交聯(lián)柚苷酶聚集體水解柚皮苷制備柚皮素

朱必玉,錢 偉,王先鋒,杜 平,高乾坤,魏勝華,2?

(1．安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000; 2．安徽工程大學微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心,安徽蕪湖241000)

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交聯(lián)柚苷酶聚集體水解柚皮苷制備柚皮素

朱必玉1,錢 偉1,王先鋒1,杜 平1,高乾坤1,魏勝華1,2?

(1．安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000; 2．安徽工程大學微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心,安徽蕪湖241000)

摘要:為了提高柚皮素的產(chǎn)率,簡化分離提純的工藝,得到較高純度的柚皮素,采用交聯(lián)柚苷酶聚集體水解柚皮苷制備柚皮素,以生成的柚皮素質(zhì)量濃度和得率為優(yōu)化指標．研究了底物質(zhì)量濃度、溫度、p H、加酶量、反應時間對制備柚皮素的影響,利用正交設計對水解過程進行優(yōu)化,確定最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度4．0 g/L、溫度55℃、p H 3．0、加酶量18．0 mg/m L、反應時間24 h．優(yōu)化后制備得到的柚皮素質(zhì)量濃度為1．833 g/L,柚皮素得率為97．72%,為制備柚皮素提供了一種新的方法．

關 鍵 詞:交聯(lián)柚苷酶聚集體;柚皮素;水解反應;正交試驗

柚皮素(naringenin)又名4＇,5,7-三羥基二氫黃酮,是柚皮苷水解掉一分子葡萄糖和鼠李糖得到的苷元,主要存在于蕓香科植物葡萄柚、西紅柿、葡萄以及柑橘類水果中．柚皮素在醫(yī)藥、食品行業(yè)具有重要的用途．國內(nèi)外的藥理研究表明,柚皮素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗纖維化、抗病毒、抗癌、抗心律失常、鎮(zhèn)咳、預防動脈粥樣硬化、保護肝功能等多種藥理活性,同時可以作為食品中的香料添加劑,用于食用油及有苦味和辣味的食品[1-4]．

目前,柚皮素的制備主要采用從天然植物中萃取、酸水解柚皮苷和酶法水解柚皮苷等方法[5-7]．然而,從天然植物中萃取和酸水解法制備柚皮素存在產(chǎn)物純度較低、生產(chǎn)成本較高等問題．利用游離柚苷酶水解柚皮苷制備柚皮素雖然生產(chǎn)成本較低,但產(chǎn)物的分離純化工藝較為復雜．柚苷酶(EC 3．2．1．40)是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的復合酶[8],在酶解柚皮苷的過程中,α-L-鼠李糖苷酶首先將柚皮苷水解為普魯寧和L-鼠李糖,然后在β-D-葡萄糖苷酶的作用下將普魯寧水解為柚皮素和葡萄糖[9]．交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一種無載體固定化方法,無需不溶性材料作為載體,直接使用雙功能試劑將不同酶的聚集體進行交聯(lián)而得到固定化酶的方法[10]．交聯(lián)柚苷酶聚集體具有良好的溫度穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性[11],同時由于交聯(lián)酶可以循環(huán)利用及利于從反應體系中分離等優(yōu)點,對于提高柚皮素的產(chǎn)率和簡化分離工藝有著重要的作用．通過正交設計優(yōu)化,對交聯(lián)柚苷酶聚集體酶法制備柚皮素的工藝進行了研究,為開發(fā)簡便、低成本的柚皮素制備工藝提供實驗參考．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

柚皮苷、柚皮素(純度≥98%,西安小草植物科技有限責任公司);戊二醛、檸檬酸、Na2HPO4、Na2CO3、Na HCO3、叔丁醇(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);乙腈(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司);柚苷酶(實驗室自制,Aspergillus awamori發(fā)酵)．

1．2 儀器與設備

TD5Z型臺式離心機(湖南凱達科學儀器有限公司);H H-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);雷磁PHS-3C型精密p H計(上海精密科學儀器有限公司);FA-100精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司);低速臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);AS1201高效液相色譜(大連依利特分析儀器有限公司)．

