高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究

羿 菲，李小曼，白 寧，孫 威，姜 波，張 瑩，宋曉宇

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·論著·

高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究

羿 菲，李小曼，白 寧，孫 威，姜 波，張 瑩，宋曉宇

110122遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院

【摘要】目的建立體外穩(wěn)定過表達(dá)酸敏感離子通道1a(ASIC1a)的Fisher大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞(FRT細(xì)胞)，采用Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細(xì)胞毒性檢測〔乳酸脫氫酶(LDH)釋放法〕測定ASIC1a活性，探討高通量篩選ASIC1a抑制劑的可行性。方法2014年1月—2016年2月，利用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的Fisher大鼠FRT細(xì)胞。將細(xì)胞分成兩組，對照組(FRT細(xì)胞)和實驗組(穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞)，并分別未負(fù)載和負(fù)載Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM，采用酶標(biāo)檢測儀測定雙波長(340 nm和380 nm)的值，計算F340/F380。對照組和實驗組細(xì)胞經(jīng)不同pH值酸液(pH值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后，采用酶標(biāo)檢測儀測定450 nm波長處LDH釋放量。結(jié)果對照組與實驗組未負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380較對照組升高(P<0.05)；對照組和實驗組負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380較未負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞升高(P<0.05)。pH值6.5、6.0、5.5時，實驗組細(xì)胞LDH釋放量大于對照組(P<0.05)；對照組和實驗組細(xì)胞不同pH值時LDH釋放量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論本研究成功建立穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞，Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)兩種方法測定ASIC1a活性，使高通量篩選ASIC1a抑制劑成為可能，為發(fā)現(xiàn)高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】高通量篩選分析；酸敏感離子通道1a；上皮細(xì)胞；乳酸脫氫酶

羿菲，李小曼，白寧，等.高通量篩選酸敏感離子通道1a抑制劑研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(17)：2033-2037.[www.chinagp.net]

Yi F,Li XM,Bai N,et al.High thoughtout screening of ASIC1a inhibitors[J].Chinese General Practice，2016，19(17)：2033-2037.

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一類由細(xì)胞外酸化激活的陽離子通道，廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等器官及部分腫瘤組織中。參與輕觸覺、酸味覺、痛覺形成，在缺血性腦損傷、學(xué)習(xí)與記憶等多種生理及病理過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。其中ASIC1a同聚體通道對H+敏感性較高，但只表現(xiàn)出快速失活成分。ASIC1a電流對離子的選擇性依次為pNa+>pLi+>pCa2+>pK+>pCs+[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ASIC1a介導(dǎo)的Ca2+超載在腦卒中引起的神經(jīng)元損傷機(jī)制中具有重要作用[6-7]。那么研發(fā)特異有效的小分子ASIC1a抑制劑就成為治療缺血性腦損傷的分子靶向。阿米洛利(amiloride)及其類似物是目前已知的一大類小分子ASICs抑制劑，但無選擇性、抑制作用小和不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)導(dǎo)致其只能在實驗研究中起作用[8-10]。而蜘蛛毒素(PcTx1)能特異性地抑制ASIC1a，比N-甲基-M天冬氨酸受體(NMDARs)拮抗劑具有更長時間的保護(hù)作用，但在臨床應(yīng)用上仍然具有困難[11]，那么研發(fā)高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。通常檢測ASIC1a功能的方法是應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄ASIC1a的開關(guān)電流，但耗時長、效率低，無法實現(xiàn)高通量篩選[6]，所以本研究將探索適合于篩選高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑的高通量篩選方法，為腦卒中的靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料2014年1月—2016年2月，F(xiàn)isher大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞(FRT細(xì)胞)購于ATCC，以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2環(huán)境中。熒光二抗Alexa fluo 594、Lipofectamine 2000均購于Invitrogen公司，C-myc抗體和Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM均購于Sigma，乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)溶液：溶液A(pH值為7.5和7.0)500 ml：150 mmol/L氯化鈉(NaCl)4.38 g，5 mmol/L氯化鉀(KCl)0.19 g，1 mmol/L氯化鎂(MgCl2)0.1 g，2 mmol/L氯化鈣(CaCl2)0.15 g，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)1.19 g，10 mmol/L葡萄糖 0.9 g，用氯化氫(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)調(diào)制適當(dāng)?shù)膒H值；溶液B(pH值為6.5、6.0

