具有典型泛醌結(jié)構(gòu)成分微生物參比菌株的篩選

蘇姣姣,翟磊,張露,姚粟,程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

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具有典型泛醌結(jié)構(gòu)成分微生物參比菌株的篩選

蘇姣姣,翟磊,張露,姚粟,程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

摘要泛醌(Ubiquinone，UQ)是一種類異戊二烯醌，是微生物分類鑒定的主要化學(xué)分析指標之一。采用薄層層析與高效液相色譜相結(jié)合的方法對具有典型泛醌組分的微生物菌株進行測定、分析，通過比較菌株的生長性能以及泛醌類型與含量，最終得到培養(yǎng)條件簡單、培養(yǎng)時間短且泛醌成分單一、含量高的一套參比菌株。該套菌株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)CICC 31691，東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)CICC 1817，眼馬賽菌(Massilia oculi)CICC 23887，日本假單胞菌(Pseudomonas japonica)CICC 23895，類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)CICC 10287分別為Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10醌組分的參比菌株，可應(yīng)用于細菌和酵母的常規(guī)鑒定及新種分類鑒定。

關(guān)鍵詞泛醌；菌株篩選；參比菌株

泛醌(輔酶Q)是一類參與微生物呼吸鏈電子傳遞和氧化磷酸化的重要輔酶，普遍存在于各種生物膜上，如原核生物質(zhì)膜[1]和真核生物的線粒體內(nèi)膜[2]。目前關(guān)于泛醌的生物合成[3-4]、生理功能及代謝途徑[5-6]研究均較為深入，由于合成結(jié)構(gòu)的特殊性(類異戊二烯醌，其類異戊二烯側(cè)鏈長度及鏈上氫飽和度具有差異性)，泛醌成為了微生物化學(xué)分類的主要化學(xué)分析指標之一。分析泛醌組分的構(gòu)成便于幫助我們了解微生物的多樣性[7]，并且對于確定新種分類地位也非常重要[8]。

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法是測定類異戊二烯醌組分的常用方法之一，可通過與標準品或從標準菌株中提取的醌樣品進行比較分析，鑒定不同類型的醌。由于醌化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[9]，醌標準品價格昂貴、種類不足，篩選一組涵蓋不同醌組分的參比菌株作為醌成分分析的參照，可一定程度上解決該問題。與醌標準品相比，參比菌株的選擇還具有很多明顯的優(yōu)勢。首先菌株易保存，相比于醌的保存需要避強光、強堿、氧氣及水等，菌株的保藏條件要比醌寬泛。其次菌株易擴繁，醌物質(zhì)本身不具有再生性，而菌株可以通過傳代培養(yǎng)重復(fù)獲得菌體，極好地體現(xiàn)了菌株使用的經(jīng)濟性。再次，醌標準品可提供醌類型、醌含量的參照，但參比菌株可與實驗菌株同時進行醌的提取、測定、分析，作為整個試驗過程的參照。此外，該組參比菌株的選擇還具有靈活性，可根據(jù)試驗需要選擇所需相應(yīng)醌型的一株或多株菌株，將從中提取到的醌單獨或混合使用作為參照。

本試驗以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)[10]，《The yeasts: a taxonomic study》(第五版)[2]以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)[11]更新的菌株信息為主要參考依據(jù)，首先確定Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五種待選泛醌類型，再根據(jù)上述醌型分別選擇對應(yīng)的1～3株供試菌株。以前期建立的HPLC分析方法以及基于該方法確定的醌組分保留時間為依據(jù)，結(jié)合菌株的生長狀況對具有相同醌型菌株進行比較，從中篩選單一泛醌組分含量較高，易培養(yǎng)，易提取的菌株，構(gòu)成一套泛醌參比菌株，用于微生物常規(guī)鑒定及新種分類鑒定。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：麥芽浸粉肉湯(Malt Extract Broth，MEB)、營養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth，NB)和胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth，TSB)，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2主要試劑和儀器

