多菌協(xié)同發(fā)酵蘿卜過(guò)程中不同鹽濃度對(duì)菌相的影響

黃道梅,胡露,賈秋思,鄭秀艷,孟繁博,陳曦,李國(guó)林,李詠富,林茂,劉書(shū)亮*

1(貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽(yáng)，550006)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

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多菌協(xié)同發(fā)酵蘿卜過(guò)程中不同鹽濃度對(duì)菌相的影響

黃道梅1,2,胡露2,賈秋思2,鄭秀艷1,孟繁博1,陳曦1,李國(guó)林1,李詠富1,林茂1,劉書(shū)亮2*

1(貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽(yáng)，550006)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

摘要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法結(jié)合變性梯度凝膠電脈(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術(shù)，以自然發(fā)酵12%鹽度的工業(yè)化鹽漬蘿卜為對(duì)照，對(duì)多菌協(xié)同發(fā)酵不同鹽度(8%、10%、12%)工業(yè)化鹽漬蘿卜過(guò)程中(188 d)菌相變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：4種發(fā)酵方式鹽漬水中菌落總數(shù)均維持在105～108CFU/mL左右，并呈現(xiàn)先上升后下降最后緩慢上升至平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。乳酸菌受鹽度影響較大，其數(shù)量隨著鹽度升高而降低，其中自然發(fā)酵鹽漬蘿卜比多菌協(xié)同發(fā)酵蘿卜乳酸菌數(shù)低；酵母菌因其耐鹽性較強(qiáng)受鹽度影響較小，但受溫度影響較大，隨著溫度的升高，其數(shù)量不斷增加，且4種發(fā)酵方式之間酵母菌數(shù)無(wú)明顯差異。4種方式鹽漬蘿卜中的細(xì)菌種類(lèi)及真菌種類(lèi)相似，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括Weissella cibaria、Lactobacillus curvatus、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Halomonas taeanensis等，其中乳酸菌占絕大多數(shù)；優(yōu)勢(shì)真菌包括Kodamaea ohmeri、Debaryomyces sp.、Candida sp.等，酵母菌為主要菌群。發(fā)酵至88 d后，自然發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)略高于多菌協(xié)同發(fā)酵；鹽度的增加明顯抑制了部分細(xì)菌的生長(zhǎng)，使細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量明顯降低。自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵的真菌種類(lèi)在發(fā)酵過(guò)程中無(wú)明顯差異，但酵母菌數(shù)量前者多于后者；不同鹽濃度的酵母菌并無(wú)明顯差異，發(fā)酵28 d，二次加鹽使得酵母菌的種類(lèi)及數(shù)量產(chǎn)生了差異，鹽度的增加抑制了部分酵母菌的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞鹽漬蘿卜；多菌協(xié)同發(fā)酵；菌相；鹽度

泡菜工業(yè)作為我國(guó)蔬菜加工的一大產(chǎn)業(yè)，絕大多數(shù)泡菜是通過(guò)將新鮮蔬菜進(jìn)行鹽漬，待鹽漬發(fā)酵成熟，將鹽漬蔬菜進(jìn)行整形、脫鹽、調(diào)味、灌裝、滅菌等工藝加工制成。鹽漬蔬菜作為泡菜的第一道關(guān)鍵工序，對(duì)泡菜風(fēng)味品質(zhì)的形成尤為重要。由于蔬菜季節(jié)性較強(qiáng)，集中在冬季收獲，絕大多數(shù)泡菜企業(yè)為了滿足市場(chǎng)的大量需求，不得不加大食鹽濃度(通常采用15%左右食鹽濃度)來(lái)達(dá)到延長(zhǎng)鹽漬蔬菜貯藏期的目的。但泡菜生產(chǎn)帶來(lái)的高鹽廢水排放問(wèn)題已不能滿足日益被重視的環(huán)境保護(hù)要求，限制了泡菜行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-3]。為了滿足行業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求和市場(chǎng)需求，低鹽化人工接種發(fā)酵蔬菜將逐漸成為絕大多數(shù)泡菜企業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[4]。

