激光共聚焦檢測(cè)雙酚A致精母細(xì)胞損傷后線粒體膜電位的變化

王麗婷孫 瑋*

?

激光共聚焦檢測(cè)雙酚A致精母細(xì)胞損傷后線粒體膜電位的變化

王麗婷①孫 瑋①*

王麗婷,女,(1982- ),本科學(xué)歷，實(shí)驗(yàn)師。第三軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試中心，從事生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試工作。

目的：運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)技術(shù)檢測(cè)雙酚A(BPA)致精母細(xì)胞損傷后線粒體膜電位的變化，探討其作用機(jī)制。方法：將培養(yǎng)的GC-2小鼠精母細(xì)胞分為對(duì)照組、低劑量組和高劑量組，分別加入0、10 μmol/L、100 μmol/L的BPA，一同培養(yǎng)3 h后使用熒光探針JC-1對(duì)3個(gè)組樣本分別進(jìn)行標(biāo)記，采用LSCM檢測(cè)胞內(nèi)線粒體內(nèi)JC-1熒光強(qiáng)度的變化。利用LSCM專用軟件分析熒光強(qiáng)度，通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變檢測(cè)線粒體膜電位的變化，用紅綠熒光的相對(duì)比例衡量線粒體去極化的比例。結(jié)果：對(duì)照組、低劑量組和高劑量組之間紅綠熒光的比值有著顯著差異。BPA低劑量組和高劑量組的胞內(nèi)線粒體膜電位明顯低于對(duì)照組，而高劑量組的胞內(nèi)線粒體膜電位較低劑量組低。結(jié)論：BPA對(duì)精母細(xì)胞有損傷，且隨著劑量加大，損傷越嚴(yán)重。LSCM技術(shù)方法靈敏度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。

激光掃描共聚焦顯微鏡；雙酚A；精母細(xì)胞；線粒體膜電位；熒光成像；熒光探針JC-1

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.02.034

①第三軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試中心 重慶 400038

[First-author’s address] Biomedical Analysis Center, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China.

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，存在于環(huán)境中一些人工合成的化學(xué)物質(zhì)具有體內(nèi)雌激素的生物效應(yīng)可干擾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)正常的內(nèi)分泌功能，并可造成動(dòng)物的雄雌性別改變及畸形，這類物質(zhì)稱為環(huán)境雌激素，已經(jīng)成為人類健康的潛在威脅[1]。

雙酚A[雙酚基丙烷(bisphenol A，BPA)]是烷基酚類環(huán)境雌激素的一種，作為工業(yè)生產(chǎn)聚碳酸脂、環(huán)氧樹脂的前體物質(zhì)，是塑料制品、合成樹脂的重要原料和添加劑。BPA被廣泛應(yīng)用于食品、牙齒密封劑及嬰兒奶瓶等家用器具的制造[2]。當(dāng)這些物品反復(fù)使用或暴露于高溫、酸和堿的環(huán)境中時(shí)，BPA則會(huì)從中釋放或溶出，人體可通過食物和水經(jīng)常暴露低劑量的BPA[3]。BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，具有弱雌激素活性及較強(qiáng)的抗雄激素活性，能直接或通過其衍生物干擾生物的正常內(nèi)分泌功能，BPA可導(dǎo)致生精細(xì)胞大量凋亡[4-6]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸和能量代謝的中心。作為細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化的主要場(chǎng)所，細(xì)胞內(nèi)約90%的氧在線粒體被消耗，因此線粒體在維持細(xì)胞生命活動(dòng)中起著極為重要的作用。線粒體的損傷可致線粒體膜屏障功能減弱甚至喪失、跨膜電位降低、細(xì)胞能量供應(yīng)中斷以及凋亡因子釋放等并激活下游凋亡信號(hào)通路，這些改變將直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[7-8]。而線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。

本研究使用線粒體膜電位探針JC-1標(biāo)記精母細(xì)胞線粒體，同時(shí)應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)技術(shù)，通過JC-1熒光從紅色到綠色的轉(zhuǎn)變檢測(cè)細(xì)胞膜電位的變化，從而探討不同劑量的BPA作用于體外培養(yǎng)精母細(xì)胞引起線粒體膜電位的變化誘發(fā)細(xì)胞早期凋亡的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)儀器。采用TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)，徠卡公司)。

(2)試劑。JC-1熒光探針(碧云天，中國(guó)南通)；Tyrode’s鹽溶液，含NaCl 115 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，NaH2PO41 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，葡萄糖 10 mmol/L，pH=7.4。DMEM培養(yǎng)基，含葡萄糖4.5 g/ L，L-谷氨酰胺4.5 g/L，丙酮酸鈉110 mg/L，鹽酸吡哆醇110 mg/L，10%的胎兒牛血清(洛根，UT)和青霉素-鏈霉素100 U/ml。

(3)耗材。共聚焦成像專用培養(yǎng)皿GBD-35-20 (NEST Biotechnology Co.LTD.耐思生物科技有限公司，無錫)。

(4)細(xì)胞。GC-2小鼠精母細(xì)胞系(第三軍醫(yī)大學(xué)勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室劉川惠贈(zèng))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將獲得的精母細(xì)胞系使用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境。

1.2.2 細(xì)胞處理

細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為對(duì)照組(無處理)，低劑量組(BPA 10 μmol/L)，高劑量組(BPA 100 μmol/L)3組，分別處理3 h。

1.2.3 細(xì)胞熒光標(biāo)記

(1)JC-1工作液配制。向裝有JC-1(200×)1 μl的EP管中加入超純水160 μl，JC-1緩沖液40 μl，顛倒混勻后避光放置。

(2)染色緩沖液配制。取JC-1染色緩沖液(5×)100 μl置于500μl的EP管中，向EP管中加入400μl超純水(1∶4)，配制適量的JC-1染色緩沖液(1×)放置于冰浴中。按同樣的步驟再配制2管染色緩沖液。

(3)細(xì)胞熒光標(biāo)記。單層貼壁細(xì)胞用PBS漂洗2次后，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入JC-1染色工作液100 μl，混勻，于37 ℃條件下孵育20 min。37 ℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。向每個(gè)培養(yǎng)皿加入2 ml培養(yǎng)液，使用LSCM進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位檢測(cè)

使用LSCM檢測(cè)對(duì)照組、低劑量組和高劑量組胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。

1.2.5 儀器參數(shù)的設(shè)置

JC-1單體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為514 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為529 nm；JC-1聚合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)為585 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。據(jù)此，設(shè)置單體的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，聚合物的激發(fā)波長(zhǎng)為561 nm。使用63×油浸物鏡(數(shù)值孔徑1.40)。所有圖像在同一條件(針孔大小、光電倍增管電壓高低等)下采集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。每組樣本數(shù)均為100(n=100)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P≤0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCM檢測(cè)圖像

JC-1染料表現(xiàn)出電勢(shì)依賴性的積聚在線粒體內(nèi)，可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。當(dāng)細(xì)胞處于理想狀態(tài)時(shí)線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)可產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)細(xì)胞受到不同程度損傷后線粒體膜電位會(huì)逐漸降低，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1解聚為單體(monomer)可產(chǎn)生綠色熒光。因此，細(xì)胞顏色的變化非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。

(1)線粒體的去極化程度通過紅綠熒光強(qiáng)度的比值衡量，精母細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)為綠色熒光弱或紅色熒光強(qiáng)，如圖1-Control所示。

(2)加入10 μmol/L BPA培養(yǎng)3 h后，表現(xiàn)為綠色熒光略有增強(qiáng)，紅色熒光略有減弱，如圖1-10 μmol/ L BPA所示。

(3)隨著BPA處理濃度進(jìn)一步升高，綠色熒光明顯強(qiáng)于對(duì)照組和低劑量組，紅色熒光除個(gè)別細(xì)胞比較強(qiáng)以外，主要也成下降趨勢(shì)，如圖1-100 μmol/L BPA所示。

2.2 LSCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光比率變化

圖1顯示，細(xì)胞染毒3 h后與對(duì)照組相比，10 μmol/L和100 μmol/L BPA低劑量組和高劑量組細(xì)胞JC-l聚合物紅光和(或)JC-1單體綠光的值降低非常顯著；與10 μmol/L BPA低劑量組和高劑量組相比，100 μmol/LBPA低劑量組和高劑量組細(xì)胞JC-l聚合物紅光和(或)JC-1單體綠光的值顯著降低(t=21.61，t=18.48；P＜0.05)，表明隨處理濃度(10μmol/L和100μmol/L)的升高，細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降；對(duì)照組及低劑量組和高劑量組胞內(nèi)JC-1紅和(或)綠熒光比率測(cè)定值見表1。