試劑：三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲苯和正己烷均為分析純，購自北京化工廠。NaOH、焦性沒食子酸，均購自西隴化工股份有限公司。液相分析用甲醇和異丙醇，均為色譜純，分別購自美國Fisher Scientific公司和美國J.T.Baker公司。

儀器設(shè)備：培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；離心機，Eppendorf；-80 ℃冰箱，Thermo Fisher Scientific；恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，IKA；真空冷凍濃縮儀，LABCONCO；三用紫外分析儀，上海精科實業(yè)有限公司；TLC硅膠薄層板GF254，Merck；層析缸；高效液相色譜儀，SHIMADZU。

1.2供試菌株的選擇

以Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五種醌組分為選擇依據(jù)，各挑選1～3株以上述組分為唯一或主要醌型，且來源方式簡單，生長溫度適度，菌體富集時間短的菌株。所有供試菌株均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)提供。

1.3菌體的培養(yǎng)與收集

將供試菌株分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在各自的培養(yǎng)溫度下，采用200 r /min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)24 h。檢查無污染后，離心收集菌體，用蒸餾水洗滌2次后，將濕菌體于-20 ℃預(yù)凍1 h，-80 ℃預(yù)凍1 h，真空冷凍干燥18 h。凍干菌體置于干燥器中備用。

1.4醌的提取

細菌醌的提?。簩龈删w轉(zhuǎn)入裝有30 mL三氯甲烷∶甲醇(2∶1，V/V)的離心管中，添加少量玻璃珠，于黑暗處搖瓶過夜10 h。用濾紙過濾收集濾液于干凈、干燥的100 mL旋蒸瓶中，于37 ℃減壓蒸餾至干燥。

酵母泛醌的提取[12]：將凍干菌體轉(zhuǎn)入150 mL水∶甲醇(1∶2，V/V)的混合物中，添加20 g NaOH和5 g焦性沒食子酸。95 ℃，40 min水浴加熱后，自來水冷卻25 min。加入80 mL的正己烷，劇烈振搖，6 000 r/min，離心3 min，收集正己烷提取液層于另一干凈容器中。余下溶液加入正己烷重復(fù)2次，將3次的正己烷提取液收集到一起。為了消除堿性加入30 mL蒸餾水，振搖，收集正己烷層轉(zhuǎn)入旋蒸瓶，37 ℃減壓蒸餾至干燥。

分別用適量(約5 mL)丙酮重新溶解干燥物，12 000 r/min離心3 min，再采用真空冷凍濃縮儀將其濃縮至40 μL左右，得到醌的粗提樣品。

1.5醌的純化

1.5.1薄層層析(TLC)

準備工作：倒入適量展層劑甲苯于層析缸(20 cm×10 cm×10 cm)中，蓋上蓋子，放置1 h，使缸內(nèi)甲苯氣體達到飽和狀態(tài)。硅膠薄層板GF254(10 cm×5 cm)于65 ℃活化30 min。點樣與層析：將醌的粗提樣品，長條狀點樣于GF254硅膠板上。吹干后將硅膠板置于層析缸中層析，距頂邊1 cm時取板，風(fēng)干。

1.5.2紫外觀察

將硅膠板置于254 nm紫外燈下觀察。綠色熒光背景下，比移值Rf為0.3～0.5的位置有暗褐色的條帶則為泛醌組分。

1.5.3純化醌樣品

將醌組分條帶刮下，收集硅膠粉，用1 mL丙酮溶解后采用疏水性注射過濾器過濾，使用真空冷凍濃縮儀將濾液濃縮至干燥，置于-20 ℃黑暗處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6供試菌株泛醌組分分析及含量比較