近幾年來(lái)，為了滿足我國(guó)泡菜行業(yè)的發(fā)展需求，國(guó)內(nèi)眾多研究者也開(kāi)始對(duì)泡菜微生物多樣性進(jìn)行研究，為我國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)足有效發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。HYUN-JU EOM等從各國(guó)泡菜發(fā)酵前期中分離出腸膜明串珠菌，證明它是啟動(dòng)泡菜發(fā)酵的主要菌株[5]。HARUT等采用變性梯度凝膠電脈(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術(shù)分析了韓國(guó)泡菜發(fā)酵過(guò)程中的微生物，結(jié)果表明乳酸菌為主要微生物[6]。代道芳實(shí)驗(yàn)表明，傳統(tǒng)培養(yǎng)和PCR-DGGE方法結(jié)合能夠互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，更好地獲得微生物的多樣性[7]。鄭炯等利用PCR-DGGE方法分析了低鹽和高鹽腌制筍中的細(xì)菌多樣性，低鹽的優(yōu)勢(shì)菌多為益生菌，如食竇魏斯氏菌、乳球菌屬、乳酸球菌屬，高鹽的優(yōu)勢(shì)菌則為抗性較強(qiáng)菌屬[8]。本文采用工業(yè)化生產(chǎn)工藝，對(duì)企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)泡菜發(fā)酵過(guò)程中的菌相變化進(jìn)行解析研究，為其生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制和品質(zhì)提升提供數(shù)據(jù)參考和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料與儀器

圓根蘿卜(RaphanussativusL.)、食鹽、鹽漬池：均由某泡菜企業(yè)提供。菌種：植物乳桿菌3m-1(Lactobacillusplantarum3m-1)、植物乳桿菌N2(LactobacillusplantarumN2)、腸膜明串珠菌8m-9(Leuconostocmesenteroides8m-9)、食竇魏斯氏菌SJ14(WeissellacibariaSJ14)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基：改良MRS液體培養(yǎng)基[9]；系列合成培養(yǎng)基(MRS、孟加拉紅、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、BGLB肉湯、VRBA肉湯)，均為生化試劑(BR)。試劑：Tris堿、甲醛、硝酸銀、乙二胺四乙酸二鈉、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、過(guò)硫酸銨、TEMED等均為分析純；液氮；TIANDZ柱式細(xì)菌DNAOUT，購(gòu)于四川省綿陽(yáng)天澤基因工程有限公司；TaqPCR Master Mix、6×Loading Buffer、Marker2000等，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；引物[10](F338-GC、R518、F1427-GC、R1616)由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

LDZX-40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫(yī)療核子儀器廠；PCR儀My CyclerTMThermal Cycler，Bio-Rad；凝膠成像系統(tǒng)Quantity One system，Bio-Rad；Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)Millipore；Thermo BR4i 型冷凍離心機(jī)Thermo Electron Corporation；變性梯度凝膠電泳儀美國(guó)C.B.S. Scientific。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鹽漬蘿卜制作

將蘿卜按某企業(yè)二次鹽漬發(fā)酵工藝放入鹽漬池中進(jìn)行鹽漬發(fā)酵，發(fā)酵7 d時(shí)，將菌株3m-1、N2、8m-9、SJ14以2∶1∶1∶1的比例添加到鹽漬蘿卜中，通過(guò)循環(huán)泵循環(huán)混勻，密封發(fā)酵，并設(shè)置不同鹽濃度(8%、10%、12%)，以自然發(fā)酵(12%鹽)為對(duì)照[11]。

1.2.2樣品及其處理

用潔凈塑料管沿循環(huán)管道伸入鹽漬池底部采集水樣，搖勻分裝-20 ℃保存。取樣時(shí)間點(diǎn)為：0、7、14、21、28、38、48、58、68、78、88、108、128、158、188 d。

1.2.3菌相變化分析

1.2.3.1傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)分析無(wú)菌吸取25 mL樣品于裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，制成10-1稀釋液后于試管內(nèi)進(jìn)行梯度稀釋至適宜稀釋度，進(jìn)行以下各種微生物的分離培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。菌落總數(shù)：參照GB 4789.2—2010；乳酸菌數(shù)：參照GB 4789.35—2010；酵母菌數(shù)與霉菌數(shù)：參照GB 4789.15—2010；大腸菌群計(jì)數(shù)：參照GB 4789.3—2010。