本研究背景和創(chuàng)新點(diǎn)：

酸敏感離子通道1a(ASIC1a)介導(dǎo)的Ca2+超載在腦卒中引起的神經(jīng)元損傷機(jī)制中具有重要作用，研發(fā)高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑成為當(dāng)今治療腦卒中的關(guān)鍵，但目前仍未得到解決。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)能很好地記錄ASIC1a的開關(guān)電流，但此方法不能應(yīng)用于高通量篩選研究。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的Fisher大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞(FRT細(xì)胞)，分析Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細(xì)胞毒性檢測(乳酸脫氫酶釋放法)兩種方法在高通量篩選應(yīng)用中的可行性，為得到高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑提供可能。

和5.5)500 ml：150 mmol/L NaCl 4.38 g，5 mmol/L KCl 0.19 g，1 mmol/L MgCl20.1 g，2 mmol/L CaCl20.15 g，10 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) 0.98 g，10 mmol/L葡萄糖 0.9 g，用HCl或NaOH調(diào)制適當(dāng)?shù)膒H值。

1.2方法

1.2.1ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的構(gòu)建根據(jù)分子克隆實驗指南中重組載體的方法[12]，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法克隆ASIC1a基因，ASIC1a上游引物為5′-CCCAAGCTTAGCATGGAACTGAAGACCGAG-3′,下游引物為5′-GCTCTAGAGCAGGTAAAGTCCTCAAACG-3′。瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收DNA片段，并與pcDNA3.1/myc-His載體(購于Invitrogen)分別進(jìn)行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切，回收載體片段后，利用T4 DNA連接酶在16 ℃條件下，過夜連接，并轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞的建立FRT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h內(nèi)采用胰酶消化，以70%～80%的密度鋪到6孔板。將pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a按照Lipofectamine 2000說明書步驟操作，瞬時轉(zhuǎn)染到FRT細(xì)胞中，并進(jìn)行新霉素(neomycin)篩選(濃度為500 mg/L)，獲得穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光染色將穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞去掉培養(yǎng)基，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。4%多聚甲醛溶液室溫下固定20 min后，采用0.05%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)進(jìn)行細(xì)胞膜穿孔15 min。2% BSA封閉液室溫下封閉1 h。加入鼠源C-myc抗體(1∶1 000)室溫2 h或4 ℃過夜。采用PBS洗滌3次，15 min/次。羊抗鼠熒光二抗Alexa fluo 594(1∶500)室溫下反應(yīng)1 h。去除二抗工作液，采用PBS洗滌3次，15 min/次。封固，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.4Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性(1)將細(xì)胞分成兩組，對照組(FRT細(xì)胞)和實驗組(穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞)，F(xiàn)RT細(xì)胞和穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞分別按約15 000個細(xì)胞/孔的密度鋪于黑壁透明底的96孔板上，培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌3次后加入0 μmol/L或2 μmol/L Fura-2/AM，37 ℃孵箱避光負(fù)載40 min。用含0.2% BSA的PBS洗滌3次，充分除去細(xì)胞外的Fura-2/AM。(2)Fura-2/AM無Ca2+結(jié)合能力，最大發(fā)射波長為510 nm，最大激發(fā)波長為380 nm，負(fù)載液的熒光光譜基本上同于此。Fura-2/AM與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合形成Fura-2-Ca2+復(fù)合物，最大激發(fā)波長從380 nm漂移到340 nm，固定發(fā)射波長510 nm，采用FluoStar Optima多功能酶標(biāo)儀測定雙波長(340 nm和380 nm)的值，計算F340/F380。實驗重復(fù)5次。

1.2.5細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)測定ASIC1a活性將細(xì)胞分成兩組，對照組(FRT細(xì)胞)和實驗組(穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞)。按照LDH釋放檢測試劑盒說明書方法檢測不同pH值酸液(溶液A、溶液B)(pH值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后細(xì)胞LDH釋放量。LDH釋放法具體步驟：空白孔：雙蒸水25 μl，基質(zhì)緩沖液25 μl；標(biāo)準(zhǔn)孔：雙蒸水5 μl，0.2 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液20 μl，基質(zhì)緩沖液25 μl；測定孔：待測樣本20 μl，基質(zhì)緩沖液25 μl，輔酶I 5 μl；對照孔：雙蒸水5 μl，待測樣本20 μl，基質(zhì)緩沖液25 μl?；靹颍?7 ℃溫浴15 min?？瞻卓?、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔、對照孔分別加入2,4-二硝基苯肼25 μl，混勻，37 ℃溫浴15 min。空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔、對照孔分別加入0.4 mol/L NaOH溶液250 μl，混勻，室溫放置5 min，每個樣本取200 μl，波長450 nm處，酶標(biāo)儀測定吸光度(OD值)。實驗重復(fù)5次。

2結(jié)果

2.1ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的構(gòu)建以實驗室已存的小鼠腦cDNA為模板，應(yīng)用ASIC1a特異引物擴(kuò)增出1條1 580 bp mASIC1a條帶(見圖1A)，經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后目的基因mASIC1a片段和pcDNA3.1/myc-His(見圖1B)。ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a用ASIC1a特異引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出1條1 580 bp左右的基因片段(見圖1C)，說明ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a構(gòu)建成功。

注：M=marker,ASIC1a=酸敏感離子通道1a；A：ASIC1a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后擴(kuò)增產(chǎn)物；C：ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖1ASIC1a過表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Figure 1The PCR amplification product of ASIC1a overexpression vector pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a

2.2穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞的建立將pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a轉(zhuǎn)染入FRT細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光方法觀察ASIC1a在FRT細(xì)胞中的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果顯示，ASIC1a表達(dá)在FRT細(xì)胞的細(xì)胞膜上，并且ASIC1a表達(dá)純度很高(見圖2)，篩選成功，可以應(yīng)用于后續(xù)實驗研究。

2.3Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性對照組與實驗組未負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組與實驗組負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組和實驗組負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞F340/F380高于未負(fù)載Fura-2/AM細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM and cells not loaded with Fura-2/AM calcium between control group and experiment group

組別未負(fù)載Fura-2/AM負(fù)載Fura-2/AMt值P值對照組0.37±0.064.86±0.3811.54<0.01實驗組0.41±0.058.70±0.2631.45<0.01t值0.538.28P值0.61<0.01

圖2穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞免疫熒光染色(×40)

Figure 2FRT cell immunity fluorescence staining with stable ASIC1a overexpression

2.4細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)測定ASIC1a活性pH值7.5、7.0時，對照組與實驗組細(xì)胞LDH釋放量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；pH值6.5、6.0、5.5時，實驗組細(xì)胞LDH釋放量大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組和實驗組細(xì)胞不同pH值時LDH釋放量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

3討論

本研究通過建立穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞，應(yīng)用Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定ASIC1a活性，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞F340/F380升高，可以作為高通量篩選ASIC1a抑制劑的方法之一。酸中毒機(jī)制是通過激活A(yù)SIC1a，引起Ca2+超載，導(dǎo)致細(xì)胞中毒乃至死亡。目前，常用有效的檢測細(xì)胞毒性的方法是通過測定LDH釋放量來反映細(xì)胞中毒程度。本研究發(fā)現(xiàn),pH值下降，穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞LDH釋放量增加，為進(jìn)一步高通量篩選ASIC1a抑制劑提供可能。

缺血性腦損傷是一個由多因素參與、多蛋白相互調(diào)控的過程。研究者普遍認(rèn)為“興奮毒性”和“酸毒性”是引起缺血性腦損傷的兩個重要的機(jī)制，過量的谷氨酸激活NMDARs導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流，從而激活了CaMKⅡ，CaMKⅡ又依次調(diào)節(jié)NMDARs和ASIC1a的磷酸化[6]。缺血過程中，NMDARs的激活又增強(qiáng)了ASIC1a同聚體和包含ASIC1a的異聚體通道通透Ca2+和Na+的電流[6]。由此可見，在腦缺血期間，興奮性中毒和酸中毒存在著功能上的協(xié)同作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。盡管對缺血性腦卒中的細(xì)胞與分子反應(yīng)的研究已取得了巨大的進(jìn)展，但仍無有效的治療措施[6]。隨著谷氨酸受體拮抗劑在臨床上應(yīng)用的失敗，研發(fā)ASICs的有效抑制劑必然成為治療缺血性腦卒中的新靶點(diǎn)。