采用HPLC對得到的醌純化樣品進行組分分析。分析條件如下：儀器為島津高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.)，流動相為V(甲醇)∶V(異丙醇)=2∶1，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測器為光電二極管陣列檢測器(PDA)，泛醌用檢測波長為273 nm。HPLC上樣前用200 μL丙酮(總樣量)重新溶解醌純化樣品，12 000 r/min離心3 min，取上清液轉(zhuǎn)移至HPLC專用樣品瓶中，進樣量為20 μL。

HPLC定量分析泛醌組分，通常采用外標法,根據(jù)峰面積來定量[13]。因為本試驗為定性分析試驗，所以將相對峰面積值作為指標，比較不同菌株間醌組分含量。具體是將每1 mg干菌體所對應(yīng)醌組分的峰面積值進行比較，按公式(1)計算：

(1)

式中：峰面積單位，AU × min；進樣體積，μL；總樣體積，μL；干重，g。

2結(jié)果與分析

2.1供試菌株選擇

細菌或酵母的類異戊二烯醌成分可能為多種醌的混合物，然而通常只有一種為主要成分[14]。以《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》和《The yeasts : a taxonomic study》為主要參考依據(jù)進行檢索，在屬水平上，統(tǒng)計以泛醌為主要或唯一醌型的菌株數(shù)量，結(jié)果如圖1所示。細菌涉及的泛醌類型主要有Q-8、Q-9、Q-10三種，且主要分布于變形菌門(Proteobacteria)的α，β，γ-變形菌綱，其中α-變形菌綱以Q-10為主，β-變形菌綱以Q-8為主，γ-變形菌綱多數(shù)以Q-8，少數(shù)以Q-9為主。酵母中涉及的泛醌類型較多，包括Q-5、Q-6、Q-7、Q-8、Q-9、Q-10和Q-10 (H2)。其中，以Q-9為主要醌型的菌株最多，其次是Q-10，其他如Q-6、Q-8 和Q-7水平較相近，而Q-5和Q-10 (H2)涉及的屬最少。

圖1　泛醌分布情況Fig. 1　Distribution of ubiquinones

整體來看，細菌和酵母中主要的泛醌類型包括Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10五種，細菌的參比菌株只能提供Q-8、Q-9和Q-10三種醌型，因此Q-6、Q-7醌型的參比菌株從酵母菌中選擇。所有供試菌株選自屬水平上以某種泛醌為主要醌型的菌株： Q-8醌型菌株自嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和馬賽菌屬(Massilia)中選擇，Q-9醌型菌株自假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和鹽單胞菌屬(Halomonas)中選擇，Q-10醌型菌株自亞細亞菌屬(Asaia)、紅細菌屬(Rhodobacter)和螯臺球菌屬(Chelatococcus)中選擇，Q-6醌型菌株自有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)中選擇，Q-7醌型菌株自伊薩酵母屬(Issatchenkia)選擇。

再對所選菌株的培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、需氧性)以及培養(yǎng)時間進行初步篩選，從中選擇所需培養(yǎng)基成分簡單、不嗜熱或不嗜冷、好氧生長的菌株。菌株信息及培養(yǎng)條件見表1。所有菌株均是由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供的出具菌種證明(Certificate of Analysis，COA)的菌株。