1.2.3.2PCR-DGGE技術(shù)分析參照文獻(xiàn)[13]中略加改動(dòng)：取30 mL蘿卜鹽漬水樣品，2 000 r/min離心5 min，收集上清，8 000 r/min高速離心15 min，棄上清，收集菌體沉淀，收集的菌體用20 mL 0.1 mol/l的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)懸浮，8 000 r/min離心15 min，重復(fù)洗滌3次，洗凈的菌體懸浮在3 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，用移液器吹打后均勻，平均分裝3份于2 mL EP管中，-20 ℃凍存；按照天恩澤真菌DNA提取試劑盒的使用說(shuō)明結(jié)合液氮研磨方法提取微生物總DNA。將提取的總DNA溶液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20 ℃保存?zhèn)溆?；以提取的總DNA為模板，按表1對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)和真菌18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以一次PCR產(chǎn)物為模板按需進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余產(chǎn)物于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；?duì)PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物采用美國(guó)C.B.S. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis System進(jìn)行電泳分離(電泳條件：DGGE變性膠丙烯酰胺濃度8%，變性劑溶液線性梯度40%～50%；電泳程序：60 ℃、200 V預(yù)電泳30 min，60 ℃、120 V電泳16 h/18 h)。電泳完成后，取下膠板先后進(jìn)行固定、銀染、顯影、終止顯影，然后置于凝膠成像儀拍照(圖像用NTSYSpc2.1軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析)，將優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切割收集，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行后續(xù)的回收純化、PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序等步驟，最后測(cè)序結(jié)果通過(guò) BLAST 程序與GenBank基因庫(kù)中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并將序列用MEGA 6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1　真菌和細(xì)菌PCR擴(kuò)增程序

1.2.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)及其圖表繪制采用EXCEL、Origin 8.1、SPSS 19.0、MEGA 6、NTSYSpc 2.1等軟件進(jìn)行處理。

2結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)結(jié)果分析

由圖1可知，在發(fā)酵過(guò)程中，4種發(fā)酵方式的鹽漬池水中的菌落總數(shù)變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵初期快速上升(P<0.05)，14 d時(shí)，達(dá)到最大值，四者均接近108CFU/mL。隨后由于二次鹽漬致使其鹽度驟然升高，抑制了大量微生物的生長(zhǎng)，致使菌落總數(shù)快速下降(P<0.05)，28 d后，隨著微生物對(duì)不同鹽度環(huán)境的慢慢適應(yīng)，菌落總數(shù)開(kāi)始逐漸增加(P<0.05)，58 d后，菌落總數(shù)開(kāi)始逐漸下降(P<0.05)，可能是環(huán)境pH的降低抑制了部分微生物的生長(zhǎng)，發(fā)酵88 d后，隨著鹽漬貯藏時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，環(huán)境溫度的不斷升高使得其他微生物開(kāi)始繁殖且自然發(fā)酵中的微生物種類(lèi)豐富，菌落總數(shù)開(kāi)始增加(P<0.05)。

圖1　不同時(shí)期蘿卜鹽漬水的菌落總數(shù)變化Fig.1　Changes of total bacterial count in salt juice during fermentation

雖然不同發(fā)酵方式菌落總數(shù)的總體變化趨勢(shì)基本一致，但自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵之間、不同鹽度發(fā)酵之間的菌落總數(shù)差異顯著(P<0.05)，其中，在發(fā)酵前期，多菌協(xié)同發(fā)酵大于自然發(fā)酵，在88 d后貯藏期，自然發(fā)酵大于多菌協(xié)同發(fā)酵。提高食鹽濃度可以抑制微生物的生長(zhǎng)，低鹽度鹽漬池水中的菌落總數(shù)高于高鹽度鹽漬池水。

由圖2可知，發(fā)酵初期，由于低溫兼酸性環(huán)境會(huì)抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)，乳酸菌為主要細(xì)菌菌群，乳酸菌數(shù)的變化趨勢(shì)和菌落總數(shù)保持一致，發(fā)酵初期迅速上升(P<0.05)，14 d時(shí)達(dá)到最大，4者均大于108CFU/mL，隨后二次鹽漬致使乳酸菌數(shù)快速下降(P<0.05)，隨后隨著微生物對(duì)不同鹽度環(huán)境的慢慢適應(yīng)，乳酸菌數(shù)開(kāi)始逐漸增加(P<0.05)，68 d后，乳酸菌數(shù)開(kāi)始逐漸下降(P<0.05)，88 d后，乳酸菌數(shù)開(kāi)始增加(P<0.05)，發(fā)酵158 d后乳酸菌數(shù)開(kāi)始下降(P<0.05)。同樣由結(jié)果分析可知，自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵之間、不同鹽度發(fā)酵之間的乳酸菌數(shù)差異顯著(P<0.05)，多菌協(xié)同發(fā)酵大于自然發(fā)酵，低鹽度鹽漬池水中的乳酸數(shù)高于高鹽度鹽漬池水，且不同鹽度對(duì)乳酸菌數(shù)的影響明顯大于菌落總數(shù)。