圖1 不同濃度BPA處理后的GC-2精母細(xì)胞系JC-1熒光圖像

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器，線粒體膜電位是指線粒體內(nèi)膜兩側(cè)離子濃度不同所產(chǎn)生的跨膜電位差，是三磷酸腺苷(adenosin triphosphate，ATP)合成和釋放的動(dòng)力，該跨膜電位對(duì)維持線粒體正常功能是必要的，是評(píng)價(jià)線粒體功能的敏感指標(biāo)[9]。研究表明，線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器。凋亡機(jī)制的深入研究表明，在所有誘導(dǎo)劑引起的各種類型的細(xì)胞凋亡中均出現(xiàn)線粒體膜電位下降，并且這種改變發(fā)生于凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變之前，提示線粒體膜電位下降為凋亡早期階段。有實(shí)驗(yàn)研究證明，一旦出現(xiàn)線粒體膜電位下降，細(xì)胞即進(jìn)入不可逆的凋亡過程[10-11]。精母細(xì)胞是介導(dǎo)生殖功能的雄性生殖細(xì)胞，線粒體膜電位的下降可導(dǎo)致精母細(xì)胞功能變化，可能是精母細(xì)胞功能障礙的原因之一。因此，線粒體膜電位的下降可作為觀測(cè)毒物對(duì)精母細(xì)胞功能的重要指標(biāo)之一。

表1 雙酚A處理后細(xì)胞內(nèi)JC-1紅綠熒光比值的變化(±s)

表1 雙酚A處理后細(xì)胞內(nèi)JC-1紅綠熒光比值的變化(±s)

注：表中*為低劑量組與對(duì)照組比較；**為高劑量組與低劑量組比較。

低對(duì)組 劑照別 量組 組雙酚A濃度1 00 ( μ mol/L) 0 2.熒.860 光1±±比00.值.087 3*21 t值-.6 1 ＜P0-值.01高劑量組 100 0.58±0.09**18.48 ＜0.05

BPA是塑料制品的主要環(huán)境污染成分，可能是導(dǎo)致男性生殖功能損傷的重要因素。既往研究發(fā)現(xiàn)，BPA可能損傷線粒體功能，有數(shù)據(jù)表明，BPA暴露增加細(xì)胞色素C，誘導(dǎo)凋亡因子Caspase-3和Caspase-9以及Bax的蛋白和mRNA的表達(dá)水平，增強(qiáng)Caspase-3和Caspase-9的活動(dòng)，并增加生精細(xì)胞凋亡指數(shù)。此外，BPA暴露后觀察到線粒體結(jié)構(gòu)異常以及Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平減少。這些結(jié)果表明，線粒體途徑凋亡參與介導(dǎo)BPA暴露引起的生殖系統(tǒng)功能損害[12]。BPA暴露后可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶和線粒體超氧化物增多，并在較低劑量下觀察到雙酚A損害肝臟線粒體功能[13-14]。實(shí)驗(yàn)證明，青春期BPA暴露引起睪丸生殖細(xì)胞凋亡不僅通過Fas、FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而且也通過線粒體凋亡途徑[15]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，BPA具有降低精母細(xì)胞線粒體膜電位的作用，提示線粒體膜電位降低是導(dǎo)致精母損傷的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究以紅和(或)綠熒光強(qiáng)度的比值來衡量線粒體膜電位變化，該實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果可知，BPA作用于精母細(xì)胞即出現(xiàn)線粒體膜電位的降低。低劑量組和高劑量組較正常對(duì)照組線粒體膜電位下降非常顯著；BPA高劑量組較低劑量組線粒體膜電位下降有顯著性差異。鑒于紅和(或)綠熒光強(qiáng)度的比例越小，胞內(nèi)線粒體膜電位下降越顯著，表明BPA對(duì)精母細(xì)胞有損傷，且隨著劑量加大損傷越嚴(yán)重。BPA處理精母細(xì)胞線粒體膜電位的降低，表示精母細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，證明BPA可能具有導(dǎo)致精母細(xì)胞損傷的能力，提示BPA具有男性生殖系統(tǒng)損傷的潛在能力。

4 結(jié)論

目前線粒體膜電位的檢測(cè)方法主要有LSCM技術(shù)及流式細(xì)胞技術(shù)。流式細(xì)胞儀能夠一次檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞(通常＞10000個(gè))，得到統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，避免個(gè)體差異，但是需要先把細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，可能會(huì)造成細(xì)胞損傷。而LSCM檢測(cè)比較簡(jiǎn)單，觀察效果直觀，方便且實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的雄性小鼠精母細(xì)胞，采用以不同劑量的BPA進(jìn)行誘導(dǎo)，建立雙酚A的損傷模型，以JC-1進(jìn)行負(fù)載，通過激光掃描共聚焦顯微鏡獲取細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的圖像，不僅能定量分析不同低劑量的BPA能夠引起精母細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化趨勢(shì)，還能夠直觀線粒體形態(tài)，以及隨著損傷程度加大線粒體形態(tài)的變化。本研究不但為BPA致精母損傷提供依據(jù)，同時(shí)為細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位研究提供了可靠靈敏的實(shí)驗(yàn)方法。

[1]Geefer F,Gandini P,Andy S,et a1.Mechanism of apoptosis by EDs[J].Mol Biol,1999,11:479-500.