2.2供試菌株泛醌組分分析及含量比較

2.2.1供試菌株泛醌組分分析

采用HPLC法對上述11株菌的醌組分進行測定，并根據(jù)前期對該HPLC分析條件下保留時間的研究(表2)，進行醌成分判定。

表1　供試菌株信息

表2　Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10的保留時間

HPLC分析結(jié)果(表3)顯示，CICC 1631和CICC 31691均只有1個吸收峰，保留時間分別為8.542和8.546 min，由表2可判定該唯一泛醌組分為Q-6。CICC 1817只有1個吸收峰，其保留時間為9.552 min，由表2可判定該唯一泛醌組分為Q-7。CICC 23896和CICC 23887均只有1個吸收峰，保留時間分別為13.013和12.988 min，由表2可判定該唯一泛醌組分為Q-8。CICC 23895 和CICC 23885均只有1個吸收峰，其保留時間分別為18.167和18.185 min，由表2可判定該唯一泛醌組分為Q-9。CICC 23878具有2個吸收峰，主成分(75.06%)的保留時間為18.191 min，次要成分(24.94%)的保留時間為13.041 min，由表2可判定該菌以Q-9作為主要醌組分，Q-8作為次要醌組分。CICC 23879、CICC 10287和CICC 10545均只有1個吸收峰，保留時間分別為25.716、25.703和25.641 min，由表2可判定該唯一泛醌組分為Q-10。

2.2.2供試菌株泛醌主成分含量比較

根據(jù)1.6所述方法，比較供試菌株間同種醌組分的相對峰面積值(圖2)?？梢钥闯?，CICC 31691與CICC 1631相比，前者Q-6含量略高于后者。CICC 1817(Q-7)沒有與之醌型相同的菌株，但是該菌的相對醌含量與其他供試菌株相比處于中等水平。CICC 23887與CICC 23896與相比，前者Q-8的相對含量是后者的2.4倍。CICC 23878、CICC 23895和CICC 23885相比，CICC 23878中Q-9的相對含量最高；將另2株具有單一泛醌組分的CICC 23895與CICC 23885相比可發(fā)現(xiàn)，前者含量較高。CICC 23879、CICC 10287和CICC 10545相比，CICC 10287中Q-10的相對含量要遠高于其他2株菌。

表3　供試菌株泛醌組分保留時間

圖2　菌株泛醌含量比較Fig.2　Comparison of the content of ubiquinones

2.3參比菌株的確定

試驗過程中，所有菌株在其相應(yīng)培養(yǎng)條件下，均能快速生長，培養(yǎng)時間均不超過24 h。所有在生長性能方面菌株間無明顯差異。因此根據(jù)醌組分含量分析結(jié)果，尋找相對含量較高的、具有單一泛醌組分的參比菌株，Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10每種醌型分別對應(yīng)確定一株參比菌株(表4)，其中Q-6醌型菌株為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)CICC 31691，Q-7醌型菌株為東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)CICC 1817，Q-8醌型菌株為眼馬賽菌(Massiliaoculi)CICC 23887，Q-9醌型菌株為日本假單胞菌(Pseudomonasjaponica)CICC 23895，Q-10醌型菌株為類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)CICC 10287。

表4　參比菌株信息

3討論

泛醌具有重要的分類意義，其類異戊二烯醌側(cè)鏈長度及氫飽和度差異的情況，可以反映細菌或酵母的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并作為描述分類單位特征以及與其他分類單位關(guān)系的參考指標。目前采用HPLC分析測定泛醌組分，需要以標準品或可靠菌株中提取到的醌樣品作為對照。由于標準品的價格昂貴、種類不足，以標準菌株作為參照[24]成為研究者的首選方法。參比菌株能作為試驗全程的參照，并且易保存、易擴繁，作為標準品的替代可極大地節(jié)省試驗成本。但現(xiàn)在對于參比菌株的選擇多局限于某一種醌型，缺乏一套整體性的涉及較多醌型的參比菌株。因此本研究經(jīng)大量文獻篩選與供試菌株篩選試驗，最終確定一套培養(yǎng)條件簡單、培養(yǎng)時間短且泛醌(Q-6、Q-7、Q-8、Q-9和Q-10)成分單一、含量較高的參比菌株。

