芪黃疽愈方對(duì)大鼠肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥的實(shí)驗(yàn)研究

張　欣　劉　遠(yuǎn)　葛建立*　宋易華　馬云龍　李曉東

(1. 河北省中醫(yī)院外科，石家莊 050001； 2. 石家莊市中醫(yī)院脈管科，石家莊 050001)

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芪黃疽愈方對(duì)大鼠肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥的實(shí)驗(yàn)研究

張欣1劉遠(yuǎn)1葛建立1*宋易華1馬云龍1李曉東2

(1. 河北省中醫(yī)院外科，石家莊 050001； 2. 石家莊市中醫(yī)院脈管科，石家莊 050001)

【摘要】目的 建立動(dòng)物模型，觀察芪黃疽愈方對(duì)大鼠肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis occlusive disease，ASO)的治療作用。方法60只Wistar 大鼠采用高脂飲食喂飼聯(lián)合隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的方法制作大鼠 ASO 模型，以西洛他唑?yàn)閷?duì)照，觀察芪黃疽愈方各濃度組對(duì)大鼠血脂、血流變指標(biāo)的不同影響。結(jié)果中藥高濃度組、西藥組大鼠血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇，全血黏度(高切、低切) 、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞剛性指數(shù)均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 中藥高濃度組、西藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論芪黃疽愈方可改善脂質(zhì)代謝紊亂，降低血脂水平，改善血流變，達(dá)到治療肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥的目的。

【關(guān)鍵詞】芪黃疽愈方；動(dòng)脈硬化閉塞癥；血脂；血流變；實(shí)驗(yàn)研究

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis occlusive disease，ASO)主要由下肢動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化性改變而引起患者動(dòng)脈狹窄或閉塞，局部組織缺血、缺氧或壞死及高凝狀態(tài)導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙所致[1]。近年來(lái)，隨著發(fā)病率增高，中西醫(yī)結(jié)合治療下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥被越來(lái)越多的患者所接受。芪黃疽愈方治療下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥是多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，現(xiàn)為探討其科學(xué)性，筆者以大鼠為動(dòng)物模型，從實(shí)驗(yàn)角度研究其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10個(gè)月齡清潔級(jí) Wistar 大鼠60只， 體質(zhì)量(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):1504024。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

生化分析儀(日立7600-020生化儀)、血流變分析儀(眾馳偉業(yè) ZL9000plus)。

1.3藥物

1)高脂飼料(配比為83.5%基礎(chǔ)飼料，5%豬油，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉及10%蛋黃粉[2]，其中：膽固醇、膽酸鈉、蛋黃粉均購(gòu)于石家莊市勃盛化學(xué)試劑有限公司，豬油購(gòu)于市場(chǎng))。

2)注射用前列地爾干乳劑(重慶藥友制藥有限公司)；西洛他唑片(浙江大冢制藥有限公司)；維生素D3注射液(上海通用藥業(yè))。

3)中藥芪黃疽愈方(黃芪20 g、黃精12 g、紅花12 g、鬼箭羽12 g、土鱉蟲9 g、雞血藤15 g、延胡索12 g、牛膝9 g、海藻12 g)，按原方的組方比例，并根據(jù)體表面積的比率折算出200 g 大鼠的等效用藥劑量作為其用量，另取其1/2劑量和2 倍劑量作為芪黃疽愈方低濃度和芪黃疽愈方高濃度組，于河北省中醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)買飲片，并請(qǐng)河北省中醫(yī)院藥劑科主任鑒定， 符合《中華人民共和國(guó)藥典》 (2005 版) 各項(xiàng)的規(guī)定，由河北省中醫(yī)院煎藥室煎制， 4 ℃冰箱保存，芪黃疽愈方組的最終濃度為:生藥0.75 g/mL,低濃度組為：生藥0.35 g/mL，高濃度組為：生藥1.5 g/mL，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每次中藥制劑均按同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1)模型制作： 聯(lián)合采用高脂飲食喂飼及隱動(dòng)脈內(nèi)膜損傷的方法制作大鼠 ASO 模型[3]。①實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周， 排除飲食異常大鼠，高脂飼料喂養(yǎng)1周。②于清潔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊苯巴比妥鈉(1 mL/200 g) 腹腔注射麻醉，每只大鼠取左后肢消毒，從腹股溝中點(diǎn)向后肢內(nèi)側(cè)縱行切開皮膚，分離并暴露隱動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾阻斷隱動(dòng)脈遠(yuǎn)近端約1.5 ～ 2.0 cm，取胰島素注射器1支，沿隱動(dòng)脈血管長(zhǎng)軸由遠(yuǎn)端向近端刺入血管腔，將0.2～0.3 mL注射用無(wú)菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，至血管充盈為止，5 min后取下針頭和動(dòng)脈夾，壓迫止血，縫合切口，內(nèi)膜損傷模型完成，共造模50只大鼠。