圖2　不同時(shí)期蘿卜鹽漬水的乳酸菌數(shù)變化Fig.2　Changes of lactic acid bacterial count in salt juice during fermentation

由圖3可知，在發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌數(shù)總體呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，發(fā)酵88～188 d貯藏期，酵母菌數(shù)又呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)。由于酵母菌的耐鹽能力較強(qiáng)，因此，發(fā)酵過(guò)程中的二次鹽漬對(duì)其數(shù)量影響較小，小幅度下降后隨即迅速上升。由結(jié)果分析可知，酵母菌數(shù)并不同于菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)一樣在自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵之間、不同鹽度發(fā)酵之間呈現(xiàn)一定規(guī)律性，且發(fā)酵中后期，4種發(fā)酵方式的酵母菌數(shù)均在105CFU/mL以上，這可能是因?yàn)榻湍妇暮醚跣裕笮偷柠}漬池?zé)o法嚴(yán)格達(dá)到厭氧環(huán)境，從而給酵母菌提供了有利生長(zhǎng)條件。

圖3　不同時(shí)期蘿卜鹽漬水的酵母菌數(shù)變化Fig.3　Changes of yeast count in salt juice during fermentation

由表2可知，發(fā)酵前1周，大腸菌群數(shù)較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸度不斷增加，從而抑制了大腸菌群的生長(zhǎng)，發(fā)酵58 d，4種發(fā)酵方式鹽漬水中的大腸菌群數(shù)均小于0.3 MPN/mL，從而也保證了成熟后鹽漬蘿卜的食用安全性。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，4種發(fā)酵方式鹽漬水中霉菌數(shù)均小于10 CFU/mL。

表2　不同時(shí)期蘿卜鹽漬水的大腸菌群數(shù)

2.2PCR-DGGE檢測(cè)結(jié)果分析

2.2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用液氮研磨結(jié)合真菌DNA提取試劑盒的方法分別對(duì)不同樣品菌體沉淀進(jìn)行微生物總DNA提取。以提取的總DNA為模板，采用引物F338-GC、R518和F1427-GC、R1616分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)和真菌18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4、5。細(xì)菌、真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，特異性好，片段大小接近250 bp，與目標(biāo)條帶(約230 bp)吻合，能夠達(dá)到DGGE分析要求，保證其準(zhǔn)確可靠。

圖4　細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4　Electrophoretogram for the PCR products of bacteria

圖5　真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.5　Electrophoretogram for the PCR products of fungus

由圖4、圖6、表3可知，不同發(fā)酵方式不同發(fā)酵時(shí)期鹽漬蘿卜樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌存在差異，但由優(yōu)勢(shì)細(xì)菌條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果分析可知乳酸菌為鹽漬蘿卜中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，4種發(fā)酵方式鹽漬蘿卜的細(xì)菌豐度呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，這可能與低溫和鹽度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響有關(guān)，發(fā)酵前28 d，4個(gè)池子的細(xì)菌種類(lèi)及其優(yōu)勢(shì)菌株無(wú)明顯差異，隨著二次加鹽量的不同，58 d時(shí)4個(gè)池子的細(xì)菌種類(lèi)及其優(yōu)勢(shì)菌株明顯不同，鹽度較低的細(xì)菌種類(lèi)較為豐富，隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，由于環(huán)境溫度的逐漸升高、鹽漬水中的鹽分逐漸向蘿卜中滲透，受低溫和高鹽抑制的部分微生物開(kāi)始大量繁殖，從而使發(fā)酵后期細(xì)菌種類(lèi)增多。