1．3 交聯(lián)柚苷酶聚集體的制備方法

取10 m L的柚苷酶發(fā)酵液于試管中,加入2倍體積的叔丁醇溶液,將酶液放置于4℃冰箱中沉淀30 min,向試管中加入2%(V/V)的戊二醛溶液交聯(lián)1．5 h．交聯(lián)完成后將沉淀在4 000 r/min條件下離心10 min,移去上清液,用10 m M p H 4．0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶液清洗3遍,將最終得到的沉淀物保存于4℃冰箱中,即獲得交聯(lián)柚苷酶聚集體．

1．4 優(yōu)化方法

(1)單因素實驗．交聯(lián)柚苷酶聚集體水解柚皮苷的過程一般受底物質(zhì)量濃度、溫度、p H值、加酶量、反應時間等因素的影響．其單因素水平為:①底物質(zhì)量濃度0．5 g/L、1．0 g/L、2．0 g/L、4．0 g/L、6．0 g/L、8．0 g/L、10．0 g/L,溫度45℃,p H值4．0,加酶量6．0 mg/m L,反應時間12 h;②反應溫度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃,底物質(zhì)量濃度4．0 g/L,p H值4．0,加酶量6．0 mg/m L,反應時間12 h;③p H值3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0、11．0,底物質(zhì)量濃度4．0 g/L,反應溫度55℃,加酶量6．0 mg/m L,反應時間12 h;④加酶量3．0 mg/m L、6．0 mg/m L、9．0 mg/m L、12．0 mg/m L、15．0 mg/m L、18．0 mg/m L,底物質(zhì)量濃度4．0 g/L,反應溫度55℃,p H值5．0,反應時間12 h;⑤反應時間1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h,底物質(zhì)量濃度4．0 g/L,反應溫度55℃,p H值5．0,加酶量12．0 mg/m L．

(2)正交試驗設計．基于單因素實驗結(jié)果以及交聯(lián)酶的性質(zhì),根據(jù)正交試驗設計方法,選取底物質(zhì)量濃度(A)、反應溫度(B)、p H值(C)、加酶量(D)、反應時間(E)為優(yōu)化因素,以柚皮素質(zhì)量濃度(R)和柚皮素得率(Y)作為優(yōu)化指標,設計L16(45)正交試驗,確定最佳的優(yōu)化條件,試驗因素編碼水平表如表1所示．

表1 正交實驗因素水平表

1．5 分析方法

(1)柚皮苷、柚皮素的檢測方法．采用大連依利特AS1201高效液相色譜儀進行檢測,色譜柱型號為SinoChrom ODS-BP(4．6 mm×200 mm,5μm),流速1．0 m L/min,檢測波長280 nm,進樣量10μL,柱溫30℃,流動相為乙腈∶水(V/V)＝30∶70．

(2)柚皮素得率計算．

式中,N為柚皮苷總物質(zhì)的量;N0為生成的柚皮素的物質(zhì)的量．

2 結(jié)果與討論

2．1 柚皮苷、柚皮素標準曲線

柚皮苷和柚皮素標準曲線如圖1所示．柚皮苷和柚皮素高效液相色譜圖如圖2所示．由圖1、圖2可知,柚皮苷的線性回歸方程為y＝11 387x＋96,R2＝0．999 8;柚皮素的線性回歸方程為y＝26 014x＋267, R2＝0．999 3．由此可以看出,柚皮苷和柚皮素在質(zhì)量濃度0～2．0 g/L范圍內(nèi)具有良好的線性．由圖3還可以看出,柚皮苷的保留時間為4．39 min,柚皮素的保留時間為27．16 min．

2．2 底物質(zhì)量濃度對制備柚皮素的影響

底物質(zhì)量濃度對柚皮素的制備過程起著重要的作用．底物質(zhì)量濃度過低,酶的催化效率達不到最優(yōu)值;底物質(zhì)量濃度過高,柚皮苷不能充分轉(zhuǎn)化為柚皮素,中間副產(chǎn)物較多,不利于柚皮素的分離提純．底物質(zhì)量濃度對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響如圖3所示．由圖3可知,隨著底物質(zhì)量濃度的增加,柚皮素質(zhì)量濃度逐漸增加,當?shù)孜镔|(zhì)量濃度達到4．0 g/L時,生成的柚皮素質(zhì)量濃度達到1．527 g/L,得率達到81．41%．之后隨著底物質(zhì)量濃度的增加,柚皮素質(zhì)量濃度增加緩慢,柚皮素得率急劇下降,說明此時底物中的柚皮苷不能被充分地水解為柚皮素．因此,選取底物質(zhì)量濃度4．0 g/L為最優(yōu)的酶解條件．