ASIC1a是導(dǎo)致缺血性腦損傷的重要分子機(jī)制。細(xì)胞外酸化激活A(yù)SIC1a通透Ca2+，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起神經(jīng)元中毒損傷[6]。本研究首先根據(jù)細(xì)胞的特性、貼壁性以及是否能應(yīng)用于高通量篩選等方面選擇FRT細(xì)胞作為工具細(xì)胞，并建立了穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞。目前檢測ASIC1a功能的方法是應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄ASIC1a的開關(guān)電流，但此技術(shù)不適于高通量篩選大規(guī)模藥物，耗時長、效率低[6]，所以探索合適的高通量篩選方法就顯得尤為重要。本研究探索兩種測定方法：(1)Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM，優(yōu)點(diǎn)是具有高熒光強(qiáng)度、高靈敏度、誤差小、低親和力，能實時監(jiān)測Ca2+濃度的變化，但易出現(xiàn)探針泄漏、房室化、受其他二價陽離子干擾、耗費(fèi)大等現(xiàn)象。(2)細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)，優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、適用范圍廣，可做定量測定，具有大量樣本快速檢測的優(yōu)點(diǎn)。但LDH是細(xì)胞本身生長代謝的產(chǎn)物,可能存在自發(fā)釋放現(xiàn)象，并且LDH分子較大，當(dāng)細(xì)胞膜嚴(yán)重破損時才能被釋放，故不能較早地反映細(xì)胞的功能，另外較高濃度的胎牛血清中所含的LDH、培養(yǎng)液中的丙酮酸鹽都可能會干擾結(jié)果[13]。本研究應(yīng)用以上兩種方法均得到了較好的實驗結(jié)果，為發(fā)現(xiàn)高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑奠定了基礎(chǔ)，為研究缺血性腦卒中誘發(fā)神經(jīng)元損傷的機(jī)制和治療提供理論基礎(chǔ)。

表2　對照組與實驗組不同pH值時細(xì)胞LDH釋放量比較±s，n=5)

注：與同組pH值7.5時比較，aP<0.05；與同組pH值7.0時比較，bP<0.05；與同組pH值6.5時比較，cP<0.05

綜上所述，本研究對比分析FRT細(xì)胞和穩(wěn)定過表達(dá)ASIC1a的FRT細(xì)胞中Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM測定的F340/F380和細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)測定的LDH釋放量，這兩種方法均可以作為高通量篩選高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑的功能方法。由于ASIC1a是快速轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+通道，Ca2+敏感熒光染料Fura-2/AM和細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放法)方法對Ca2+快速變化的敏感性、受其他因素干擾情況以及人為誤差等因素仍存在諸多不明確性，還需后續(xù)實驗進(jìn)一步優(yōu)化，從而為研發(fā)高選擇性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制劑提供新思路和新方法。

作者貢獻(xiàn)：羿菲、宋曉宇構(gòu)思并設(shè)計實驗、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文、并對文章負(fù)責(zé)；李小曼進(jìn)行資料收集整理；白寧、孫威、姜波、張瑩進(jìn)行實驗實施和評估；宋曉宇負(fù)責(zé)文章審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

High Thoughtout Screening of ASIC1a Inhibitors

YIFei,LIXiao-man,BAINing,etal.

InstituteofTranslationalMedicine,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China

【Abstract】ObjectiveTo establish the FRT cell of Fisher rats of stable in vitro ASIC1a overexpression,Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM and cytotoxicity test(LDH releasing method) were used to determine the activity of ASIC1a,to discuss the feasibility of high throughput screening of ASIC1a inhibitors.MethodsFrom January 2014 to February 2016,molecular biology method was used to establish ASIC1a overexpression vector pcDNA3.1/myc-His-mASIC1a.By cell transfection technique,we established FRT cell of Fisher rats with stable ASIC1a overexpression.The cells were divided into two groups:control group(FRT group) and experiment group(FRT cells with stable ASIC1a overexpression);two groups were loaded or not loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM,and enzyme mark detector was employed to determine dual-wave length(340 nm and 380 nm) and the ratio of F340/F380.After the cells in control group and experiment group were stimulated by acid liquid of different pH values(7.5,7.0,6.5,6.0 and 5.5),the LDH release at 450 nm wave length was determined using enzyme mark detector.ResultsControl group and experiment group were not significantly different in F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM(P>0.05);experiment group was higher than control group in F340/F380 of cells loaded with Fura-2/AM(P<0.05);control group and experiment group had higher F340/F380 in cells loaded with Fura-2/AM than in cells not loaded with Fura-2/AM(P<0.05).When pH value were 6.5,6.0 and 5.5,experiment group was higher than control group in LDH release(P<0.05);control group and experiment group were significantly different in LDH release in the cases of different pH values(P<0.05).ConclusionStable ASIC1a overexpression cells are established,and Ca2+-sensitive fluorescent dye Fura-2/AM and cytotoxicity test(LDH releasing method) are used to determine the activity of ASIC1a,which make the high thoughtout screening of ASIC1a inhibitors possible and lay a foundation for finding natural small molecule ASIC1a inhibitors with specificity and high activity.

【Key words】High-throughput screening assays；Acid-sensing ion channels1a；Epithelial cells；Lactate dehydrogenase

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81502414)；教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”資助項目(IRT13101)

通信作者：宋曉宇，110122遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；E-mail:xysong@mail.cmu.edu.cn

【中圖分類號】R 965.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.17.011

(收稿日期：2016-03-01；修回日期：2016-05-10)