當(dāng)下，隨著互聯(lián)網(wǎng)5.0時(shí)代的到來(lái)，家電行業(yè)正在飛速的發(fā)展。各種款式多樣、功能豐富的新產(chǎn)品層出不窮，導(dǎo)購(gòu)策略也是紛繁蕪雜。雖然消費(fèi)者們擁有了更多家電產(chǎn)品的選擇空間，但在無(wú)形中的選購(gòu)難度也在大大增加。由此，“嘉電”評(píng)測(cè)項(xiàng)目應(yīng)運(yùn)而生。

表3　四種發(fā)酵方式鹽漬蘿卜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌DGGE

1-12%NaCl;2-對(duì)照；3-8%NaCl;4-10%NaCl圖6　不同發(fā)酵時(shí)期鹽漬水中16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.6　DGGE profile of 16S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

自然發(fā)酵鹽漬蘿卜(12%鹽+未接菌)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要包括Weissellacibaria、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Halomonastaeanensis等，其中Weissellacibaria雖然并未人工添加，卻一直存在于整個(gè)發(fā)酵時(shí)期且基本無(wú)交替變化，這說(shuō)明Weissellacibaria為鹽漬蘿卜中的一類(lèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，具有較強(qiáng)的耐鹽和耐低溫能力；Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius主要出現(xiàn)于發(fā)酵后期，前期無(wú)明顯蹤跡，可能此兩類(lèi)菌株受溫度及鹽度影響較大；Lactobacillusplantarum在發(fā)酵前28 d時(shí)數(shù)量較多，隨著二次加鹽以及發(fā)酵的進(jìn)行，數(shù)量急劇減少至消失，發(fā)酵88 d時(shí)，又開(kāi)始出現(xiàn)，隨著發(fā)酵的延長(zhǎng)再一次增長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；耐鹽能力極強(qiáng)的Halomonastaeanensis在發(fā)酵前88 d一直處于優(yōu)勢(shì)地位，發(fā)酵至158 d時(shí)，數(shù)量開(kāi)始有所減少。

1-12%NaCl;2-對(duì)照；3-8%NaCl;4-12%NaCl圖7　不同發(fā)酵時(shí)期鹽漬水中18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.7　DGGE profile of 18S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(12%鹽+接菌、10%鹽+接菌)在發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等。其中Weissellacibaria一直存在于整個(gè)發(fā)酵時(shí)期且基本無(wú)交替變化；Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius這4類(lèi)細(xì)菌受溫度及鹽度影響較大均活躍在發(fā)酵后期；Halomonastaeanensis變化趨勢(shì)與自然發(fā)酵中一致；12%鹽度中Lactobacillusplantarum變化趨勢(shì)同自然發(fā)酵，而在10%鹽度中一直存且基本無(wú)交替變化。多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(8%鹽+接菌)在發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌較多，除了上述3種鹽漬蘿卜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌外，還出現(xiàn)了Staphylococcus、Lactobacilluspentosus、Lactobacillusacetotolerans，其中Staphylococcus在中后期數(shù)量較多，Lactobacilluspentosus基本上只存在于中期，Lactobacillusacetotolerans只在發(fā)酵88 d時(shí)出現(xiàn)，Weissellacibaria、Halomonastaeanensis、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusplantarum一直存在于整個(gè)發(fā)酵時(shí)期且基本無(wú)交替變化，其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌變化趨勢(shì)與多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(10%鹽+接菌)無(wú)明顯差異。

綜上所述，自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜之間相比較，由于高鹽低溫環(huán)境，在發(fā)酵前中期兩者中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)以及數(shù)量并無(wú)明顯差異，發(fā)酵至88 d后，自然發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)略高于多菌協(xié)同發(fā)酵，但自然發(fā)酵中并未檢測(cè)到Leuconostocmesenteroides的存在或極少量存在。對(duì)比不同鹽度多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜之間，鹽度的增加明顯抑制了部分細(xì)菌的生長(zhǎng)，使細(xì)菌種類(lèi)及數(shù)量明顯降低。

表4　四種發(fā)酵方式鹽漬蘿卜發(fā)酵過(guò)程中真菌DGGE

由圖5、圖7、表4可知，不同發(fā)酵方式不同發(fā)酵時(shí)期鹽漬蘿卜樣品中優(yōu)勢(shì)真菌存在差異，但由優(yōu)勢(shì)真菌條帶測(cè)序比對(duì)結(jié)果分析可知酵母菌為鹽漬蘿卜中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，4種發(fā)酵方式鹽漬蘿卜的真菌豐度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，與細(xì)菌的變化趨勢(shì)存在差異，分析原因可能是大部分酵母菌具有較強(qiáng)的耐鹽能力，其生長(zhǎng)受鹽度影響較小，隨著環(huán)境溫度的逐漸升高，其種類(lèi)及數(shù)量也逐漸升高。

自然發(fā)酵鹽漬蘿卜(12%鹽+未接菌)在整個(gè)過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌主要有Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Saccharomycescerevisiae、Candidasp.、UnculturedDebaryomyces、Kluyveromycesmarxianus、Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中Saccharomycescerevisiae、Debaryomycessp.一直大量在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中且基本無(wú)交替變化，說(shuō)明這兩類(lèi)酵母菌適應(yīng)力極強(qiáng)，受溫度、鹽度影響較??；Debaryomyceshansenii前期未出現(xiàn)，發(fā)酵至28 d時(shí)成為優(yōu)勢(shì)菌群，二次加鹽后受高鹽環(huán)境影響生長(zhǎng)受到抑制，數(shù)量減少至消失，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至158 d時(shí)，又再一次成為優(yōu)勢(shì)菌群；Saccharomycescerevisiae在發(fā)酵88 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，但數(shù)量較少，發(fā)酵至158 d時(shí)繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群；Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi在發(fā)酵58～88 d時(shí)出現(xiàn)且數(shù)量無(wú)明顯差異；Kazachstaniasiamensis發(fā)酵前88 d一直存在且處于優(yōu)勢(shì)地位，但發(fā)酵88 d后開(kāi)始減少至消失。

多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(12%鹽+接菌)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中真菌的種類(lèi)及其變化趨勢(shì)與自然發(fā)酵并無(wú)明顯差異，但各類(lèi)優(yōu)勢(shì)菌的條帶亮度均要低于自然發(fā)酵，這說(shuō)明在人工添加菌株對(duì)其酵母菌的菌群交替并無(wú)顯著影響，但對(duì)抑制酵母菌生長(zhǎng)、減少酵母菌的數(shù)量有一定的作用。

多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(10%鹽+接菌)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌有Debaryomyceshansenii、Candidasp.、Debaryomycessp.、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi等。其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中且處于優(yōu)勢(shì)地位；Wickerhamomycesanomalus、Kodamaeaohmeri發(fā)酵開(kāi)始并未出現(xiàn)，發(fā)酵中期出現(xiàn)，發(fā)酵88 d時(shí)消失不見(jiàn)，發(fā)酵158 d時(shí)再次出現(xiàn)；Debaryomyceshansenii僅出現(xiàn)于發(fā)酵28 d；Candidalactis-condensi僅出現(xiàn)在發(fā)酵58 d且處于優(yōu)勢(shì)。除上述優(yōu)勢(shì)菌群外，Kluyveromycesmarxianus少量存在于發(fā)酵88～158 d；Pichiamanshurica、Myxozymaudenii、UnculturedDebaryomyces在發(fā)酵末期(158 d)少量存在。

多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜(8%鹽+接菌)由于鹽度較低，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌比其他三者多，有Kodamaeaohmeri、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Candidasp.、Kluyveromycesmarxianus、Pichiamanshurica、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中且處于優(yōu)勢(shì)地位；Wickerhamomycesanomalus發(fā)酵28 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，后慢慢消失，發(fā)酵88 d后又出現(xiàn)；Debaryomyceshansenii僅在發(fā)酵28 d時(shí)出現(xiàn)；Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Myxozymaudenii僅在發(fā)酵158 d出現(xiàn)；Saccharomycescerevisiae發(fā)酵88 d時(shí)出現(xiàn)，后慢慢消失；Kluyveromycesmarxianus在發(fā)酵88～158 d時(shí)出現(xiàn)；Pichiamanshurica在發(fā)酵58 d時(shí)出現(xiàn)，隨后慢慢消失，當(dāng)發(fā)酵158 d時(shí)再次出現(xiàn)；Kazachstaniasiamensis在發(fā)酵前88 d一直存在，末期開(kāi)始逐漸消失。