由于細菌中涵蓋的主要泛醌種類只有Q-8、Q-9和Q-10三種，因此Q-6和Q-7醌型的菌株自酵母中選擇。該套參比菌株全部由國家微生物資源平臺工業(yè)子平臺中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供，具有單一醌型及明確的分類地位，可應(yīng)用于酵母或細菌的常規(guī)鑒定及新種的分類鑒定。包括某些同屬菌株的區(qū)分，如在假絲酵母屬(Candida)有醌型記載的155種菌中，以Q-9、Q-7、Q-8和Q-6為唯一醌型的菌株分別占總菌種數(shù)的63%、23%、12%和2%，由于這種差異的存在，泛醌可以作為有利的分析項；也可應(yīng)用于某些不同屬菌株的區(qū)分，如水螺菌屬(Aquaspirillum)菌株，泛醌類型主要分為兩類，一類為Q-8，另一類則為Q-9和Q-10；還可應(yīng)用于不同屬但系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相近菌株的區(qū)分，如醋桿菌屬(Acetobacter)與葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)，二者分別以Q-9和Q-10為主要醌型。此外該套參比菌株中的部分菌株除了作為醌分析的參照，還具有很高的食品、發(fā)酵應(yīng)用價值。如馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)為可食用菌種，可作為奶啤、乳清飲料等產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)的重要菌種[25]。東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物發(fā)酵方面具有很好地應(yīng)用[26]。類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)目前已經(jīng)成為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)Q-10的重要菌株[27]。

本試驗中除了所篩選的單一醌型菌株外，也存在AcinetobacterindicusCICC 23878 這種含2種醌組分，且次要組分比例較高(>20%)，整體醌含量水平也較高的菌株，可以考慮將其作為混合醌型參比菌株來使用。類異戊二烯醌種類繁多，除泛醌外，還有甲基萘醌、脫甲基甲基萘醌(Demethylmenaquinone)等一系列較常見的醌類型。所以，增加參比菌株醌型范圍，提高參比菌株的豐富性對于微生物分類鑒定具有更廣闊的適用性。

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Screening of reference microorganisms strains with typical ubiquinones components

SU Jiao-jiao,ZHAI Lei,ZHANG Lu,YAO Su,CHENG Chi

(China Center of Industrial Culture Collection, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 10015,China)

ABSTRACTUbiquinone (UQ) was a kind of isoprenoid quinones and served as one of the key indexes for microorganism taxonomy and identification. The strains with typical UQ components were measured and analyzed by thin-layer chromatography combined with high performance liquid chromatography (HPLC). A group of reference strains with the characteristics of simple culture condition, uniform composition and high content of UQ were confirmed by comparing growth performance, UQ types and contents of microorganism strains. Those reference strains included Kluyveromyces marxianus CICC 31691, Issatchenkia orientalis CICC 1817, Massilia oculi CICC 23887, Pseudomonas japonica CICC 23895, Rhodobacter sphaeroides CICC 10287, and were used as a reference for Q-6, Q-7, Q-8, Q-9 and Q-10, respectively. Owing to the accuracy of UQ types and the legitimacy of taxonomic status, these strains were used as reference strains for the identification of strains with unknown quinones.Ubiquinone (UQ) was kind of isoprenoid quinones and served as one of the key indexs for microorganism taxonomy and identification. The strains with typical UQ components were measured and analyzed by thin-layer chromatography combined with high performance liquid chromatography (HPLC). Agroup of reference strains with the characteristics of simple culture condition, uniform composition and high content of UQ were confirmed by comparing growth performance, UQ types and contents of microorganism strains. Those reference strains included Kluyveromyces marxianus CICC 31691, Issatchenkia orientalis CICC 1817, Massilia oculi CICC 23887, Pseudomonas japonica CICC 23895, Rhodobacter sphaeroides CICC 10287, and used as a reference for Q-6, Q-7, Q-8, Q-9 and Q-10, respectively. Owing to the accuracy of UQ types and the legitimacy of taxonomic status, these strains were adapted for the identification of strains with unknown quinones as reference strains.

Key wordsubiquinones;strains screening;reference strains

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606009

收稿日期：2015-12-25，改回日期：2016-02-22

第一作者：碩士研究生(程池教授級高級工程師為通訊作者，E-mail：cheng100027@163.com)。