.3±1.2)%，比未添加保護(hù)劑的酶活保留率((24.3±2.6)%)提高了3.1倍。

表3　復(fù)合保護(hù)劑的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4甘油與復(fù)合保護(hù)劑對PAH儲存穩(wěn)定性的影響

酶的穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性是酶臨床應(yīng)用的重要因素，液體酶直接儲存，容易喪失酶活性，不易長期保存。冷凍真空干燥工藝復(fù)雜，成本高，難以大規(guī)模應(yīng)用。因此選擇適合的保護(hù)劑提高酶的熱穩(wěn)定性對該酶的應(yīng)用具有重要意義。根據(jù)單因素和優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑結(jié)果可以看出，10%甘油和復(fù)合保護(hù)劑(甘露醇2.5 mmol/L、棉籽糖1 mmol/L、海藻糖1.5 mmol/L)對PAH熱穩(wěn)定性均具有很好的保護(hù)效果。為了比較二者在儲存過程中對PAH的保護(hù)效果，分別在4、20、37 ℃三個溫度條件下保溫不同時間，并測定PAH的酶活殘留率。

由圖2 所示，隨著溫度升高PAH失活速度明顯增加，在4 ℃條件下放置兩2后剩余酶活為 (53.6±1.3)%，在20、37 ℃僅放置10天后酶活已分別降至 (19.3±2.5)%、(6.9±1.9)%。添加保護(hù)劑能顯著降低PAH失活速度，在4 ℃放置2周，添加保護(hù)劑的PAH酶活保留率可達(dá)85%左右，比未添加保護(hù)劑的對照組高出近58.6%；在20 ℃條件下，添加保護(hù)劑處理10天后酶活保留率仍然在50%以上，而不添加保護(hù)劑時PAH半衰期僅為84.1 h左右；在37 ℃條件下，添加甘油和復(fù)合保護(hù)劑后PAH半衰期分別提高到129.9、237.6 h左右，相比未添加保護(hù)劑的PAH半衰期(45.2 h左右)分別提高了2.8、4.0倍。

同時，復(fù)合保護(hù)劑對提高PAH儲存穩(wěn)定性的效果明顯優(yōu)于甘油，20 ℃放置10天后添加復(fù)合保護(hù)劑酶活保留率比添加10%甘油的高出24.1%，在37 ℃放置時添加復(fù)合保護(hù)劑PAH半衰期(237.6 h左右)較添加甘油(半衰期129.9 h)高出82.9%。表明在不同的儲存溫度下，復(fù)合保護(hù)劑均比10%甘油更具優(yōu)勢。

A：4 ℃條件；B： 20 ℃條件；C：37 ℃條件圖2　甘油和復(fù)合保護(hù)劑對苯丙氨酸羥化酶儲存穩(wěn)定性的影響Fig.2　Effects on storage stability of PAH in the presence of glycerol or combination additives

3結(jié)論

本研究分析了在PAH中添加糖類、多元醇、鹽類、蛋白質(zhì)、大分子聚合物、氨基酸等化學(xué)物質(zhì)對酶熱穩(wěn)定性的影響，篩選出了可有效提高PAH穩(wěn)定性的4種保護(hù)劑，分別是甘油、甘露醇、棉籽糖、海藻糖。對甘露醇、棉籽糖、海藻糖進(jìn)行正交優(yōu)化得到最佳復(fù)合保護(hù)劑配方：2.5 mmol/L甘露醇、1 mmol/L棉籽糖、1.5 mmol/L海藻糖，可將PAH在50 ℃酶活保留率提高到 (99.3±1.2)%。在4、20、37 ℃下，添加10%甘油或復(fù)合保護(hù)劑均能提高PAH儲存穩(wěn)定性，延長儲存時間。與10%甘油相比，溫度越高時復(fù)合保護(hù)劑對PAH儲存穩(wěn)定性的保護(hù)效果越好。

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Enhancement of thermostability of phenylalanine hydroxylase based on the strategy of screening and optimization of additives

YE Shuang-shuang, ZHOU Li, ZHOU Zhe-min*

(Schoool of Biotechnology and the Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTPhenylalanine hydroxylase (PAH) is a potential medicine for phenylketonuria (PKU). However, the application of PAH is mainly limited by its low thermostability and storage stability. The effects of several additives on the thermostability of PAH were tested in the present study. Addition of 10% glycerol could improve the residual activity of PAH to (98.3±0.8) % after incubation at 50 ℃ for 10 min, which was 3.1 times higher than that without protective additive. In addition, trehalose, raffinose and mannitol could improve residual activity of PAH to over 78%. In view of the possible adverse reactions of glycerol in the process of clinical application, the later three additives were optimized using the orthogonal experiment. An optimal combination additive of 2.5 mmol/L mannitol, 1 mmol/L raffinose and 1.5 mmol/L trehalose was obtained. With the optimal combination additive, residual activity of PAH could reach (99.3 ± 1.2) %, which was 3.1 times higher than that without protective additive. Both 10% glycerol and the optimal combination additive could significantly improve the storage stability of PAH at 4 ℃, 20 ℃ and 37 ℃. With 10% glycerol or combination additive, the half-life of PAH at 37 ℃ were increased to 129.9 h and 237.5 h, respectively, which were 1.9 times and 4.3 times higher than that without protective additive. The result laid the foundation for medical application of PAH.

Key wordsphenylalanine hydroxylase (PAH ); protective additive; thermostability

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606010

基金項(xiàng)目：國家863計(jì)劃(2014AA021304)；2014年基本科研(JUSRP51411B)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(111-2-06)

收稿日期：2015-12-18，改回日期：2016-03-03

第一作者：碩士研究生(周哲敏教授為通訊作者，E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn )。