普通小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

劉自成，苗麗麗，王景一，楊德龍，毛新國(guó)，景蕊蓮

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

?

普通小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

劉自成1,2，苗麗麗2，王景一2，楊德龍1，毛新國(guó)1,2，景蕊蓮2

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

摘要：【目的】非生物逆境是制約小麥生產(chǎn)的主要因素。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與對(duì)多種非生物逆境脅迫的應(yīng)答。普通小麥基因組中至少含有200個(gè)WRKY，目前僅對(duì)少數(shù)成員的功能進(jìn)行了鑒定。通過(guò)克隆小麥 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 TaWRKY35并揭示其功能，為改良小麥的抗逆性提供基因資源。【方法】利用小麥全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)信息，從強(qiáng)抗旱小麥品種旱選10號(hào)中克隆逆境脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35；采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分析目標(biāo)基因在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官中的表達(dá)水平，以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低溫等逆境脅迫下的表達(dá)模式；構(gòu)建目標(biāo)基因與GFP融合的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，以確定目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的作用位置；構(gòu)建TaWRKY35過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，揭示目標(biāo)基因的功能。【結(jié)果】TaWRKY35的開放閱讀框全長(zhǎng)1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY家族第Ⅲ亞家族。測(cè)序發(fā)現(xiàn)TaWRKY35編碼區(qū)序列非常保守，在32份多態(tài)性較高的六倍體小麥材料中未檢測(cè)到DNA多態(tài)性。TaWRKY35在小麥的不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中均有表達(dá)，其中在幼苗根基部表達(dá)量最高，約為苗期葉片中表達(dá)量的26倍；其次為幼芽根基，約為苗期葉片中表達(dá)量的21倍；接下來(lái)依次為孕穗期莖節(jié)、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片，而在幼苗葉片中表達(dá)水平最低；同時(shí)在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下，小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)量均顯著上升，表明TaWRKY35參與對(duì)4種逆境脅迫的應(yīng)答，但在不同脅迫條件下表達(dá)模式差異顯著，其中對(duì)鹽脅迫最敏感。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，TaWRKY35特異定位在細(xì)胞核上，是典型的核定位蛋白。在高鹽脅迫條件下，TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉白化率顯著低于對(duì)照，TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的細(xì)胞膜穩(wěn)定性和幼苗存活率均顯著高于野生型對(duì)照，表明TaWRKY35能增強(qiáng)植物的耐鹽性。【結(jié)論】TaWRKY35編碼蛋白含有WRKY和C2HC結(jié)構(gòu)域，為WRKY家族第Ⅲ亞家族成員。TaWRKY35在小麥發(fā)育的不同時(shí)期、不同組織中均有表達(dá)，且受ABA、PEG、NaCl及低溫等逆境脅迫誘導(dǎo)。過(guò)表達(dá)TaWRKY35能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

關(guān)鍵詞：小麥；WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因；非生物脅迫；耐鹽性

聯(lián)系方式：劉自成，E-mail：liuyao8916@163.com。通信作者楊德龍，Tel：0931-7631875；E-mail：yangdl@gsau.edu.cn。通信作者毛新國(guó)，Tel：010-82105829；E-mail：maoxinguo@caas.cn

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境是制約小麥生產(chǎn)的主要因素。克隆抗逆基因，揭示其功能是利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良小麥抗逆性的前提和基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】遭受逆境脅迫時(shí)，植物在分子、細(xì)胞和生理水平產(chǎn)生一系列變化以適應(yīng)不利環(huán)境［1-2］。植物體內(nèi)參與逆境脅迫應(yīng)答的基因很多，根據(jù)基因產(chǎn)物的功能分為兩大類：功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，其中，功能蛋白主要包括水通道蛋白、LEA蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的酶類以及各種抗氧化酶等；調(diào)節(jié)蛋白則包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子等。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其 N端含有高度保守的WRKYGQK基序而得名。WRKY轉(zhuǎn)錄因子最早發(fā)現(xiàn)于甘薯中［3］，隨后在野燕麥、荷蘭芹、擬南芥、馬鈴薯、白英、煙草和水稻中相繼被發(fā)現(xiàn)［4］。WRKY家族成員均含1—2個(gè)與DNA結(jié)合的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由 60個(gè)左右高度保守的氨基酸組成，其中WRKYGQK是核心序列，該序列氨基酸突變將導(dǎo)致DNA結(jié)合活性的減弱，甚至喪失［5］；WRKY成員的C端包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，即 C2H2或者 C2HC。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)域的類型將WRKY家族分成3個(gè)亞家族（Group）［4］：亞家族Ⅰ（GroupⅠ）有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2（CX4-5CX22-23HX1H）型鋅指結(jié)構(gòu)域；亞家族Ⅱ（GroupⅡ）成員只含有 1 個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域；亞家族Ⅲ（GroupⅢ）成員含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2HC型（即CX7CX23HX1C）鋅指結(jié)構(gòu)域［6］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)WRKY結(jié)構(gòu)域特異識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）進(jìn)而調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)［4，7］。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，并參與抗病應(yīng)答［8］。近期越來(lái)越多的證據(jù)表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)ABA依賴或者非ABA依賴的逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)非生物逆境脅迫的應(yīng)答［9-11］。過(guò)表達(dá)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)植物的抗逆性，例如過(guò)表達(dá) AtWRKY25、AtWRKY33能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫和高鹽的耐受性［12-14］；過(guò)表達(dá)BdWRKY36能顯著增強(qiáng)煙草對(duì)干旱的耐受性［15］；過(guò)表達(dá)GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54能增強(qiáng)植物對(duì)多種非生物逆境脅迫的耐受性［16］；過(guò)表達(dá)OsWRKY11能夠提高水稻對(duì)高溫、干旱等脅迫的耐受性［17］，過(guò)表達(dá)OsWRKY47能提高水稻的抗旱性［18］。研究推測(cè)，普通小麥基因組中至少含有200個(gè)WRKY基因［19］，但目前僅有少數(shù)成員的功能被鑒定，其中 TaWRKY10（GroupⅡ）、TaWRKY44（GroupⅠ）參與對(duì)多種非生物逆境脅迫的應(yīng)答，過(guò)量表達(dá)能增強(qiáng)植物的抗旱性和耐鹽性［20-21］；2012年，NIU等［22］在小麥cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了43個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中TaWRKY2（GroupⅠ）受干旱、鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)量表達(dá)TaWRKY2能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱、耐鹽性。TaWRKY19（GroupⅠ）除受上述3種逆境脅迫誘導(dǎo)外，還參與對(duì)冷脅迫的應(yīng)答，過(guò)量表達(dá)該基因能提高擬南芥的抗旱、耐鹽及耐凍性［22］。2015年，QIN等［23］研究發(fā)現(xiàn)TaWRKY93參與對(duì)鹽脅迫和 ABA處理的應(yīng)答，過(guò)量表達(dá) TaWRKY93 （GroupⅡ）能提高擬南芥對(duì)多種非生物逆境的耐受性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有研究證明，小麥 WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答，然而迄今為止，僅對(duì)GroupⅠ、GroupⅡ的個(gè)別基因進(jìn)行了功能分析，而關(guān)于 Group Ⅲ成員的功能研究尚未見報(bào)道。TaWRKY35屬于WRKY Group Ⅲ，它是否參與非生物脅迫的應(yīng)答，以及其在逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)的功能目前均不明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究克隆了一個(gè)新的小麥 WRKY基因，屬于 Group Ⅲ，命名為TaWRKY35。對(duì)其在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織的特異性表達(dá)水平，在ABA、PEG、NaCl、低溫逆境脅迫處理的表達(dá)模式，以及在細(xì)胞中的作用部位進(jìn)行分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥鑒定其功能，旨在為利用 WRKY轉(zhuǎn)錄因子提高小麥抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其培養(yǎng)

試驗(yàn)于 2014—2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行。利用農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存的強(qiáng)抗旱小麥品種旱選 10號(hào)進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)模式分析和目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。挑選大小均勻一致的旱選10號(hào)種子放在玻璃培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱（23℃、光周期12 h·d-1）中水培，待幼苗成長(zhǎng)至一葉一心（10 d苗齡）時(shí)，分別用50 mmol·L-1ABA、16.1％ PEG-6000（-0.5 MP）、250 mmol·L-1NaCl和低溫（4℃）進(jìn)行脅迫處理，在處理0、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、48和72 h取幼苗葉片，-80℃保存，用于分析目標(biāo)基因逆境脅迫條件下的表達(dá)模式。在培養(yǎng)皿上水培旱選10號(hào)，芽期取根部、根基部、胚芽；田間種植旱選10號(hào)，苗期取幼苗的根、根基和葉片，孕穗期取莖節(jié)，孕穗后期取根、葉和幼穗，-80℃保存，用于分析目標(biāo)基因的組織特異表達(dá)。挑選籽粒飽滿的小麥種子在培養(yǎng)皿中，用去離子水室溫避光培養(yǎng)，培養(yǎng)至一葉一心時(shí)，取黃化幼苗葉片的中段制備原生質(zhì)體，進(jìn)行目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。

基因染色體定位材料包括普通小麥二倍體供體種材料：烏拉爾圖小麥（UR200、UR204、UR205）、擬斯卑爾托山羊草（Y2017、Y2033、Y2035和Y2178）、粗山羊草（Ae38、Ae46和Y57）；四倍體材料（DS1、DM49和DM50）和異源六倍體普通小麥材料旱選10號(hào)?；蚨鄳B(tài)性分析材料為農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室前期利用 SSR標(biāo)記篩選的32份高多態(tài)性材料（表1）。室溫條件下水培，取幼苗葉片提取DNA。

1.2 目的基因克隆

利用WRKY保守結(jié)構(gòu)域搜索小麥全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)，得到目標(biāo)基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序列信息設(shè)計(jì)引物WRKY35-C-F和WRKY35-C-R（表2），以旱選10號(hào)小麥cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。以目標(biāo)基因的cDNA序列為源序列，搜索小麥A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和D基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到的基因組序列與cDNA序列一致性最高，以該基因組序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的引物TaWRKY35-F和TaWRKY35-R（表2）。

用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取小麥不同脅迫處理的葉片和不同組織的總RNA。以總RNA為模板，用M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，利用高保真聚合酶TransStart Fast Pfu（Transgen，北京）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含模板DNA（50 ng·μL-1）2 μL、5×TransStart Fast Pfu buffer 4 μL、2.5 μmol·L-1dNTP 1.6 μL、DNA Polymerase 0.4 μL、正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 60 s，38個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用1.5％瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，將目的片段用 PCR產(chǎn)物純化試劑盒（生工，上海）回收后，與pEASY-Blunt載體（Transgen，北京）連接，用BigDye Terminator Kit（ABI，美國(guó)）測(cè)序。

1.3 基因結(jié)構(gòu)和序列分析

用DNAStar軟件包中Seqman和MegAlign進(jìn)行基因序列分析、拼接和比對(duì)，用DNAman進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析，用MEGA（Version 6.06）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1　供試小麥材料Table 1 Wheat accessions used in this study

表2　試驗(yàn)中使用的引物Table 2 Primers used in the experiments

1.4 載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

利用生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：//cello.life.nctu.edu.tw）預(yù)測(cè) TaWRKY35在細(xì)胞中的定位。為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)亞細(xì)胞定位引物（分別在引物5′和3′端引入了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)），將TaWRKY35全長(zhǎng)CDS（coding sequence）序列（不含終止密碼子）克隆到 pJIT163-GFP載體融合表達(dá)，構(gòu)建 pJIT163-35S：：TaWRKY35：：GFP載體。用PEG法轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，室溫避光培育15 h，在Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡下觀察TaWRKY35-GFP在小麥原生質(zhì)體中的定位。

1.5 目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)TaWRKY35全長(zhǎng)CDS序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物WRKY35-RT-F和WRKY35-RT-R，以小麥Actin （JQ269668.1）的引物 Actin F1和 Actin R1為qRT-PCR內(nèi)參引物（表2）。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq （Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，日本）說(shuō)明書操作，反應(yīng)體系為1/10 cDNA first-strand 1.0 μL、2× SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、正、反向引物（5 μmol·L-1）各0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。用ABI 7900實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量［24］。

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及其耐鹽性鑒定

利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將TaWRKY35全長(zhǎng)CDS序列克隆到pCHF3載體上。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)后獲得T3純合轉(zhuǎn)基因株系，選取目標(biāo)基因表達(dá)量相對(duì)較高的3個(gè)株系用于耐鹽性分析。

將野生型（WT）、轉(zhuǎn)基因株系種子用 10％次氯酸鈉溶液消毒處理后，點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿置于人工氣候室中垂直培養(yǎng)。將培養(yǎng)7 d的幼苗分成兩部分，一部分在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗逆表型鑒定，具體操作如下：將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗10株，分別移至含有 60 μmol·L-1ABA、250 mmol·L-1NaCl和 200 mmol·L-1甘露醇的MS固體培養(yǎng)基上，處理7 d，觀察表型，設(shè)3次重復(fù)。另一部分移到底部有孔的長(zhǎng)方形篩盤中（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1），每個(gè)株系一行，每行10株幼苗。正常生長(zhǎng)3周，然后用200 mmol·L-1NaCl溶液處理（將篩盤放在鹽溶液中，直至土壤鹽溶液飽和），跟蹤觀察轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的表型，計(jì)算植株存活率，重復(fù)3次。

細(xì)胞膜穩(wěn)定性測(cè)定：利用電導(dǎo)儀分別測(cè)定煮沸前與煮沸后幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率，評(píng)價(jià)細(xì)胞膜穩(wěn)定性（cell membrane stability，CMS）。從垂直培養(yǎng)的幼苗中取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗10株，移至含有250 mmol·L-1NaCl 的MS固體培養(yǎng)基上，處理7 d。測(cè)定幼苗電導(dǎo)率，10株為一次重復(fù)，設(shè)3次重復(fù)。CMS（％）=（1－煮前電導(dǎo)率/煮后電導(dǎo)率）×100％。CMS值越大，表明細(xì)胞膜穩(wěn)定性越高，植物受損傷程度越低。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)基因克隆

以普通小麥旱選10號(hào)cDNA為模板，利用引物對(duì)WRKY35-C-F和WRKY35-C-R擴(kuò)增目標(biāo)基因。測(cè)序表明，該基因開放閱讀框全長(zhǎng)1 134 bp，編碼377個(gè)氨基酸。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該蛋白的N端有一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。

2.2 TaWRKY35氨基酸序列同源性分析

將TaWRKY35編碼的氨基酸序列提交到NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與大麥HvWRKY35 （ABL_11228.1）、短柄草BdWRKY2（XP_014757278.1）、水稻 OsWRKY35（NP_001056863.1）、擬南芥AtWRKY35（XP_008660715.1）具有較高的相似性，序列一致性分別為79％、60％、50％和45％，因此將其命名為 TaWRKY35。盡管在序列一致性方面有差異，但TaWRKY35與上述WRKY成員的序列結(jié)構(gòu)相同，均含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C端鋅指結(jié)構(gòu)（圖1-A）。小麥TaWRKY35含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2HC類型的鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子GroupⅢ（圖1-B）。

2.3 TaWRKY35結(jié)構(gòu)及序列多態(tài)性分析

以小麥二倍體供體種（烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾托山羊草、粗山羊草）、四倍體和六倍體小麥基因組 DNA為模板，利用引物 TaWRKY35-F和TaWRKY35-R擴(kuò)增目標(biāo)基因，發(fā)現(xiàn)只能在含有A基因組的材料中擴(kuò)增出 TaWRKY35，說(shuō)明其可能來(lái)自小麥A基因組。測(cè)序表明該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2.55 kb，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子。用上述引物在32份高多態(tài)性的六倍體小麥中擴(kuò)增 TaWRKY35，測(cè)序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)DNA多態(tài)性，說(shuō)明TaWRKY35編碼區(qū)序列非常保守，預(yù)示在小麥生長(zhǎng)發(fā)育中可能具有極其重要的作用。

2.4 TaWRKY35組織特異性表達(dá)

TaWRKY35組織特異性表達(dá)模式的分析表明，該基因在小麥發(fā)育的不同時(shí)期、多種組織器官中均有表達(dá)。其中在幼苗根基中表達(dá)量最高，約為葉片中表達(dá)量的26倍；其次為幼芽根基，約為苗期葉片中表達(dá)量的21倍；接下來(lái)依次為孕穗期莖節(jié)、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片、苗期葉片（圖2）。

2.5 逆境脅迫誘導(dǎo)下TaWRKY35的表達(dá)模式

在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下，小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)量均顯著上升，表明TaWRKY35參與對(duì)4種逆境脅迫的應(yīng)答。在外源ABA誘導(dǎo)下，TaWRKY35表達(dá)模式呈波浪形，在1.5 h達(dá)到一個(gè)初級(jí)峰值，約為對(duì)照的8倍，而后逐漸降低，12 h時(shí)表達(dá)量降至最低，隨后又逐步回升，48 h達(dá)到最大值（約為對(duì)照的13倍），表明TaWRKY35可能在ABA信號(hào)通路中起作用（圖3-A）。TaWRKY35對(duì)低溫脅迫比較敏感，低溫處理1 h即達(dá)到最大值，隨后急劇下降（圖3-B）。NaCl脅迫下，TaWRKY35的表達(dá)在24 h時(shí)達(dá)到高峰，約為對(duì)照的31倍，隨后迅速下降（圖3-C）。在PEG處理6 h時(shí)，TaWRKY35表達(dá)量達(dá)到第一個(gè)高峰，約為對(duì)照的4倍，隨后下降，在72 h表達(dá)量最高，約為對(duì)照的5倍（圖3-D），說(shuō)明TaWRKY35受滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

Ta：小麥；Hv：大麥；Bd：短柄草；Os：水稻；At：擬南芥；WRKY：WRKY轉(zhuǎn)錄因子。* 代表WRKY結(jié)構(gòu)域中核心序列WRKYGQK所在位置；? 代表鋅指結(jié)構(gòu)中半胱氨酸所在位置；◇ 代表鋅指結(jié)構(gòu)中組氨酸所在位置Ta： Triticum aestivum； Hv： Hordeum vulgare； Bd： Brachypodium distachyon； Os： Oryza sativa； At： Arabidopsis thaliana； WRKY： WRKY-type transcription factor. * indicates the WRKYGQK of WRKY domain； ? indicates the cysteine of zinc finger； ◇ indicates the histidine of zinc finger圖1　幾種植物WRKY序列比對(duì)（A）與系統(tǒng)進(jìn)化分析（B）Fig. 1 Alignment （A） and phylogenetic tree （B） of WRKYs from different plant species

GR：芽期根；GRB：幼芽根基；GP：胚芽；SR：苗期根；SRB：幼苗根基；SL：苗期葉片；BR：孕穗期根；BN：孕穗期莖節(jié)；BL：孕穗期葉片；BE：孕穗期穗。以苗期葉片中的TaWRKY35表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ± SEGR： Germination stage root； GRB： Germination stage root base； GP： Germ； SR： Seeding stage root； SRB： Seeding stage root base； SL： Seeding stage leaf blade；BR： Booting stage root； BN： Booting stage node； BL： Booting stage leaf； BE： Booting stage ear. The expression level of TaWRKY35 in seedling leaf （SL） is assigned a value of 1. Values are the mean ± SE of three biological replicates圖2　TaWRKY35在小麥不同發(fā)育時(shí)期的組織特異性表達(dá)Fig. 2 Dynamic expression of TaWRKY35 in multi-tissue at different stages of wheat

2.6 TaWRKY35亞細(xì)胞定位

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TaWRKY35定位在細(xì)胞核上。用激光共聚焦顯微鏡觀察小麥原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)TaWRKY35：：GFP只在細(xì)胞核上有熒光信號(hào)，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中無(wú)GFP信號(hào)（圖4），表明TaWRKY35特異定位在細(xì)胞核上。

圖3　脅迫條件下小麥幼苗TaWRKY35的表達(dá)模式Fig. 3 Expression patterns of TaWRKY35 in wheat seedlings under different treatments

圖4　TaWRKY35特異定位在小麥細(xì)胞核中Fig. 4 TaWRKY35 specifically locates in the nucleus in wheat

2.7 過(guò)表達(dá)TaWRKY35能提高擬南芥的耐鹽性

根據(jù)轉(zhuǎn)基因株系中TaWRKY35表達(dá)水平，選取表達(dá)量相對(duì)較高的3個(gè)株系L-2、L-4和L-5分析基因功能（圖5）。將在MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗移至含有250 mmol·L-1NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，部分幼苗子葉開始變白（圖6-A）。

以轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L-1的表達(dá)量作為內(nèi)參；數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ± SEThe lowest expression of TaWRKY35 in transgenic Arabidopsis line L-1 was regarded as standard. Data represent means ± SE of three replicates圖5　TaWRKY35在5個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的表達(dá)水平Fig. 5 Expression levels of TaWRKY35 in five transgenic Arabidopsis lines

將種在篩盤中的擬南芥幼苗用200 mmol·L-1NaCl溶液處理7 d，野生型植株葉片明顯黃化，而轉(zhuǎn)基因株系的葉片僅略微黃化；鹽處理21 d，近55％的野生型植株死亡，而轉(zhuǎn)基因株系的存活率為70％—75％。為進(jìn)一步驗(yàn)證 TaWRKY35過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性，在土壤中進(jìn)行了耐鹽性鑒定試驗(yàn)，結(jié)果和培養(yǎng)皿上的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果基本吻合，如圖6-B所示?？紤]到土壤中的鑒定更接近自然條件下鹽脅迫的實(shí)際情況，故此處使用了土壤中存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

細(xì)胞膜穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明，TaWRKY35過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系細(xì)胞膜穩(wěn)定性顯著高于野生型對(duì)照（圖6-C）。

A：NaCl處理7 d的擬南芥表型；B：NaCl處理的擬南芥存活率比較；C：NaCl處理的細(xì)胞膜穩(wěn)定性（CMS）比較，數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值 ±SE；* 表示轉(zhuǎn)基因株系與野生型在0.05概率水平有顯著差異（t-檢驗(yàn)）。WT：擬南芥野生型；L-2、L-4和L-5：3個(gè)TaWRKY35過(guò)表達(dá)擬南芥株系A(chǔ)： Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days； B： Plant survival rates in soil saturated with NaCl solution； C： Comparison of seedling cell membrane stability （CMS） of Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days. Values are the mean ± SE of three biological replicates. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at 0.05 probability level （t-test）. Values are the mean ± SE of three biological replicates. WT： Wild type； L-2， L-4 and L-5：Three individual TaWRKY35 transgenic lines圖6　TaWRKY35過(guò)量表達(dá)能提高擬南芥的耐鹽性Fig. 6 Overexpression of TaWRKY35 confers enhanced tolerance to salt stress in Arabidopsis

3 討論

植物基因的時(shí)空表達(dá)是其參與不同生命過(guò)程的直接反映。在不同逆境脅迫條件下，基因的功能不同，其表達(dá)模式也千差萬(wàn)別，調(diào)節(jié)基因通常在逆境脅迫的早期表達(dá)，而功能基因的表達(dá)則相對(duì)滯后［25］。本研究發(fā)現(xiàn)TaWRKY35受ABA、PEG、NaCl和低溫等多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)不同逆境脅迫條件下基因的表達(dá)模式差異顯著，說(shuō)明該基因參與對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答，暗示TaWRKY35在不同逆境應(yīng)答途徑中參與的調(diào)節(jié)機(jī)制可能不同。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位一定程度上反映了其行使功能的部位。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明 TaWRKY35可能定位在細(xì)胞核中，亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)一步證明TaWRKY35-GFP融合蛋白僅出現(xiàn)在細(xì)胞核中，該結(jié)果與已發(fā)表的一些 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致［26］，同時(shí)也與TaWRKY35作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控基因的表達(dá)相吻合。

在正常生長(zhǎng)條件下，TaWRKY35過(guò)表達(dá)擬南芥和野生型對(duì)照在表型上沒(méi)有差異，但在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉白化率顯著低于對(duì)照（圖 6-A），同時(shí)幼苗存活率顯著高于野生型（圖 6-C）。細(xì)胞膜穩(wěn)定性是衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，在高鹽條件下植物細(xì)胞膜透性通常會(huì)增加，但耐鹽植物質(zhì)膜透性變化較小，因此，細(xì)胞膜穩(wěn)定性較高，而鹽敏感植物則正好相反。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜穩(wěn)定性顯著高于野生型對(duì)照（圖 6-B），進(jìn)一步證明TaWRKY35提高了擬南芥的耐鹽性。在增強(qiáng)植物的耐鹽性方面，TaWRKY35與之前報(bào)道的 BcWRKY46、TaWRKY2、TaWRKY19、TaWRKY44和 HvWRKY38的功能相似［20，22，27-29］。

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在ABA、PEG脅迫條件下TaWRKY35表達(dá)量顯著升高。在表型分析時(shí)，在MS培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型分別進(jìn)行了ABA（60 μmol·L-1）和甘露醇（200 mmol·L-1）脅迫處理，發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因株系的表型差異不明顯，這可能與TaWRKY35在信號(hào)調(diào)節(jié)通路中的作用有關(guān)，這一現(xiàn)象與GmWRKY21、GmWRKY54轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)的表型類似［16］。比較TaWRKY35在不同逆境脅迫下的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在鹽脅迫下表達(dá)量最高，該結(jié)果與其過(guò)表達(dá)提高植物的耐鹽性吻合。

近期人們對(duì) WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、功能以及在其調(diào)控脅迫應(yīng)答反應(yīng)、信號(hào)分子傳遞、植物衰老以及器官發(fā)育等一系列生理活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行了大量的研究，然而對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的植物應(yīng)答反應(yīng)及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究較少，未來(lái)應(yīng)將更多的精力聚焦于解析WRKY在抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。

4 結(jié)論

從小麥品種旱選10號(hào)中克隆到WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY35。TaWRKY35的N端含有典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，C端含有 C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于WRKY家族的亞家族Ⅲ，定位于細(xì)胞核中。TaWRKY35在小麥幼苗根基部位表達(dá)量最高，其次為幼芽根基部，同時(shí)TaWRKY35受ABA、低溫、高鹽和PEG-6000誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；過(guò)表達(dá)TaWRKY35能顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

References

［1］ SUZUKI N， RIVERO R M， SHULAEV V， BLUMWALD E，MITTLER R. Abiotic and biotic stress combinations. New Phytologist，2014， 203： 32-43.

［2］ MICKELBART M V， HASEGAWA P M， BAILEY-SERRES J. Genetic mechanisms of abiotic stress tolerance that translate to crop yield stability. Nature Reviews Genetics， 2015， 16： 237-251.

［3］ ISHIGURO S， NAKAMURA K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5' upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato. Molecular and General Genetics，1994， 244： 563-571.

［4］ EULGEM T， RUSHTON P J， ROBATZEK S， SOMSSICH I E. The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends in Plant Science， 2000， 5： 199-206.

［5］ MAEO K， HAYASHI S， KOJIMA-SUZUKI H， MORIKAMI A，NAKAMURA K. Role of conserved residues of the WRKY domain in the DNA-binding of tobacco WRKY family proteins. Bioscience，Biotechnology， and Biochemistry， 2001， 65： 2428-2436.

［6］ WU K L， GUO Z J， WANG H H， LI J. The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins. DNA Research， 2005， 12： 9-26.

［7］ CIOLKOWSKI I， WANKE D， BIRKENBIHL R P， SOMSSICH I E. Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function. Plant Molecular Biology， 2008， 68： 81-92.

［8］ RUSHTON P J， SOMSSICH I E， RINGLER P， SHEN Q J. WRKYtranscription factors. Trends in Plant Science， 2010， 15： 247-258.

［9］ RUSHTON D L， TRIPATHI P， RABARA R C， LIN J， RINGLER P，BOKEN A K， LANGUM T J， SMIDT L， BOOMSMA D D， EMME N J， CHEN X， FINER J J， SHEN Q J， RUSHTON P J. WRKY transcription factors： Key components in abscisic acid signalling. Plant Biotechnology Journal， 2012， 10： 2-11.

［10］ LI C， Lü J， ZHAO X， AI X， ZHU X， WANG M， ZHAO S， XIA G. TaCHP： A wheat zinc finger protein gene down-regulated by abscisic acid and salinity stress plays a positive role in stress tolerance. Plant Physiology， 2010， 154： 211-221.

［11］ LI H， XU Y， XIAO Y， ZHU Z， XIE X， ZHAO H， WANG Y. Expression and functional analysis of two genes encoding transcription factors， VpWRKY1 and VpWRKY2， isolated from Chinese wild Vitis pseudoreticulata. Planta， 2010， 232： 1325-1337.

［12］ JIANG Y， DEYHOLOS M K. Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses. Plant Molecular Biology， 2009， 69： 91-105.

［13］ LI S， FU Q， CHEN L， HUANG W， YU D. Arabidopsis thaliana WRKY25， WRKY26， and WRKY33 coordinate induction of plant thermotolerance. Planta， 2011， 233： 1237-1252.

［14］ LI S， FU Q， HUANG W， YU D. Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor WRKY25 in heat stress. Plant Cell Reports， 2009，28： 683-693.

［15］ SUN J， HU W， ZHOU R， WANG L， WANG X， WANG Q， FENG Z，LI Y， QIU D， HE G， YANG G. The Brachypodium distachyon BdWRKY36 gene confers tolerance to drought stress in transgenic tobacco plants. Plant Cell Reports， 2015， 34： 23-35.

［16］ ZHOU Q Y， TIAN A G， ZOU H F， XIE Z M， LEI G， HUANG J，WANG C M， WANG H W， ZHANG J S， CHEN S Y. Soybean WRKY-type transcription factor genes， GmWRKY13， GmWRKY21，and GmWRKY54， confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants. Plant Biotechnology Journal， 2008， 6：486-503.

［17］ WU X， SHIROTO Y， KISHITANI S， ITO Y， TORIYAMA K. Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter. Plant Cell Reports， 2009， 28： 21-30.

［18］ RAINERI J， WANG S， PELEG Z， BLUMWALD E， CHAN R L. The rice transcription factor OsWRKY47 is a positive regulator of the response to water deficit stress. Plant Molecular Biology， 2015， 88：401-413.

［19］ OKAY S， DERELLI E， UNVER T. Transcriptome-wide identification of bread wheat WRKY transcription factors in response to drought stress. Molecular Genetics and Genomics， 2014， 289： 765-781.

［20］ WANG X， ZENG J， LI Y， RONG X， SUN J， SUN T， LI M， WANG L，F(xiàn)ENG Y， CHAI R， CHEN M， CHANG J， LI K， YANG G， HE G. Expression of TaWRKY44， a wheat WRKY gene， in transgenic tobacco confers multiple abiotic stress tolerances. Frontiers in Plant Science，2015， 6： 615.

［21］ WANG C， DENG P， CHEN L， WANG X， MA H， HU W， YAO N，F(xiàn)ENG Y， CHAI R， YANG G， HE G. A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco. PLoS One， 2013， 8： e65120.