圖1 柚皮苷和柚皮素標準曲線

圖2 柚皮苷和柚皮素高效液相色譜圖

2．3 溫度對制備柚皮素的影響

溫度對酶的水解過程起著重要的作用,實驗中溫度不僅影響著酶的活性,同時影響著底物柚皮苷的溶解度．由于β-D-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性的差異,為了最大化地得到柚皮素,需要在一定的溫度范圍內(nèi)平衡β-D-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的酶活,同時最大化地提高柚皮苷的溶解度．溫度對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響如圖4所示．由圖4可知,隨著溫度的增加,生成的柚皮素質(zhì)量濃度逐漸增加,當溫度達到55℃時,柚皮素質(zhì)量濃度達到1．642 g/L．當繼續(xù)升高溫度時,柚皮素質(zhì)量濃度大幅度降低,可能是因為隨著溫度的升高,β-D-葡萄糖苷酶酶活降低,普魯寧無法轉(zhuǎn)化為柚皮素．因此,選取55℃為最優(yōu)的酶解條件．

圖3 底物質(zhì)量濃度對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響

圖4 溫度對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響

2．4 p H值對制備柚皮素的影響

p H對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響如圖5所示．由圖5可知,酸性條件下,隨著p H值的增加,柚皮素的含量逐漸增加,此時既能夠使α-L-鼠李糖苷酶保持較高的活力,也讓β-D-葡萄糖苷酶能夠及時地將普魯寧轉(zhuǎn)化為柚皮素．當p H值達到5．0時,柚皮素質(zhì)量濃度達到最大值1．742 g/L．當p H值繼續(xù)升高時,柚皮素的含量逐漸減少,可能是因為中性和堿性條件下β-D-葡萄糖苷酶的酶活較低,影響了柚皮素的生成．因此,選取p H值5．0為最優(yōu)的酶解條件．

2．5 加酶量對制備柚皮素的影響

加酶量對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響如圖6所示．由圖6可知,隨著加酶量的增加,柚皮素的生成量也逐漸增加．當加酶量較低時,反應時間內(nèi)交聯(lián)柚苷酶聚集體無法有效地將柚皮苷轉(zhuǎn)化為柚皮素,因此產(chǎn)量較低．當加酶量達到12．0 mg/m L時,此時生成的柚皮素質(zhì)量濃度為1．799 g/L．此后隨著加酶量繼續(xù)增加,柚皮素的質(zhì)量濃度不再增加．因此,選取加酶量12．0 mg/m L為最優(yōu)的酶解條件．

2．6 反應時間對制備柚皮素的影響

反應時間對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響如圖7所示．由圖7可知,隨著反應時間的增加,柚皮素的生成量逐漸增加,1～8 h內(nèi),柚皮素的生成速率較快,而后隨著時間的增加,柚皮素的生成速率較慢,可能是因為β-D-葡萄糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶在高溫和酸性條件下酶活力逐漸減低,導致轉(zhuǎn)化速率較慢．當反應時間達到12 h時,柚皮素質(zhì)量濃度達到最大值1．803 g/L,此時底物中的柚皮苷被大量轉(zhuǎn)化為柚皮素．因此,選取12 h為最優(yōu)的酶解條件．

圖5 p H對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響

圖6 加酶量對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響

圖7 反應時間對交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的影響

2．7 正交試驗優(yōu)化

正交試驗設計及結(jié)果如表2所示．柚皮素質(zhì)量濃度分析如表3所示．由表3可知,當以柚皮素質(zhì)量濃度為優(yōu)化指標時,其極差滿足RC＞RB＞RA＞RD＞RE,即5個單因素對制備柚皮素的影響大小為p H＞溫度＞底物質(zhì)量濃度＞加酶量＞反應時間．其中,通過均值可知:①隨著p H值的增加,其均值逐漸降低,因此在實驗范圍內(nèi)應當減小p H值;②隨著加酶量和反應時間的增加,其均值逐漸增加,因此,在實驗范圍內(nèi)應當加大加酶量、延長反應時間;③反應溫度和底物質(zhì)量濃度對生成的柚皮素質(zhì)量濃度的影響表現(xiàn)為先增加后減少,當?shù)孜镔|(zhì)量濃度和反應溫度過高時,都不利于柚皮素的生成．

