超聲波轉(zhuǎn)化方法將外源性質(zhì)粒導入甾短桿菌的研究

張慧，楊勝利

（1浙江省質(zhì)量檢測科學研究院，浙江杭州 310018；2浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014）

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超聲波轉(zhuǎn)化方法將外源性質(zhì)粒導入甾短桿菌的研究

張慧1，楊勝利2

（1浙江省質(zhì)量檢測科學研究院，浙江杭州 310018；2浙江工業(yè)大學藥學院，浙江杭州 310014）

摘要:目的:建立甾短桿菌的高效超聲波轉(zhuǎn)化方法，為利用甾短桿菌重組表達功能基因提供方法基礎(chǔ)。方法∶采用超聲波誘導的方法把外源DNA轉(zhuǎn)化進甾短桿菌基因組中。通過對甾短桿菌生長狀態(tài)，超聲波作用條件等影響因素進行探索。結(jié)果∶當采用OD600為0.7的菌體制備感受態(tài)細胞、超聲波強度為400W、作用時間為40min和質(zhì)粒濃度為0.2 g/L時，轉(zhuǎn)化效率達到最大值，為384個轉(zhuǎn)化子/ μg DNA。經(jīng)抽樣PCR鑒定所得到的轉(zhuǎn)化子均為陽性克隆。結(jié)論通過優(yōu)化超聲波轉(zhuǎn)化條件，從而獲得了高效電轉(zhuǎn)化技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞：甾短桿菌；超聲波；轉(zhuǎn)化率

近年來由于功率超聲設(shè)備的普及和發(fā)展，超聲波對生物反應(yīng)過程的影響正引起人們強烈的興趣和高度重視。研究表明：合適強度的超聲波作用于生物反應(yīng)培養(yǎng)液，可增強基因轉(zhuǎn)移效率，增加細胞膜的通透性和選擇性，促進酶的分泌，增強細胞的代謝作用，從而，能縮短反應(yīng)時間，提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。如在乳酸發(fā)酵過程中，采用超聲波處理可以提高發(fā)酵效率［1，2］。在酵母產(chǎn)酒精的研究中也取得了相類似的效果［3，4］，并且在提高乙醇產(chǎn)量的同時，對酵母生長也起到促進作用［5］。盡管利用超聲波作用生物反應(yīng)過程的研究有所報道，但是多集中在乳酸發(fā)酵和乙醇發(fā)酵，超聲促進微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究國內(nèi)外未見文獻報道。本項目擬利用超聲波誘導攜帶膽固醇氧化酶基因的質(zhì)粒分別插入甾短桿菌細胞，以期獲得高產(chǎn)膽固醇氧化酶的菌株，并建立超聲波誘導基因轉(zhuǎn)化的新方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

膽固醇氧化酶生產(chǎn)菌（Brevibacterium sp.），由本實驗室篩選并保存；質(zhì)粒pET28a-choB，由本實驗室自行構(gòu)建。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（蛋白胨∶10g，酵母提取物∶5g，氯化鈉∶10g，水：1L）。

1.1.3主要試劑和儀器

超聲波（定制）無錫雷士超聲波設(shè)備有限公司；ABI公司2720型PCR儀；ALPHA2200 Imager凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2感受態(tài)細胞的制備

菌種于LB培養(yǎng)基中，200r/min，30℃振蕩培養(yǎng)一定時間，12000r/min，10min，4℃離心收集細胞，制備超聲波轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。

1.3大腸桿菌超聲波轉(zhuǎn)化方案

超聲波轉(zhuǎn)化中，取40μL的甾短桿菌感受態(tài)細胞，加入適量質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度100ng/μL）；二甲基亞砜作為緩沖液，調(diào)至質(zhì)量分數(shù)1%；溫度調(diào)至30℃；pH調(diào)至7.0；超聲波場強為200～500W，處理時間為20～50min。

