HPLC同時(shí)測(cè)定清火膠囊中5種成分的含量

伍國(guó)怡

【摘 要】 目的：建立HPLC法測(cè)定清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚含量的方法。方法：采用Eclipse XDB（4.6×250 mm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速為0.80 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm。結(jié)果：靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚與其相鄰質(zhì)峰能完全分離。靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為：0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）、0.391～39.1μg/ml（r=0.9999）、0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）、0.216～21.6μg/ml（r=1.0000）、0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）；方法回收率均不低于97%。結(jié)論：該方法靈敏度高、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于清火膠囊的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 HPLC；靛玉紅；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；清火膠囊

【中圖分類號(hào)】R286.0 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）11-0019-03

Abstract：Objective HPLC method was established for the determination of Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol in Qinghuo capsules.Methods Eclipse XDB（4.6×250mm） column was used with the mobile phase of methonal-0.1% phosphate acid solution by gradient elutio，The flow rate was 0.80ml/min. The detection wavelength was set at： 289nm.Results Indirubin、Aloe-emodin、Rhein、Emodin and Chrysophanol could be completely separated from interfacing impurity peaks. The HPLC method showed agood linear relationship in the range of 0.050～5.00μg/ml（r=0.9999）for Indirubin，0.391～39.1μg/ml（r=0.9999） for Aloe-emodin，0.696～69.6μg/ml（r=0.9997）for Rhein，0.216～21.6μg/ml（r=1.0000） for Emodin，0.212～21.2μg/ml（r=1.0000）for Chrysophanol. Recoveries for the three components were all above 97%. Condusion The method is sensitive， simple， accurate， and can be used for the quality control of Qinghuo capsules.

Keywords：HPLC；Indirubin；Aloe-emodin；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Qinghuo Capsules

清火膠囊是由大青葉、大黃、石膏、薄荷腦等藥物經(jīng)適宜加工制成的中成藥，收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[1]，具有清熱泄火，通便的功效。臨床用于咽喉腫痛，牙痛，頭目眩暈，口鼻生瘡，大便不通等。原標(biāo)準(zhǔn)只有大黃素、大黃酚的含量測(cè)定項(xiàng)，文獻(xiàn)也無(wú)同時(shí)測(cè)定清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚5種成分的報(bào)道。研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[2-11]，建立HPLC法測(cè)定清火膠囊中大青葉的主要成分靛玉紅，大黃的主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚含量的方法。該方法靈敏度高、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于清火膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent 1200 LC色譜工作站、G1322A DEGASSER 溶劑脫氣機(jī)、G1311A 四元泵、G1329A（ALS）自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B VWD 紫外檢測(cè)器）；德國(guó)賽多利斯 CP225D電子天平；西班牙COBOS AW-120自動(dòng)電子天平；上海必能信SB3200WS 超聲波清洗器。

1.2 材料 靛玉紅（批號(hào)：717-200204）、蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201007）、大黃酸（批號(hào)：0757-200206）、大黃素（批號(hào)：110756-200110）和大黃酚（批號(hào)：110796-201319）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。清火膠囊（批號(hào)：140111、141006，江西藥都仁和制藥有限公司；批號(hào)：140607，浙江泰康藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。甲醇為色譜純、水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），其梯度見(jiàn)表1；流速：0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl。理論板數(shù)按靛玉紅計(jì)應(yīng)不低于2500。