2)實(shí)驗(yàn)分組：采用數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組10只。模型組、芪黃疽愈方高濃度組、芪黃疽愈方低濃度組、芪黃疽愈方中濃度組、西藥組、空白組。

3)給藥方法： 空白組：普通飲食喂養(yǎng)，自由飲水。模型組：高脂飼料喂養(yǎng)，并且在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105μ/kg)，每隔30 d重復(fù)一次；給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(1 mL/100 g大鼠)灌胃，每日1次，連續(xù)12周，自由飲水。中藥組(芪黃疽愈方低濃度組、芪黃疽愈方中濃度組、芪黃疽愈方高濃度組)：高脂飼料喂養(yǎng)，并且在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105μ/kg)，每隔30 d重復(fù)1次；給予前列地爾0.4 μg·kg-1·d-1腹腔注射，每日1次，持續(xù)2周；各組給予相應(yīng)濃度中藥灌胃(1 mL/100 g大鼠)，每日1次，連續(xù)12周，自由飲水。西藥組：高脂飼料喂養(yǎng)，并且在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105μ/kg)，每隔30 d重復(fù)1次；給予前列地爾0.4 μg·kg-1·d-1腹腔注射，每日1次，持續(xù)2周；西洛他唑(18 mg/kg)灌胃，每日 1次，連續(xù)12周，自由飲水。

1.5標(biāo)本采集及處理方法

麻醉大鼠方法同前，腹部消毒，剪開皮膚，由腹主動(dòng)脈采血2 ～ 4 mL用于血脂檢測(cè)，4 ～5 mL用于血流變學(xué)檢測(cè)。

1.6指標(biāo)檢測(cè)

血脂測(cè)定：在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定總膽固醇(total cholesterol， TC)、三酰甘油(triglyceride， TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)。

血流變測(cè)定：使用血流變分析儀分析各標(biāo)本全血黏度(高切、低切) 、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞剛性指數(shù)等指標(biāo)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1芪黃疽愈方對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥模型大鼠血脂的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、中藥高濃度組大鼠血清TC、TG、LDL-C下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與西藥組比較，中藥高濃度組血清TC、LDL-C、TG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而針對(duì)大鼠血清HDL-C，各組進(jìn)行兩兩比較，中、高濃度組指標(biāo)升高明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),與西藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1。

2.2芪黃疽愈方對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥模型大鼠血流變的影響

2.2.1芪黃疽愈方對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥模型大鼠全血黏度的影響

模型組全血黏度各切變率值均較空白組升高(P<0.01),提示血液黏度明顯增高。給予芪黃疽愈方的中藥組其全血黏度各切變率值均降低,以高濃度組作用更明顯(P<0.05)，其中低切變率隨中藥濃度升高，效果越好；中切變率數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出模型組全血黏度升高，治療組降低的趨勢(shì)。西藥組也有降低全血黏度的作用(P<0.01),且西藥組與高濃度組比較，各切變率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示芪黃疽愈方組降低全血黏度作用與西藥組相當(dāng)，詳見(jiàn)表2。

2.2.2芪黃疽愈方對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥模型大鼠高切指數(shù)及低切指數(shù)的影響

與空白組比較,模型組高切指數(shù)及低切指數(shù)升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予芪黃疽愈方中藥后,兩組數(shù)值均降低,其中以芪黃疽愈方高濃度組作用明顯(P<0.01);西藥組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但與芪黃疽愈方高濃度組差異不大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2。

2.2.3芪黃疽愈方對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥模型大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)的影響

模型組紅細(xì)胞聚集指數(shù)均高于空白組,提示模型組大鼠血流變學(xué)的異常。與模型組比較,芪黃疽愈方中濃度、高濃度、西藥組都與模型組有差別，均比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2。

表1大鼠血脂檢測(cè)結(jié)果

Tab.1The result of rats serum lipids test

GroupTCTGHDL-CLDL-CVLDL-CControl1.80±0.080.72±0.090.63±0.081.03±0.080.43±0.07Model2.98±0.55**1.44±0.31**0.43±0.06**2.27±0.38**0.80±0.13**Lowdose2.75±0.14#0.89±0.08##0.42±0.08#2.21±0.17#0.76±0.15#Middledose2.51±0.38##0.82±0.07##0.46±0.06#2.04±0.16#0.69±0.07#Highdose2.24±0.16##0.76±0.07##0.50±0.09##1.72±0.22##0.59±0.08##Westernmedicine2.26±0.27##0.83±0.14##0.47±0.04##2.05±0.09##0.69±0.07##

**P<0.01vscontrol,#P<0.05，##P<0.01vsmodel group; TC：total cholesterol； TG：triglyceride； HDL-C：high density lipoprotein cholesterol； LDL-C：low density lipoprotein cholesterol; VLDL-C：very low density lipoprotein cholesterol.