1.4陽性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

當轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到含Kan和Cam的LB平板上進行篩選，隨機選取轉(zhuǎn)化平板上的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，以其為模板，采用特異性引物進行PCR驗證。所用引物：5'-TTCCATGGCC?GATAGCCGGGCGAACAG-3'和 5'-GCGAATTCT?CACTGGATGTCGGACGAGATGA-3'。PCR反應(yīng)條件為∶94℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5min。凝膠電泳檢測重組載體是否插入甾短桿菌基因組。

1.5誘導表達

挑取陽性克隆單菌落并接種于4mL含有濃度為50μg／mL Cam和50μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于30℃，200r／min震蕩過夜。取1mL培養(yǎng)物，將其轉(zhuǎn)接于50mL含有濃度為50μg／mLCam和50μg／mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中30℃、200 r／min震蕩培養(yǎng)至菌體濃度OD600約為0.7。向培養(yǎng)物中加入1mmoL／L的IPTG誘導培養(yǎng)。收集菌體供電泳分析及酶活力測定。

1.6菌體破碎

12，000r／min，4℃離心5 min收集菌體后，用50mmol/L的pH7.5的磷酸洗滌懸浮菌體，超聲波破碎儀500w，工作10s，間歇5s，99個循環(huán)，破碎菌體。4℃12，000r／min離心15 min去除細胞碎片沉淀，取上清酶活分析。

1.7酶活力測定

3mL溶液A（疊氮鈉，0.2g/L；4-氨基-安替比林，1mmoL／L；苯酚，6mmoL／L；過氧化物酶，5，000U／L；磷酸鉀緩沖液，25mmoL／L，pH7.5），150μL溶液 B（膽固醇，8.26g/L；Triton X-100，4.26%；異丙醇為溶劑），50μL酶液，37℃，反應(yīng)5min，沸水浴3min，于500nm測吸光值。酶活（U／mL）= 1.6832×A500。

酶活力單位定義：37℃，1min轉(zhuǎn)化1μmol膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮的酶量定義為1個酶活單位（U）。

2　結(jié)果

2.1甾短桿菌不同生長時期對轉(zhuǎn)化效率的影響

細胞能夠從周圍環(huán)境中攝取DNA分子，并且不易被細胞內(nèi)的限制性核酸內(nèi)切酶分解時所處的一種特殊生理狀態(tài)稱稱為感受態(tài)。為確定甾短桿菌制備感受態(tài)細胞的最佳生長時期，分別在甾短桿菌培養(yǎng)OD600值為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8后，制備感受態(tài)細胞，將不同生長時期制備的感受態(tài)細胞與100ng的質(zhì)粒DNA在300W的超聲場強度下進行超聲波轉(zhuǎn)化。實驗結(jié)果表明：OD600值為0.7培養(yǎng)物制備的感受態(tài)細胞超聲波轉(zhuǎn)化效率最高，能達到241個轉(zhuǎn)化子/μgDNA（圖1）。

圖1　不同生長時期甾短桿菌的超聲波轉(zhuǎn)化效率

2.2超聲波強度對轉(zhuǎn)化效率的影響

圖2　超聲波強度對轉(zhuǎn)化效率的影響

100ng質(zhì)粒DNA加入OD600值為0.7的甾短桿菌感受態(tài)細胞，分別在200W、250W、300W、350W、400W、450W和500W的7種不同超聲場強度下進行轉(zhuǎn)化。結(jié)果見圖2，在400W的電場強度下的電轉(zhuǎn)化效率最高可達289個轉(zhuǎn)化子/μg DNA。當超聲場強度超過400W時超聲轉(zhuǎn)化效率隨著超聲場強度增大而逐漸降低。

2.3超聲波作用時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

固定甾短桿菌培養(yǎng)OD600值為0.7，超聲場強度為400W，細胞分裝體積為40μL，預(yù)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒為0.1μg，分別選取超聲波時間，設(shè)置不同水平進行超聲波轉(zhuǎn)化試驗，結(jié)果見圖3。超聲波處理時間為40min時轉(zhuǎn)化效率最高為356個轉(zhuǎn)化子/μgDNA），隨著超聲波處理時間的延長，轉(zhuǎn)化效率增加，當超聲波處理時間超過40min時，轉(zhuǎn)化效率開始下降。

