劉沛沛,張震宇,孫付保,周豪
(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)
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酶法產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重組大腸桿菌pepD/pepN基因的敲除及其發(fā)酵優(yōu)化
劉沛沛,張震宇,孫付保,周豪
(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)
摘要L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine, L-Ala-L-Gln),是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的L-谷氨酰胺載體,在臨床醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。為了減少丙谷二肽在生物酶法生產(chǎn)過(guò)程中菌體對(duì)其降解,利用λ Red同源重組系統(tǒng),敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶對(duì)應(yīng)的編碼基因。與野生型菌株相比,雙敲除突變菌株的全細(xì)胞酶活提高了0.29倍。對(duì)該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化,得到最優(yōu)培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖 12、酵母提取物 10、胰蛋白胨 10、(NH4)2SO4 1、KH2PO4 3、K2HPO4 1、MgSO4 0.2;最優(yōu)發(fā)酵溫度為27 ℃ ;最佳反應(yīng)條件為:Gln 200 mmol/L 、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L,反應(yīng)pH 8.5,反應(yīng)溫度25 ℃。在最優(yōu)條件下發(fā)酵36 h,丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到了14.51 g/L 反應(yīng)液,是優(yōu)化前的4.74倍。
關(guān)鍵詞L-丙氨酰-L-谷氨酰胺;大腸桿菌;生物酶法;基因敲除;λ Red同源重組;發(fā)酵優(yōu)化
L-谷氨酰胺(L-Glutmine,L-Gln)是一種條件必需氨基酸[1],通??捎杉∪獾冉M織大量合成,當(dāng)人體處于外傷、手術(shù)或感染等應(yīng)激或病理狀態(tài)時(shí),Gln的代謝加快,內(nèi)源合成的Gln不能滿(mǎn)足機(jī)體的需要,此時(shí)必須外源補(bǔ)充[2-3]。Gln具有維持胃腸黏膜正常組織結(jié)構(gòu)[4]、提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤及抗抑郁性等重要生理功能[2];在畜禽生產(chǎn)方面,適量的Gln可顯著改善斷奶仔豬腹瀉[5-6],減緩肉仔雞老化速度并減少疫苗免疫對(duì)其的傷害[7]。由于Gln單獨(dú)存在時(shí),水溶性差(35 g/L, 20 ℃ ),性質(zhì)不穩(wěn)定,高溫易產(chǎn)生有毒的焦谷氨酸和氨[8],限制了其在臨床上的廣泛使用。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,L-Ala-L-Gln)簡(jiǎn)稱(chēng)丙谷二肽,是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的L-Gln載體,因其具有水溶性好(586 g/L, 20 ℃ )、穩(wěn)定性強(qiáng)、在體內(nèi)能被很快酶解吸收等優(yōu)點(diǎn),使得采用丙谷二肽進(jìn)行靜脈注射可以安全、有效、定量地提供Gln[3]。
目前丙谷二肽的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法[9],普遍存在成本高、合成過(guò)程復(fù)雜、合成條件苛刻、所用試劑有毒、易生成副產(chǎn)物等缺陷,不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。然而,生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽因其具有成本低、污染少、產(chǎn)物得率高等優(yōu)勢(shì),成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。2007年,KAZUHIKO T等人[10]在Bacillussubtilis168中發(fā)現(xiàn)了L-氨基酸連接酶(Lal),此酶能夠催化游離的L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽,利用大腸桿菌過(guò)表達(dá)Lal,發(fā)酵47 h后,丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到24.7 g/L。2011年,YOSHINORI H等[11]克隆表達(dá)了SphingobacteriumsiyangensisAJ2458中的α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶(SAET),該酶能以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(L-Ala-OMe·HCl)和L-Gln為底物催化合成丙谷二肽,且酶的專(zhuān)一性較強(qiáng),副產(chǎn)物較少。2013年,YOSHINORI H等[12]利用重組大腸桿菌過(guò)表達(dá)SAET,實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生物酶法催化生產(chǎn)丙谷二肽,在25 L發(fā)酵規(guī)模下,丙谷二肽濃度達(dá)到320 mmol/L。