2.2 供試品溶液的制備 取本品10粒的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約1粒的量，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40KHz）30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，濾液用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方中藥味的比例，分別自配不含大黃和不含大青葉的群藥，按其工藝制成陰性對(duì)照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液注入色譜儀，色譜圖見(jiàn)圖1。在該色譜條件下，靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按靛玉紅峰計(jì)不低于2500，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰，表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.5 線性關(guān)系的考察 精密稱取靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑，分別配制成對(duì)照品貯備溶液（即含靛玉紅0.4996mg/ml、蘆薈大黃素0.3910mg/ml、大黃酸0.3480mg/ml、大黃素0.2156mg/ml、大黃酚0.2119mg/ml的溶液）倍比稀釋法配置成系列質(zhì)量濃度的溶液。進(jìn)樣10μl，測(cè)定各組分峰面積。以各組分濃度（C）橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。靛玉紅： A=91.267 C+9.9152，r=0.9999，線性范圍：0.050～5.00μg/ml；蘆薈大黃素：A=38.850C-6.6232，r=0.9999，線性范圍：0.391～39.1μg/ml；大黃酸：A=121.823C-12.269，r=0.9997，線性范圍：0.696～69.6μg/ml；大黃素：A=83.911C-3.6159，r=1.0000，線性范圍：0.216～21.6μg/ml；大黃酚：A=46.881C-1.5005，r=1.0000，線性范圍：0.212～21.2μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品（批號(hào)：140111）溶液10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，其RSD分別為0.76%、1.04%、1.28%、0.91%、1.46%。

2.7 [JP3]重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：140111）共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，各進(jìn)樣10μl，測(cè)定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量，分別為：0.0075、0.0073、0.0073、0.0077、0.0077、0.0074mg/粒，平均：0.0075mg/粒（RSD為2.45%）；0.245、0.244、0.247、0.245、0.248、0.242mg/粒，平均：0.245mg/粒（RSD為0.87%）；0.100、0.096、0.097、0.099、0.095、0.098mg/粒，平均：0.098mg/粒（RSD為1.92%）；0.139、0.142、0.138、0.135、0.141、0.137mg/粒，平均：0.139mg/粒（RSD為1.86%）；0.530、0.536、0.534、0.525、0.529、0.528mg/粒，平均：0.530mg/粒（RSD為0.76%）。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：140111）溶液，分別在0、1、2、4、6、8、10、12h時(shí)進(jìn)樣10μl，記錄色譜峰面積，計(jì)算靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的峰面積的RSD分別為0.59%、1.53%、1.28%、0.94%、1.62%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)定靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的清火膠囊（批號(hào)：140111）樣品9份（每份約0.5粒的量），精密稱定，于①②③樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品貯備液4、150、60、150、600μl，于④⑤⑥樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品貯備液8、300、120、300、1200μl，于⑦⑧⑨樣品中分別精密加入靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚對(duì)照品貯備液12、150、180、450、1800μl，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品測(cè)定 取不同批號(hào)的清火膠囊，按供試品溶液制備方法處理，進(jìn)行HPLC分析，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)曾嘗試用單一流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶[KG-*2]25）進(jìn)行洗脫，部分組份分離效果不佳，加大水相組分的比例進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離效果大大提高，但出峰時(shí)間較長(zhǎng)，影響工作效率；而選擇現(xiàn)正文所用流動(dòng)相，待測(cè)的5個(gè)成分分離較好且峰形較佳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：中國(guó)藥典[2]收載大青葉中靛玉紅檢測(cè)波長(zhǎng)為289nm，大黃中4個(gè)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，由于靛玉紅含量較低，故選擇289nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取溶劑及時(shí)間的選擇：分別用甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取率最高。用甲醇超聲提取30、40、50、60min等后進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果顯示30min已經(jīng)能夠?qū)⒛繕?biāo)組份提取完全。

3.4 由表3可知，不同廠家不同批號(hào)生產(chǎn)的清火膠囊中靛玉紅、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃酚的含量有差別，特別是靛玉紅的含量，差別很大，提示不同的生產(chǎn)工藝制備出的清火膠囊內(nèi)在質(zhì)量有差異?，F(xiàn)有的清火膠囊的質(zhì)量控制方法較簡(jiǎn)單，不能有效地控制清火膠囊質(zhì)量。該方法經(jīng)方法學(xué)研究表明，實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)單、可靠，可作為評(píng)價(jià)清火膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

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（收稿日期：2016.04.07）