表2大鼠血流變檢測(cè)結(jié)果

GroupWBVisc.(1s-1)WBVisc.(5s-1)WBVisc.(30s-1)WBVisc.(200s-1)WBRLV(H)WBRLV(L)EAIESIControl14.23±2.147.86±0.975.56±0.444.27±0.333.32±0.2413.99±1.694.69±0.084.34±0.39Model22.02±2.29**10.85±0.98**7.37±1.76**6.09±1.52**5.03±1.33**16.73±1.77**5.84±1.21**5.42±0.94**Lowdose17.26±2.43##9.54±0.52#6.91±1.41#5.03±1.38#4.26±0.92#15.20±2.37#5.52±0.71##4.65±0.20##Middledose17.10±2.26##9.07±1.24#6.85±1.12#4.78±0.80##3.72±0.60##14.53±2.78#4.44±0.66##4.81±0.58##Highdose16.00±1.13##8.69±0.24##6.11±0.75#4.33±0.44##3.22±0.66##14.35±0.76#4.46±0.21##4.17±0.16##Westernmedicine15.68±1.96##7.81±0.88##7.22±0.48#4.08±0.68##3.16±0.62##14.43±2.09#4.68±0.96##4.15±0.63##

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel group;WBVisc.(1 s-1)：whole blood viscosity(1 s-1); WBVisc.(5 s-1):whole blood viscosity(5 s-1); WBVisc.(30 s-1): whole blood viscosity(30 s-1); WBVisc.(200 s-1): whole blood viscosity(200 s-1); WBRLV(H):whole blood relative viscosity at high-shear rate; WBRLV(L) :whole blood relative viscosity at low-shear rate; EAI: erythrocyte aggregation index; ERI: erythrocyte rigidity index.

4討論

目前，對(duì)于ASO動(dòng)物模型，學(xué)術(shù)界尚未達(dá)成統(tǒng)一，近年來(lái),運(yùn)用兔子、小鼠、大鼠、鵪鶉等成功地建立了大量高脂飼料、單純藥物、高脂飼料加藥物、基因敲除鼠及基因工程模型等誘導(dǎo)的動(dòng)物模型[4]。但大鼠具有飼養(yǎng)方便、抵抗力強(qiáng)，食性與人相近的特點(diǎn)，能在短時(shí)間內(nèi)制成ASO模型，且能較好地模擬人ASO的病理變化。車兆義等[3]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，蒸餾水損傷動(dòng)脈內(nèi)膜加高脂、高膽固醇等飼料喂養(yǎng)可較快形成與人動(dòng)脈硬化閉塞癥相似的、較成熟的大鼠動(dòng)脈硬化閉塞癥模型。

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的主要原因是膽固醇沉積于血管內(nèi)膜，形成脂質(zhì)斑塊，使管腔狹窄，嚴(yán)重時(shí)斑塊破裂出血，血栓形成，使管腔完全或不完全阻塞，相應(yīng)的組織器官發(fā)生缺血或缺血性壞死，從而發(fā)生嚴(yán)重的心血管事件(cardiovascular events, CVE)[5]。肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥是動(dòng)脈粥樣硬化在四肢的表現(xiàn)，是臨床主要表現(xiàn)為肢體缺血及微循環(huán)障礙的一種慢性疾病。臨床主要表現(xiàn)為：肢體發(fā)涼、麻木、間歇性跛行、靜息痛，甚至發(fā)生壞疽，積極尋求有效的治療方法對(duì)于緩解患者臨床癥狀、控制和延緩ASO的發(fā)展有著重要的意義。

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥屬于中醫(yī)“脫疽”范疇。明代陳實(shí)功的《外科正宗·脫疽論》[6]：“夫脫疽者,外腐而內(nèi)壞也,此因平昔厚味膏粱熏蒸臟腑,丹石補(bǔ)藥消爍腎水,房勞過(guò)度,氣竭精傷”是對(duì)動(dòng)脈硬化閉塞癥的形象描述。對(duì)于其治療，歷代醫(yī)家均有研究記載?！鹅`樞·癰疽篇》“……急斬之，則不死矣”；唐代孫思邈在《千金翼方》有“在肉則割，在骨則切”的主張；薛已《外科樞要》[7]對(duì)脫疽一病有非常詳細(xì)的論述，除內(nèi)服藥物外，還采用針灸、手術(shù)、外用藥等療法，且附驗(yàn)案數(shù)個(gè)?，F(xiàn)代秦學(xué)賢提出消、托、補(bǔ)三法治療動(dòng)脈硬化閉塞癥的不同階段[8]。侯玉芬等[9]應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯加減口服兼外洗配合溶栓膠囊治療，療效明顯。