本實(shí)驗(yàn)室率先在國(guó)內(nèi)開(kāi)展生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽的研究,將α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶基因(saet基因)置于組成型啟動(dòng)子的控制下,構(gòu)建出了不需添加誘導(dǎo)劑,能催化生產(chǎn)丙谷二肽的重組大腸桿菌[13]。 本文在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的SAET生產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上,敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶的編碼基因(pepD、pepN),在搖瓶水平上探討pepD、pepN基因雙敲除對(duì)SAET表達(dá)的影響,并對(duì)重組大腸桿菌催化生產(chǎn)丙谷二肽進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和質(zhì)粒
本試驗(yàn)所用菌種及質(zhì)粒如表1所示。
表1 所用菌種、質(zhì)粒及其來(lái)源
1.1.2酶和試劑
TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、胰蛋白胨均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;DpnI快切酶、DL5000 DNA Marker及DL10000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物公司(Takara)公司;L-丙氨酰-L-谷氨酰胺購(gòu)自TCI公司;L-谷氨酰胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;鄰苯二甲醛購(gòu)自Sigma公司。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.1.3 引物
所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。敲除及鑒定用引物序列見(jiàn)表2。
1.1.4 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl 10,pH 7.0;固體培養(yǎng)基添加1.8% 瓊脂粉。
初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母抽提物10,胰蛋白胨10,(NH4)2SO45,KH2PO43,K2HPO41,MgSO40.5。
表2 敲除和鑒定用引物
The underlined sequence represents complementary to the sequence on the both ends of theKangene
1.2方法
1.2.1基因敲除用打靶片段的制備
以pKD4為模板,分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物,Taq和PfuDNA聚合酶以1∶1的比例混勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增,DpnI處理后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收,以膠回收產(chǎn)物分別作為打靶片段敲除大腸桿菌JM109的pepD基因和JM109(ΔpepD)的pepN基因。
1.2.2大腸桿菌pepD、pepN基因的敲除
大腸桿菌JM109中pepD和JM109(ΔpepD) 中pepN基因的敲除方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14],驗(yàn)證用菌落PCR的引物對(duì)分別為DY1和DY2、NY1和NY2。
1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)條件
接種1環(huán)重組大腸桿菌至裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h,按4%接種至裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,25 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。
1.2.4完整細(xì)胞生產(chǎn)丙谷二肽的反應(yīng)條件
取2 mL菌液,8 000 r/min離心5 min,去上清液,用等體積的生理鹽水洗滌細(xì)胞,用上述離心方法再次離心,棄上清,留下的菌體作為催化底物反應(yīng)合成丙谷二肽的粗酶源,加入500 μL含有50 mmol/L Gln及50 mmol/L Ala-Ome·HCl、pH 8.0的底物溶液,25 ℃ 反應(yīng)1.5 h,12 000 r/min離心5 min終止反應(yīng),取50 μL反應(yīng)上清液用于丙谷二肽濃度檢測(cè)。
1.2.5 α-氨基酸酯酰轉(zhuǎn)移酶全細(xì)胞酶活的測(cè)定
取2 mL菌液,8 000 r/min 離心5 min,去上清,用等體積的生理鹽水洗滌細(xì)胞,用上述方法再次離心,棄上清,留下的菌體直接作為催化底物反應(yīng)的酶源,加入500 μL含有200 mmol/L Gln及200 mmol/L Ala-Ome·HCl 、pH 8.0 的硼酸-NaOH緩沖液(0.1 mol/L),25 ℃ 反應(yīng)5 min,12 000 r/min離心5 min 終止反應(yīng),取50 μL反應(yīng)上清測(cè)定丙谷二肽濃度。1個(gè)單位酶活定義為:1 min 內(nèi)生成1 μmol 丙谷二肽所需酶量,單位為U;全細(xì)胞酶活定義為單位體積發(fā)酵液每克干菌體的酶活,單位為U/DCW,其中細(xì)胞干重DCW(g/L)=0.54×OD600。
1.2.6丙谷二肽的檢測(cè)
柱前衍生:取50 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品或反應(yīng)液,加入200 μL 甲醇、200 μL 0.1 mmol/L 四硼酸鈉、50 μL衍生劑(20 mg鄰苯二甲醛,1.8 mL甲醇,200 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉,20 μL β-巰基乙醇,混勻)混勻,于37 ℃ 水浴25 min,加入500 μL 流動(dòng)相,過(guò)0.22 μm有機(jī)系膜。
HPLC檢測(cè)色譜條件:色譜柱 SB-AQ C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);柱溫 35 ℃ ;流動(dòng)相:磷酸緩沖液(12.5 mmol/L , pH 7.2) ∶乙腈 = 9∶1;流速 1 mL/min;激發(fā)波長(zhǎng) 338 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 450 nm。