柚皮素得率分析如表4所示．由表4可知,當以柚皮素得率為優(yōu)化指標時,其極差滿足RC＞RB＞RA＞RD＞RE,即5個單因素對制備柚皮素的影響大小為p H＞溫度＞底物質(zhì)量濃度＞加酶量＞反應時間．其中,通過均值可知:①隨著p H值的增加,其均值逐漸降低,表明在酸性條件下利于柚皮素的轉(zhuǎn)化,因此在實驗范圍內(nèi),應當減小p H值;②底物質(zhì)量濃度過高時柚皮素得率較低,選擇適宜的底物質(zhì)量濃度有利于減少中間產(chǎn)物的生成,同時提高柚皮素的產(chǎn)量;③反應溫度對生成的柚皮素得率的影響表現(xiàn)為先增加后減少,反應溫度過高時,不利于柚皮素的生成．對于多指標正交試驗,實驗采用綜合平衡法對上述兩個指標的結(jié)果進行分析,5個單因素中對制備柚皮素影響較大的因素為p H、溫度、底物質(zhì)量濃度．為了節(jié)約原料,減少中間產(chǎn)物的生成,提高柚皮素的產(chǎn)量,在實驗范圍內(nèi),得到的最佳組合為A2B2C1D4E4,即底物質(zhì)量濃度4．0 g/L、溫度55℃、p H值3．0、加酶量18．0 mg/m L及反應時間24 h．按正交設計的結(jié)果進行實驗,3次平行實驗測得柚皮素質(zhì)量濃度的平均值為1．833 g/L,柚皮素得率為97．72%．

表2 正交試驗設計及結(jié)果

表3 柚皮素質(zhì)量濃度分析表

表4 柚皮素得率分析表

3 結(jié)論

采用交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素,以柚皮素質(zhì)量濃度和得率作為優(yōu)化指標,對制備過程中的5個單因素進行了研究,并通過正交試驗確定了交聯(lián)柚苷酶聚集體制備柚皮素的最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度4．0 g/L、反應溫度55℃、p H 3．0、加酶量18．0 mg/m L、反應時間24 h,在此條件下制備得到的柚皮素質(zhì)量濃度可達到1．833 g/L,柚皮素得率為97．72%．

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Hydrolysis of naringin to naringeninby cross-linked naringinase aggregates

ZHU Bi-yu1,QIAN Wei1,WANG Xian-feng1,DU Ping1,GAO Qian-kun1,WEI Sheng-hua1,2?
(1．College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China; 2．Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Abstract:In order to improve the naringenin yield,simplify the process of separation and purification and obtain the high purity production,the conversion of naringin to naringenin by cross-linked naringin aseaggregate was investigated．The effects of substrate concentration,temperature,p H,enzyme amount and the reaction time on the preparation of naringenin were optimized,and the naringenin concentration and yield were used as the optimization indexes．Using the orthogonal design to optimize the hydrolysis process,the results showed that the feasible hydrolysis conditions were the substrate concentration 4．0 g/L,hydrolysis temperature at 55℃,p H 3．0,the amount of enzyme 18．0 mg/mL,the reaction time for 24 h,under which the production of naringenin＇s concentration was 1．833 g/L and the yield was 97．72%．It provided a new method for preparing the naringenin．

Key words:cross-linked naringinase aggregate;naringenin;hydrolysis reaction;orthogonal design

中圖分類號:TQ920．6

文獻標識碼:A

收稿日期:2015-10-15

基金項目:國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃基金資助項目(201310363075)

作者簡介:朱必玉(1991-),男,安徽六安人,碩士研究生．

通訊作者:魏勝華(1972-),男,安徽無為人,副教授,碩導．