綜上所述，自然發(fā)酵與多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜之間相比，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中兩者在真菌菌群種類(lèi)上無(wú)明顯差異，但多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜由于人工添加的菌株對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，因此在酵母菌數(shù)量上前者多于后者；對(duì)比不同鹽度的多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜之間，發(fā)酵前期并無(wú)明顯差異，發(fā)酵28 d二次加鹽后由于不同的鹽環(huán)境使得酵母菌的種類(lèi)及數(shù)量產(chǎn)生了差異，鹽度的增加在一定程度上抑制了部分酵母菌的增長(zhǎng)。

3結(jié)論與討論

乳酸菌、酵母菌是蔬菜發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸菌產(chǎn)酸使其乳酸含量不斷積累，從而抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，部分酵母菌不斷產(chǎn)生乙醇、酯類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)，賦予獨(dú)特的風(fēng)味，另部分酵母菌會(huì)導(dǎo)致泡菜產(chǎn)膜生花，引起腐敗，研究表明，畢赤酵母屬(Pichiasp.)、假絲酵母屬(Candidasp.)在酸性條件下易產(chǎn)膜，是導(dǎo)致泡菜在貯藏過(guò)程中生花的主要菌群[13-14]。

微生物的生長(zhǎng)很大程度上受環(huán)境因素影響，同一環(huán)境中不同微生物生長(zhǎng)和不同環(huán)境中同種微生物生長(zhǎng)均存在差異[15]。本文中，鹽度、溫度是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，4種發(fā)酵方式鹽漬水中菌落總數(shù)均維持在105～108CFU/mL左右，呈現(xiàn)先上升后下降最后緩慢上升至平穩(wěn)的變化趨勢(shì)；乳酸菌受鹽度影響較大，鹽度高的鹽漬蘿卜比鹽度低的乳酸菌數(shù)低，自然發(fā)酵鹽漬蘿卜比多菌協(xié)同發(fā)酵乳酸菌數(shù)低，這也是自然發(fā)酵、高鹽度發(fā)酵滯后的主要原因之一；酵母菌因其耐鹽性較強(qiáng)受影響較小，但受溫度影響較大，隨著溫度的升高，酵母菌數(shù)不斷增加；發(fā)酵58 d后，均未檢測(cè)到霉菌和大腸菌群的存在，從而保證了成熟鹽漬蘿卜的使用安全性。在發(fā)酵過(guò)程中，提高食鹽濃度雖然能夠抑制部分雜菌的生長(zhǎng)，但同時(shí)抑制了乳酸菌的發(fā)展，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，因此選擇適宜的鹽濃度是關(guān)鍵。

通過(guò)PCR-DGGE對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的菌群變化分析，工業(yè)化鹽漬蘿卜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等，其中乳酸菌占絕大多數(shù)，優(yōu)勢(shì)真菌包括Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Candidasp.、Kazachstaniasiamensis等，酵母菌為主要菌群，這與眾多學(xué)者研究結(jié)果相似[13-18]。

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，Weissellacibaria始終作為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌大量存在，也成為自然發(fā)酵的主要菌群，說(shuō)明Weissellacibaria本身就是鹽漬蘿卜發(fā)酵過(guò)程中的主要發(fā)酵菌株，LEE等[19]通過(guò)DGGE對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期朝鮮泡菜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Weissellaconfuse、Lactobacillussakes、Lactobacilluscurvatus等為微生物群落的主要組成成員, 趙永威等[20]揭示了魏斯氏菌屬為冬瓜腌制過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)種群之一。而腸膜明串珠菌作為添加菌種之一，大量存在于多菌協(xié)同發(fā)酵鹽漬蘿卜的后期過(guò)程中，自然發(fā)酵中僅少量存在，推測(cè)腸膜明串珠菌的添加對(duì)改善風(fēng)味有一定功效，有別于PEDERSON等[21]、EON等[6]由腸膜明串珠菌啟動(dòng)發(fā)酵的研究結(jié)果，可能是腸膜明串珠菌受鹽度影響較大所致。植物乳桿菌作為另一添加菌株廣泛存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，但在58 d時(shí)因受高鹽抑制少量存在于12%鹽度的鹽漬水中。