[2]Waring RH,Harris RM.Endocrine disruptors-A threat to women health[J].Maturitas,2011,68(2): 111-115.

[3]Rubin BS.Bisphenol A:An endocrine disruptor with widespread exposure and multiple effects[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2011, 127(1-2):27-34.

[4]Sander C,Green DR.Estrogen-induced apoptos is in a tamoxifen stimulated MCF-7 model[J].Breast Cancer,200l,34:l246-1251.

[5]Van der Ven LT,Van de Kuil T,Verhoef A,et a1.Endocine effects of tetrabromobisphenol-A(TBBPA)in Wistar rats as tested in a onegeneration reproduction study and a subacute toxicity study[J].Toxicology,2008,245(1-2): 76-89.

[6]靳翠紅,趙劍,金一和,等.雙酚A對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,31(2):123-124.

[7]Szydlowska K,Tymianski M.Calcium,isehemia and excitotoxicity[J].Cell Calcium,2010,47(2): 122-129.

[8]Rasheva Vl,Domingos PM.Cellular responses to endoplasmic reticulum stress and apoptosis[J].Apoptosis,2009,14(8):996-1007.

[9]Kroemer G,Zamzami N,Susin SA.Mitochondrial control of apoptosis[J].Immunology Today,1977, 18(1):44-51.

[10]Yuan-Jie Li,Tian-Bao Song.Bisphenol A Exposure Induces Apoptosis and Upregulation of Fas/FasL and Caspase-3 Expression in the Testes of Mice[J].TOXICOLOGICAL SCIENCES, 2009,108(2):427-436.

[11]孟祥東,于景華,嚴(yán)云勤,等.雙酚A體外誘導(dǎo)雄性小鼠生殖細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制[J].毒理學(xué)雜志, 2007,21(3):201-204.

[12]Wang P,Luo C,Li Q,et al.Mitochondrionmediated apoptosis is involved in reproductive damage caused by BPA in male rats[J].Environ Toxicol Pharmacol,2014,38(3):1025-1033.

[13]Babu S,Uppu S,Claville MO,et a1.Prooxidant actions of bisphenol A(BPA)phenoxyl radicals:implications to BPA-related oxidative stress and toxicity[J].Toxicol Mech Methods, 2013,23(4):273-280.

[14]Moon MK,Kim MJ,Jung IK,et al.Bisphenol A impairs mitochondrial function in the liver at doses below the no observed adverse effect level[J].J Korean Med Sci,2012,27(6):644-652.

[15]Wang Q,Zhao XF,Ji YL,et al.Mitochondrial signaling pathway is also involved in bisphenol A induced germ cell apoptosis in testes[J].Toxicol Lett,2010,30,199(2):129-135.

The changes of mitochondrial membrane potential detected by confocal microscopy in spermatocyte induced by bisphenol A

WANG Li-ting, SUN Wei// China Medical Equipment,2016,13(2):106-109.

Objective: To detect changes in mitochondrial membrane potential after sperm mother cell damage induced by bisphenol A by laser scanning confocal microscopy(LSCM) and underline its potential action mechanism.Methods: The cultured spermatogenic cells were divided into 3 groups, respectively.Then 0, 10μmol/L, 100 μmol/L of Bisphenol A(BPA) were added into the culture, after 3 hours culture, fluorescence probe JC-1 was used to lable the three groups.The fluorescence intensity of JC-1 in mitochondrial was then detected by LSCM.LSCM software was used to analyze the fluorescence intensity.Change of the mitochondrial membrane potential was represented by the change of fluorescence colors (relative proportion of red and green fluorescence is commonly used to measure mitochondrial depolarization ratio).Results: The ratio between the red and green fluorescence in the control group, low dose group and high dose group had significant difference.Intracellular mitochondrial membrane potential of Bisphenol A treatment group was lower than that of the control group, while mitochondrial membrane potential of high dose group was lower than that of the low dose group.Conclusion: Bisphenol A could damage spermatocytes, and as the dose increased, the more serious the injury.The method could real-time monitor with high sensitivity the change of intracellular mitochondrial membrane potential.

Laser scanning confocal microscopy; Bisphenol A; Sperm mother cell; Mitochondria membrane potential; Fluorescence imaging; Fluorescence probe JC-1

sunwei772@126.com

1672-8270(2016)02-0106-04

R197.324

A

2015-10-26