［22］ NIU C F， WEI W， ZHOU Q Y， TIAN A G， HAO Y J， ZHANG W K，MA B， LIN Q， ZHANG Z B， ZHANG J S， CHEN S Y. Wheat WRKY genes TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell and Environment， 2012， 35：1156-1170.

［23］ QIN Y， TIAN Y， LIU X. A wheat salinity-induced WRKY transcription factor TaWRKY93 confers multiple abiotic stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2015， 464： 428-433.

［24］ LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method. Methods， 2001， 25： 402-408.

［25］ PANDEY S P， SOMSSICH I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. Plant Physiology， 2009， 150： 1648-1655.

［26］ ZOU C， JIANG W， YU D. Male gametophyte-specific WRKY34 transcription factor mediates cold sensitivity of mature pollen in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany， 2010， 61： 3901-3914.

［27］ WANG F， HOU X， TANG J， WANG Z， WANG S， JIANG F， LI Y. A novel cold-inducible gene from Pak-choi （Brassica campestris ssp. chinensis）， BcWRKY46， enhances the cold， salt and dehydration stress tolerance in transgenic tobacco. Molecular Biology Reports， 2012， 39：4553-4564.

［28］ XIONG X， JAMES V A， ZHANG H， ALTPETER F. Constitutive expression of the barley HvWRKY38 transcription factor enhances drought tolerance in turf and forage grass （Paspalum notatum Flugge）. Molecular Breeding， 2009， 25： 419-432.

［29］ XU Y， HU W， LIU J， ZHANG J， JIA C， MIAO H， XU B， JIN Z. A banana aquaporin gene， MaPIP1；1， is involved in tolerance to drought and salt stresses. BMC Plant Biology， 2014， 14： 59.

（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and Characterization of Transcription Factor TaWRKY35 in Wheat （Triticum aestivum）

LIU Zi-cheng1， 2， MIAO Li-li2， WANG Jing-yi2， YANG De-long1， MAO Xin-guo1，2， JING Rui-lian2
（1College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070；2Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization， Ministry of Agriculture， Beijing 100081）

Abstract：【Objective】Abiotic stresses are major limitations to wheat production worldwide. Transcription factors play crucialroles in abiotic stress signaling in plants. It is predicted that there are at least 200 WRKY genes in common wheat genomes， yet only a few of them have been functionally characterized. The aim of this study is to decipher the roles of WRKY transcription factors in abiotic stress signaling and facilitate the utilization of WRKY genes in the improvement of abiotic stress tolerance in wheat. 【Method】A wheat WRKY gene designated TaWRKY35 was cloned via the wheat full-length cDNA libraries. Quantitative real-time PCR was performed to identify the dynamic expression of target gene in different tissues at various developmental stages， and to characterize the transcriptional patterns responding to ABA， PEG， NaCl and low temperature treatments in wheat. To probe the subcellular location of TaWRKY35， the construct encoding TaWRYK35：：GFP fusion protein was transferred into wheat protoplast by PEG mediated method. To characterize the function of TaWRYK35， target gene driven by the 35S promoter was delivered into Arabidopsis by Agrobacterium mediated method. 【Result】The cDNA of TaWRYK35 contains an 1 134 bp open reading frame，encoding a 377- amino acid protein. TaWRYK35 possesses a typical WRKY domain in the N-terminal and a C2HC type zinc finger domain in the C-terminal， belonging to group III of WRKY family. In 32 hexaploid wheat materials of highly polymorphic，TaWRKY35 coding region sequence is very conservative. The dynamic expression of TaWRKY35 was identified in different tissues at various developmental stages， and the highest expression occurred in the root base of seedling， while the lowest expression was observed in seedling leaf. Furthermore， its transcript was inducible by ABA， PEG， NaCl and low temperature treatments， yet the expression patterns to difference stress varied significantly. Subcellular localization indicated that TaWRKY35 specifically located in the nucleus. Overexpression of TaWRKY35 resulted in enhanced tolerance to high salinity， supported by improved cell membrane stability and survival rate relative to wild type Arabidopsis. 【Conclusion】TaWRKY35 transcription factor contains a WRKY and a C2HC type zinc finger domain， belonging to subgroup III of the WRKY family. The expression of TaWRKY35 occurs in different tissues at various developmental stages， and TaWRKY35 is an abiotic stress responsive gene. Overexpression of TaWRKY35 confers remarkably enhanced tolerance to high salinity.

Key words：wheat； WRKY transcription factor gene； abiotic stress； salt tolerance

收稿日期：2016-03-04；接受日期：2016-04-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2011AA100501）、北京市自然科學(xué)基金（BJNSF6132030）