1.2.7發(fā)酵優(yōu)化
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化:包括葡萄糖的濃度、硫酸銨的濃度、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)的濃度以及硫酸鎂的濃度。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交實(shí)驗(yàn):根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果,選取葡萄糖、硫酸銨、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)和硫酸鎂4個(gè)因素,按L9(34)正交表實(shí)驗(yàn)。
(3)發(fā)酵溫度優(yōu)化:發(fā)酵溫度分別為23、25、27、29、31、33 ℃ 。
(4)反應(yīng)條件優(yōu)化:優(yōu)化了反應(yīng)pH (7.5、8.0、8.5、9.0)、反應(yīng)溫度(20、25、30、35 ℃ )及兩種底物濃度配比(丙氨酸甲酯鹽酸鹽濃度為200 mmol/L時(shí),谷氨酰胺的添加濃度為50、100、150、200、250 mmol/L)。
2結(jié)果與分析
2.1大腸桿菌中pepD和pepN基因的敲除
據(jù)報(bào)道,在大腸桿菌中,分別由pepA、pepB、pepD、pepN編碼的4種肽酶對(duì)二肽具有廣譜降解活性[15]。一方面,KAZUHIKO T等人通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌pepA、pepB、pepD、pepN的單缺失型、雙缺失型及多缺失型突變菌株并加入丙谷二肽培養(yǎng),探究單個(gè)或多個(gè)二肽酶和氨肽酶的失活對(duì)丙谷二肽降解的影響,結(jié)果表明,這些突變菌株中的丙谷二肽殘留量較野生菌都有不同程度的提高[10],說(shuō)明這些肽酶對(duì)丙谷二肽都有不同程度的降解活性。另一方面,pepD編碼的肽酶D是一種二肽酶,其只對(duì)二肽有降解活性[16],pepN編碼的氨肽酶是大腸桿菌中主要的氨肽酶[17],因此本實(shí)驗(yàn)首先考慮在大腸桿菌催化生產(chǎn)丙谷二肽的過(guò)程中,敲除pepD、pepN基因,以期減少宿主大腸桿菌對(duì)產(chǎn)物丙谷二肽的降解。本文采用λ Red同源重組系統(tǒng)先后敲除大腸桿菌JM109中的pepD、pepN基因,構(gòu)建雙缺失型突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN),作為SAET表達(dá)的宿主菌株。
首先分別制備pepD和pepN基因敲除的打靶片段。以pKD4為模板,分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物對(duì),擴(kuò)增出一段兩端分別與pepD、pepN基因兩端序列同源的,中間為Kan抗性基因的DNA片段,經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),片段大小與理論值1601 bp、1572 bp一致(圖1),經(jīng)過(guò)DpnI處理及膠回收后,所得的產(chǎn)物即可作為JM109中pepD、pepN基因敲除用打靶片段。
A-pepD基因敲除用打靶片段;B-pepN基因敲除用打靶片段圖1 基因敲除用打靶片段的電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products
將打靶片段分別電轉(zhuǎn)入含有pKD46的大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,涂布Kan/LB平板。挑選平板上長(zhǎng)出的單菌落做菌落PCR鑒定,分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物,電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。若以大腸桿菌野生型菌株為模板時(shí),擴(kuò)增出的條帶理論大小分別為1 458 bp、2 859 bp;若Kan抗性基因替代pepD、pepN基因整合到大腸桿菌的基因組上時(shí),擴(kuò)增出的條帶理論大小為1 589 bp、1 835 bp。通過(guò)平板篩選及菌落PCR鑒定(圖2)可以證明pepD、pepN基因被成功敲除。再將質(zhì)粒pCP20分別轉(zhuǎn)化至陽(yáng)性重組子中,通過(guò)42 ℃ 高溫誘導(dǎo)完成Kan抗性基因的消除及pKD46與pCP20質(zhì)粒的丟失。并分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物做菌落PCR,以進(jìn)一步確認(rèn)Kan抗性基因的消除。若Kan抗性基因從基因組上消除,擴(kuò)增出的條帶理論大小分別為236 bp、441 bp(圖3)。從圖中可以看出,各個(gè)條帶的大小均與理論值一致,即成功敲除大腸桿菌JM109中pepD和pepN基因,構(gòu)建了突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN)。
圖2 大腸桿菌JM109野生型菌株及基因缺失型菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.2 Identification of E.coli JM109 gene knockout by colony PCR(A)泳道1:DL5000 DNA Marker;泳道2、3、4:以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR;泳道5、6、7:以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR(B)泳道1、2:以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR;泳道3、4:以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR;泳道5:DL5000 DNA Marker