Candidasp.、Debaryomycessp.這兩類(lèi)酵母菌大量存在于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，研究表明Candidasp.在酸性條件下易產(chǎn)膜，因此發(fā)酵中后期池面產(chǎn)生大量膜狀物，可能與Candidasp.的生長(zhǎng)密切相關(guān)。Kazachstaniasiamensish大量存在于發(fā)酵前88 d，隨著發(fā)酵的完成，開(kāi)始慢慢減少至消失。在多菌協(xié)同發(fā)酵和自然發(fā)酵過(guò)程中，Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Pichiasp.、Kluyveromycesmarxianus等菌不斷交替變化產(chǎn)生的差異，導(dǎo)致最后泡菜風(fēng)味品質(zhì)的差異性。

本文采用工業(yè)化生產(chǎn)工藝，人工強(qiáng)化接種技術(shù)，并首次人工添加食竇魏斯氏菌屬，對(duì)不同鹽濃度泡菜多菌協(xié)同發(fā)酵過(guò)程中菌相變化進(jìn)行解析研究。人工添加的菌株在發(fā)酵過(guò)程中起到了強(qiáng)化發(fā)酵的作用，其中食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)對(duì)不同鹽濃度均有較強(qiáng)的耐受能力，可以作為優(yōu)良發(fā)酵菌株廣泛應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)中。另外，鹽濃度的增加對(duì)鹽漬蘿卜發(fā)酵過(guò)程中微生物的種類(lèi)及數(shù)量都有一定的抑制作用，尤其是細(xì)菌，應(yīng)適當(dāng)降低鹽濃度有助于發(fā)酵過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)，泡菜特殊風(fēng)味的形成。該研究結(jié)果為泡菜的工業(yè)化生產(chǎn)中人工接種技術(shù)的應(yīng)用及產(chǎn)膜生花的防治提供了數(shù)據(jù)參考。

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Effect of different salinity on the microbial community diversity during strains synergism fermentation of pickled radish

HUANG Dao-mei1,2, HU Lu2, JIA Qiu-si2, ZHENG Xiu-yan1, MENG Fan-bo1,CHEN Xi1，LI Guo-lin1, LI Yong-fu1, LI Mao1*, LIU Shu-liang2*

1 (Guizhou Institute of Modern Agricultural Development, Guiyang 550006,China)2 (College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014,China)

ABSTRACTThe traditional cultivate counting method combined with PCR-DGGE technique was adopted in this paper. Industrialized pickled radish with salinity of 12% from natural fermentation was used as control. The microbial community diversity in different salinity radishes from strains synergism fermentation was analyzed. The results showed that strains quantity was maintained at 105～108 CFU/mL in the pickled water from four ways fermentation, and had a trend of increasing in the beginning and then went down and ascended steadily at last. Salinity had great influence on lactic acid bacteria. The lactic acid bacteria count of pickled radishes with high salinity were less than that of pickled radishes with low salinity, and that of pickled radishes from natural fermentation were less than that of pickled radishes from strains synergism fermentation. Yeast had a high ability of salt tolerance, but it was more vulnerable to temperature. By temperature increasing, yeast count was increased continuously. There was no significant difference in four ways fermentation. Using these four modes, bacteria and fungi species in pickled radishes were similar. The main advantage strains included Weissella cibaria, Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Halomonas taeanensis etc., most of them were lactic acid bacteria. The advantage fungi included Kodamaea ohmeri, Debaryomyces sp., Candida sp. etc., wherein yeast were the main microbial community. After 88 days, though the bacteria species during natural fermentation were slightly more compared with strains synergism fermentation, the increase of salinity obviously restrained part of bacterial growing. In fungal species, there was no significant difference between natural fermentation and strains synergism fermentation, but during the whole fermentation, the former fungal count was higher. There was no obvious difference among different salinity pickled radish from strains synergism fermentation during early stage fermentation, however, secondary addition of salinity led to variations of fungal species and its count after 28 days of fermentation. The increase of salinity inhibited the growth of some yeast.

Key wordspickled radish; strains synergism fermention; the microbial community diversity; salinity

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606007

基金項(xiàng)目：黔科合院所創(chuàng)能([2012]4002)；黔科合條(X[2014]4001)；黔科合條(NY[2013]3051)；四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(14NZ0012)

收稿日期：2015-12-24，改回日期：2016-02-25

第一作者：碩士研究生(劉書(shū)亮教授為通訊作者,E-mail：lsliang999@163.com)。