芪黃疽愈方是本科三十多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，針對(duì)脫疽病氣陰兩虛、經(jīng)絡(luò)癥積瘀結(jié)的病證，西醫(yī)主要為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥，或兼糖尿病的患者，經(jīng)過(guò)大量的臨床實(shí)踐，療效確切。在前期臨床觀察中，芪黃疽愈方對(duì)于循環(huán)評(píng)分、跛行指數(shù)及踝肱比的近期療效與西藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，遠(yuǎn)期療效明顯高于西藥組。筆者認(rèn)為，脫疽患者素體氣陰兩虛，氣虛推動(dòng)無(wú)力，氣血津液輸布異常，津凝為痰，血滯為瘀，痰瘀互結(jié)為癥，最終導(dǎo)致痰瘀阻絡(luò)，經(jīng)脈不通而發(fā)病。可見(jiàn)，氣陰兩虛為本，經(jīng)絡(luò)癥積瘀結(jié)為標(biāo)，其病位在血脈，為本虛標(biāo)實(shí)之證。芪黃疽愈方遣方用藥以滋陰益氣、消癥散結(jié)、通經(jīng)活絡(luò)為大法，以黃芪、紅花為君藥，其中黃芪補(bǔ)氣固表，紅花活血化瘀；以黃精、鬼箭羽、雞血藤、延胡索、土鱉蟲、海藻為臣藥，其中黃精助黃芪補(bǔ)氣，同時(shí)能養(yǎng)陰益腎，鬼箭羽、延胡索、雞血藤活血通經(jīng)止痛，土鱉蟲、海藻化痰散結(jié)，共助紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛;牛膝引藥下行為使藥，諸藥合用，益氣滋陰，氣旺血行，瘀散絡(luò)通，諸癥自可漸除。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[10-11]表明，黃芪中的黃芪甲苷對(duì)促血管生成、心肌發(fā)育、增強(qiáng)心肌功能等基因有上調(diào)作用。紅花可使全血黏度降低，血小板聚集受到抑制，紅細(xì)胞的變形能力提高，從而達(dá)到了延長(zhǎng)凝血時(shí)間、抗血栓的功效[12]。雞血藤總黃酮可促進(jìn)血虛動(dòng)物模型造血功能

的恢復(fù)，具有抗貧血的作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)白細(xì)胞介素-3(interleukin-，IL-3)的分泌及調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin， EPO)水平有關(guān)[13]。鬼箭羽能夠能改善血液的黏稠凝聚、降低血黏度、消融動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，還可以解除血管痙攣并修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，因此對(duì)心肌缺血、高脂血癥及各種腦血管疾病均有療效[14]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，芪黃疽愈方具有降低血脂、改善血流變的作用，為芪黃疽愈方對(duì)肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥的治療作用提供了科學(xué)依據(jù)，為肢體動(dòng)脈硬化閉塞癥的治療提供了新的途徑。

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編輯陳瑞芳

Experimental study of Qi Huang Ju Yu Fang on rat limb arterial occlusive disease

Zhang Xin1, Liu Yuan1, Ge Jianli1*, Song Yihua1，Ma Yunlong1, Li Xiaodong2

(1.DepartmentofSurgery，TheTraditionalChineseMedicineHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050001,China;2.DepartmentofAngiologySurgery,TheTraditionalChineseMedicineHospitalofShijiazhuang,Shijiazhuang050001,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the animal model and observe the therapeutic effect of Qi Huang Ju Yu Fang on limb arterial occlusion in rats. MethodsTotally 60 Wistar rats were fed with high fat diet combined with the method of saphenous artery intima injury to make the (arteriosclerosis occlusive disease，ASO) model of rats; to observe the therapy effect in the different concentration groups on serum lipids, blood rheology indexes of the rats compared with Cilostazol as control group. Results Serum total cholesterol, triglyceride, low density lipoprotein, whole blood viscosity (high shear, low shear), erythrocyte aggregation index, erythrocyte rigidity index in high dose concentration of Chinese medicine groups and control group were remarkably lower than those in the model group. The statistical result is of great significance(P<0.01).While the difference between high dose concentration of Chinese medicine group and control group was not significant, and there was no statistical significance(P>0.05). ConclusionQi Huang Ju Yu Fang can treat extremity arteriosclerosis obliterans by improving the disorder of lipid metabolism, reducing blood lipid levels, improving blood rheology.

【Key words】Qi Huang Ju Yu Fang; arteriosclerosis occlusive disease; blood lipid; blood rheology; experimental study

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14277760D)。This study was supported by Science and Technology Support Project of Hebei Province (14277760D).

*Corresponding author， E-mail：gejianli591107@sohu.com

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.020]

【中圖分類號(hào)】R 289；R 543.5

(收稿日期：2015-12-08)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-0719∶07網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1907.044.html

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