圖3 大腸桿菌JM109基因缺失型菌株及Kan抗性消除菌株P(guān)CR電泳圖譜Fig.3 Identification of the elimination of Kan resistance gene by colony PCR(A)泳道1:DL5000 DNA Marker;泳道2:空白對(duì)照;泳道3、4:以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR;泳道5、6:以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR(B)泳道1:DL5000 DNA Marker;泳道2:JM109野生型菌株為模板的菌落PCR;泳道3:以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR;泳道5、6:以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR
2.2敲除菌與原菌全細(xì)胞酶活比較
將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含SAET的質(zhì)粒載體pAMP-phoC-SAET(圖4)分別轉(zhuǎn)化至野生菌和敲除菌中,比較SAET在野生菌和敲除菌中的表達(dá)情況。如表3所示,首先,敲除菌較野生菌,其菌體生長(zhǎng)較慢,有報(bào)道pepA、pepB、pepD、pepN缺失型突變株的生長(zhǎng)比野生型菌株慢[18],一些小肽(如含亮氨酸)會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)[15]。綜合考慮,肽酶缺失導(dǎo)致胞內(nèi)一些肽類(lèi)的累積可能抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng),但目前還不清楚這些肽酶對(duì)胞內(nèi)二肽的整體降解有多大影響[19]。其次,pepD、pepN雙缺失型菌株,其全細(xì)胞酶活較野生菌提高了0.29倍,原因可能是雙突變菌株的生長(zhǎng)較野生菌慢,在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),其OD600也較低,進(jìn)而影響了DCW的值;肽酶D和氨肽酶的失活減少了丙谷二肽的分解,使突變菌株的酶活有所提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,野生菌的pepD和pepN基因的雙敲除,對(duì)SAET催化產(chǎn)丙谷二肽有一定的正向促進(jìn)作用。
圖4 SAET 表達(dá)載體Fig.4 SAET expression vector
重組E.coliOD600值酶活性(U/DCW)JM109/pAMP-phoC-SAET9.1772.33JM109(ΔpepD)/pAMP-phoC-SAET8.0273.5JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET7.9493.33
2.3大腸桿菌生長(zhǎng)曲線及種齡的選擇
種齡對(duì)微生物發(fā)酵周期有著重要影響,發(fā)酵中一般選擇菌種生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)中后期為宜。挑取JM109 (ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET單菌落接種于LB中,菌種OD600與時(shí)間的關(guān)系如圖5所示。菌種接入LB后,4 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,4~12 h為菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此,選擇最佳種齡時(shí)間為10 h。
圖5 重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of recombinant E. coli JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET
2.4重組大腸桿菌發(fā)酵曲線及發(fā)酵時(shí)間的選擇
為了確定合適的發(fā)酵時(shí)間,繪制了重組大腸桿菌的發(fā)酵曲線。如圖6所示,在發(fā)酵36 h之后,丙谷二肽產(chǎn)量沒(méi)有明顯的提高,因此,將重組大腸桿菌的發(fā)酵時(shí)間定為36 h。
圖6 重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET發(fā)酵曲線Fig.6 The fermentation curve of recombinant E. coli JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET
2.5發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化
2.5.1葡萄糖濃度的優(yōu)化
在大腸桿菌中,葡萄糖過(guò)量會(huì)導(dǎo)致溢流效應(yīng),葡萄糖經(jīng)EMP途徑后由代謝支路溢出生成乙酸[20],而乙酸的積累會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)[21]。對(duì)葡萄糖濃度的優(yōu)化(圖7)結(jié)果表明,當(dāng)葡萄糖濃度小于8 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量明顯降低;當(dāng)葡萄糖濃度校大于8 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量逐漸降低,因此,葡萄糖的最佳濃度為8 g/L。
圖7 葡萄糖添加量的優(yōu)化Fig.7 The optimization of carbon source concentration
2.5.2氮源濃度的優(yōu)化
培養(yǎng)基中的氮源能為微生物提供生長(zhǎng)所必需的核苷酸、維生素和礦物質(zhì)元素等。本文優(yōu)化了無(wú)機(jī)氮源硫酸銨的添加濃度,如圖8A顯示,當(dāng)硫酸銨添加濃度大于3 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量逐漸降低,因此,硫酸銨添加量定為3 g/L。
與無(wú)機(jī)氮源相比,有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、游離的氨基酸以外,還含有少量的糖類(lèi),脂肪和生長(zhǎng)因子等。據(jù)報(bào)道,以酵母提取物與胰蛋白胨為有機(jī)氮源時(shí),兩種氮源以1∶1的比例添加時(shí)比單獨(dú)添加一種有機(jī)氮源丙谷二肽產(chǎn)量高[13],因此在優(yōu)化有機(jī)氮源添加量時(shí),以1∶1的比例添加。由圖8B可知,當(dāng)有機(jī)氮源為30 g/L時(shí),即酵母提取物與胰蛋白胨添加量分別為15 g/L時(shí),丙谷二肽濃度最高。