圖3　超聲波處理時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4DNA濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

采用上述優(yōu)化的實驗條件，大腸桿菌經(jīng)培養(yǎng)OD600值為0.7后制備感受態(tài)細胞，分別加入不同量的質(zhì)粒DNA，在400W的超聲場強度下進行超聲轉(zhuǎn)化。結(jié)果見圖4，DNA量在0.01～1μg，轉(zhuǎn)化效率隨DNA量的增加而迅速增加，當DNA量達到0.2g/L時，轉(zhuǎn)化效率增加趨勢趨于平緩，達到384個轉(zhuǎn)化子/μgDNA。

圖4　質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5大腸桿菌超聲波轉(zhuǎn)化子的檢測和分析

由于質(zhì)粒pET28a-choB攜帶膽固醇氧化酶基因，故轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆可以將其周圍培養(yǎng)基中的膽固醇轉(zhuǎn)化成膽甾-4-烯-3-酮，從而使菌落周圍出現(xiàn)透明圈。隨機挑取具有透明圈的菌落，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用酶切質(zhì)粒，進行核酸凝膠電泳，結(jié)果見圖5。由圖5可知，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒大小接近于1700 bp，與膽固醇氧化酶基因大小一致，說明轉(zhuǎn)化成功。

圖5　轉(zhuǎn)化子的PCR驗證

2.6酶活鑒定及穩(wěn)定性研究

按照“材料與方法”所述，在添加了適當濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子至菌體濃度OD600為0.7左右時，向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1mmol／L，誘導培養(yǎng)4h。收集菌體，破碎細胞后，測定酶活力。同時以Brevibacterium sp.，未經(jīng)IPTG誘導的陽性轉(zhuǎn)化子為對照分別測定酶活力，酶活測定結(jié)果見表1。

表1　膽固醇氧化酶活力測定結(jié)果

為檢測質(zhì)粒pET28a-choB在超聲波轉(zhuǎn)化甾短桿菌轉(zhuǎn)化子中的遺傳穩(wěn)定性，將轉(zhuǎn)化子在不含Kan和Cam的LB平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，隨機挑取100個單菌落轉(zhuǎn)接到Kan和Cam的LB平板上，未發(fā)現(xiàn)抗性消失的菌落。隨機選取5個菌落，經(jīng)PCR擴增和測序驗證，結(jié)果與超聲波轉(zhuǎn)化子驗證一致。表明pET28a-choB質(zhì)粒能在甾短桿菌中穩(wěn)定遺傳。

參考文獻：

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Study on exogenous plasmids transformed into Brevibacterium sp. by ultrasonic

ZHANG Hui1，YANG Sheng-li2
（1Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou Zhejiang 310018；
2The College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou Zhejiang 310014）

Abstract:Objective∶A high efficient method of ultrasonic transformation was established to provide the basis for expressing the functional genes in Brevibacterium sp.Methods∶The method used to extraneous DNA was transformed into Brevibacterium sp.genome by ultrasonic transformation.The main factors that affect the transformation efficiency were explored and optimized.Results∶The optimal conditions for ultrasonic transformation of Brevibacterium sp.were obtained with the maximum transformation efficiency of 384 transformants/μg plasmid DNA when the Brevibacterium sp.cells of OD600 to 0.7 were used for competent cells，and the ultrasonic treatment were under the conditions of field intensity of 400W，40min and 0.2 g/L plasmid DNA.All the transformants were confirmed to be positive clones.Conclusion The highly effective transformation technique was obtained through optimizingthe ultrasonic transformation conditions.

Keywords:brevibacterium sp.；ultasonic；transformation efficiency

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.007

中圖分類號：R965.2

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1267（2016）01-0019-04

收稿日期：2015-09-06

基金項目：浙江省科技廳公益項目（2014C32034）

通信作者：楊勝利（1972-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。