A-無(wú)機(jī)氮源硫酸銨濃度優(yōu)化;B-有機(jī)氮源濃度優(yōu)化(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)圖8 氮源添加量的優(yōu)化Fig.8 The optimization of nitrogen source concentration
2.5.3硫酸鎂質(zhì)量濃度的優(yōu)化
Mg2+處于離子狀態(tài)時(shí),是許多重要酶的激活劑,MgSO4質(zhì)量不但影響基質(zhì)的氧化,還影響蛋白質(zhì)的合成,而硫可以為菌體合成含硫蛋白質(zhì)提供硫源。本實(shí)驗(yàn)考察了MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖9,當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度小于2 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量無(wú)明顯變化,MgSO4質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量相對(duì)較高;當(dāng)MgSO4質(zhì)量補(bǔ)加量超過(guò)2 g/L時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量明顯降低。
圖9 MgSO4質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.9 The optimization of MgSO4 concentration
2.5.4培養(yǎng)基組分的正交實(shí)驗(yàn)
根據(jù)以上單因素優(yōu)化結(jié)果,考察發(fā)酵培養(yǎng)基各組分間的交互作用,選取葡萄糖、硫酸銨、有機(jī)氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)、MgSO4這4因素做正交實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素3個(gè)水平,本實(shí)驗(yàn)選取L9(34)正交表試驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表4,結(jié)果見(jiàn)表5。
表4 正交試驗(yàn)因素水平表
表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Ti為各因素同一水平下丙谷二肽產(chǎn)量總和;Ki為T(mén)i平均值;R為極差,表示各因素不同水平下丙谷二肽產(chǎn)量總和的最大差值。
由極差R值可知各因素對(duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋毫蛩徭V>有機(jī)氮源>硫酸銨>葡萄糖;得到各因素的最佳搭配為:A3B1C1D1。最佳培養(yǎng)基是:12 g/L葡萄糖、1 g/L硫酸銨、10 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、3 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L磷酸氫二鉀、0.2 g/L硫酸鎂。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證,正交實(shí)驗(yàn)所確定的最佳搭配,丙谷二肽產(chǎn)量為5.08 g/L,是優(yōu)化前(3.06 g/L)的1.66倍。
2.6發(fā)酵溫度優(yōu)化
培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和目的基因的表達(dá)有重要影響,溫度除了直接影響發(fā)酵過(guò)程中各種反應(yīng)速率外,還通過(guò)改變發(fā)酵液的物理性質(zhì),間接影響菌體的生物合成。如圖10所示,發(fā)酵溫度對(duì)丙谷二肽的催化生產(chǎn)有較大影響,當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃ 時(shí),所對(duì)應(yīng)的丙谷二肽濃度最高,當(dāng)發(fā)酵溫度高于27 ℃ 時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量快速下降。
圖10 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化Fig.10 The optimization of fermentation temperature
2.7酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化
本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵菌體為粗酶源,催化L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。酶促反應(yīng)條件是影響酶活性的重要因素,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化催化反應(yīng)條件,探索產(chǎn)SAET的最適酶促反應(yīng)條件。
2.7.1反應(yīng)pH優(yōu)化
酶的穩(wěn)定性與其所處環(huán)境的pH緊密相關(guān),環(huán)境的pH會(huì)影響酶分子中相關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài),對(duì)反應(yīng)體系pH值的優(yōu)化結(jié)果如圖11,反應(yīng)體系pH值為8.5時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量最高,因此將酶促反應(yīng)的最適pH定為8.5。
圖11 反應(yīng)液pH的優(yōu)化Fig.11 The optimization of reaction liquid pH
2.7.2反應(yīng)溫度優(yōu)化
溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一方面是溫度升高時(shí),反應(yīng)速率加快;另一方面由于酶是蛋白質(zhì),隨著溫度的升高,酶蛋白容易逐漸變性而失活,引起酶反應(yīng)速率的下降。不同溫度對(duì)SAET催化生成丙谷二肽的影響結(jié)果如圖12,當(dāng)反應(yīng)溫度為25 ℃ 時(shí),丙谷二肽的生成量最高。
圖12 反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.12 The optimization of reaction temperature
2.7.3 底物濃度及其配比優(yōu)化
底物濃度和配比同樣對(duì)酶促反應(yīng)有著重要影響,為了確定最適的底物添加量,將Ala-OMe·HCl固定在200 mmol/L,測(cè)定不同Gln濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響,考察底物濃度對(duì)SAET催化產(chǎn)丙谷二肽的影響,結(jié)果如圖13,隨著Gln添加量的加大,丙谷二肽生成量也不斷提高,在底物濃度比為200∶200 時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量最高。當(dāng)繼續(xù)增加Gln的添加量時(shí),丙谷二肽產(chǎn)量不再提高,因此將Ala-OMe·HCl和Gln最適底物濃度及配比定為200∶200。
圖13 底物配比的優(yōu)化Fig.13 The optimization of the ratio of the two substrates,AlaOMe·HCl and Gln
3結(jié)論
Ala-Gln不僅具有Gln的各種重要的生理功能,且穩(wěn)定性好,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究在本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的SAET表達(dá)菌株基礎(chǔ)上,敲除了宿主大腸桿菌JM109中的肽酶D與氨肽酶對(duì)應(yīng)的編碼基因pepD與pepN,構(gòu)建重組大腸桿菌JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET。突變菌株的全細(xì)胞酶活較野生菌提高了0.29倍。并進(jìn)一步優(yōu)化了重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙谷二肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組分、發(fā)酵溫度及反應(yīng)條件,在最優(yōu)條件下,丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到了14.51 g/L反應(yīng)液,是優(yōu)化前的4.74倍(3.06 g/L),是國(guó)內(nèi)已知生物酶法生產(chǎn)丙谷二肽的最高水平,為丙谷二肽的工業(yè)化生產(chǎn)及國(guó)產(chǎn)化提供了技術(shù)支持。
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The knockout of genespepDandpepNof recombinantEscherichiacoliproducingL-alanyl-L-glutamine and optimization of its fermentation conditions
LIU Pei-pei, ZHANG Zhen-yu, SUN Fu-bao, ZHOU Hao
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)
ABSTRACTL-alanyl-L-glutamine is widely recognized as the L-glutamine carrier and applied in the field of clinical medicine and nutrition.In order to interrupt the degradation of proglumetacin dipeptide in E. coli during the biosynthesis process, the λ Red homologous recombination system was employed to knockout the peptidase D and aminopeptidase corresponding coding genes. Compared with wild-type strains, double knockout mutant strain of whole cell enzyme activity increased 0.29 times. The optimized medium composition contained (g/L): glucose 12,yeast extract 10,bacto tryptone 10,(NH4)2SO4 1,KH2PO4 3,K2HPO4 1,MgSO4 0.2. The optimal cultivation temperature is 27 ℃; the most appropriate reaction conditions are: Gln 200 mmol/L, Ala-Ome·HCl 200 mmol/L, reaction pH value is 8.5, reaction temperature is 25 ℃. Finally, after 36 h fermentation under the optimal conditions, the yield is 14.51 g/L reaction liquid which is 4.74 fold that of the initial codition.
Key wordsL-alanyl-L-glutamine; Escherichia coli; enzymatic; gene knockout; λ Red homologous recombination; fermentation optimization
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606002
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(30970058);國(guó)家自然科學(xué)基金(21176106);工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))開(kāi)放課題基金(KLIB-ZR200801)
收稿日期:2016-01-15,改回日期:2016-03-01
第一作者:碩士研究生(張震宇教授為通訊作者,E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn)。