基于蛋白質(zhì)組學(xué)的高丹草苗期雜種優(yōu)勢分析

韓平安逯曉萍，*米福貴張瑞霞李美娜薛春雷董 婧叢夢露

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；3呼和浩特市種子管理站， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

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基于蛋白質(zhì)組學(xué)的高丹草苗期雜種優(yōu)勢分析

韓平安1逯曉萍1，*米福貴2張瑞霞3李美娜3薛春雷1董 婧1叢夢露1

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；3呼和浩特市種子管理站， 內(nèi)蒙古呼和浩特 010020

摘 要：高丹草是代表性的利用雜種優(yōu)勢的飼用牧草， 本研究以雜種高丹草及其親本三葉期葉片為試材， 采用雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法， 進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。凝膠上檢測到的可重復(fù)蛋白點(diǎn)400多個， 其中雜種與親本間達(dá)到了顯著水平的差異蛋白點(diǎn)34個， 包括顯性（單親沉默3個， 偏高親表達(dá)17個， 偏低親表達(dá)5個）和超顯性表達(dá)（特異表達(dá)1個， 超高親表達(dá)6個， 超低親表達(dá)2個）模式， 因此推測顯性和超顯性效應(yīng)共同促進(jìn)高丹草雜種優(yōu)勢的形成， 且顯性效應(yīng)作用更大。同時， 成功鑒定出其中的27個蛋白點(diǎn)涉及到8個功能類別， 即光合作用、碳水化合物代謝、脅迫響應(yīng)、ATP合成、蛋白質(zhì)合成、電子轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及未知蛋白。高丹草所占比例最大的光合蛋白多數(shù)呈上調(diào)表達(dá)， 表明雜種葉片光合作用增強(qiáng)進(jìn)而同化更多的有機(jī)物是雜種優(yōu)勢形成的主要原因。網(wǎng)絡(luò)互作的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白為雜種優(yōu)勢特異蛋白的基因操作提供了靶蛋白。本研究在蛋白質(zhì)水平為高丹草雜種優(yōu)勢分析提供了理論依據(jù)， 也為其他飼草作物的相關(guān)研究提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：高丹草； 葉片； 雜種優(yōu)勢； 蛋白質(zhì)組

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31160302， 31460375）和呼和浩特市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-重計(jì)-8-2）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31160302， 31460375） and the Science and Technology Plan Projects of Hohhot （2012-major plans-8-2）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ hanpingan327@163.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160218.1503.010.html

高丹草（Sorghum bicolor × S.sudanense）為高粱（Sorghum bicolor L.）與蘇丹草［Sorghum sudanense （Piper） Stapf］雜交產(chǎn)生的一年生禾本科飼用牧草，綜合了親本的諸多優(yōu)點(diǎn)， 產(chǎn)草量高， 分蘗和再生性好， 抗非生物脅迫（干旱、鹽堿、低溫）能力強(qiáng)， 草質(zhì)柔軟， 深受牛羊的喜愛， 在生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景［1-2］。高丹草是非常典型的利用雜種優(yōu)勢的飼草作物， 然而關(guān)于雜種優(yōu)勢分子機(jī)制仍然沒有一致性的解釋。雜種優(yōu)勢最早期的經(jīng)典理論主要是顯性假說［3-4］、超顯性假說［5-6］和上位性假說［7-8］， 這些假說雖然都有足夠的證據(jù)支持， 但僅僅是概念性的理論，不能在分子水平解釋雜種優(yōu)勢。

近年來， 已分別在基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組水平上大量研究不同作物雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制。眾多研究成果表明加性表達(dá)、非加性表達(dá)以及表觀遺傳對雜種優(yōu)勢有促進(jìn)作用。Stupar和Springer［9］對玉米親本和F1的幼穗和胚研究顯示， 雜種與親本間基因差異表達(dá)模式中80%的基因?yàn)榧有员磉_(dá)模式，20%為非加性表達(dá)， 且數(shù)據(jù)表明親本的順式作用因子的變化導(dǎo)致F1的加性表達(dá)。Zhang等［10］認(rèn)為小RNA是超級稻雜種優(yōu)勢的重要調(diào)控因子。另外， 有相關(guān)報(bào)道表明， DNA甲基化在雜種優(yōu)勢形成上起重要作用［11-12］。

蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展為解析雜種優(yōu)勢的分子機(jī)理提供了新方法。目前， 基于凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已在很多作物上進(jìn)行了雜種優(yōu)勢形成機(jī)理的研究。Song等［13-14］先后利用雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對小麥的根、葉蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， 雜種與親本的蛋白豐度存在顯著差異， 且這些差異蛋白涉及碳水化合物代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、脅迫響應(yīng)等多種功能類別， 可能與雜種優(yōu)勢形成相關(guān)。Wang等［15］對雜交稻以及親本成熟胚的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示， 54個差異表達(dá)蛋白分別參與營養(yǎng)儲存、脅迫響應(yīng)、代謝等生物學(xué)通路， 并且雜種儲藏蛋白為超高親表達(dá)， 脅迫響應(yīng)蛋白為加性表達(dá)， 這些研究成果為分析雜種優(yōu)勢提供了參考。進(jìn)茜寧等［16］對先玉335及其親本胚芽的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明， 雜種的蛋白點(diǎn)中有81%是非加性表達(dá)， 推測非加性蛋白的累積是胚芽雜種優(yōu)勢形成的主要原因。郭寶健等［17-18］分別以玉米雜交種及其親本自交系的苗期葉片， 雌穗花器官為試驗(yàn)材料， 利用雙向電泳結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成功建立了玉米幼葉、幼穗的差異蛋白表達(dá)譜，且雜種與親本的差異蛋白涉及多個功能類別， 推測與雜種優(yōu)勢形成相關(guān)。因而， 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制受到了廣大科研工作者的青睞。然而， 在蛋白質(zhì)水平上研究高丹草雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制還未見報(bào)道。本研究利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法對高丹草及其親本苗期葉片的雜種模式進(jìn)行定量分析， 通過鑒定差異蛋白旨在深入地剖析高丹草雜種優(yōu)勢形成的分子機(jī)制， 為雜種優(yōu)勢遺傳理論研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交種高丹草F1（11A×Bai）及其母本（高粱不育系11A）和父本（蘇丹草 Bai）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳育種教研室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高丹草苗期農(nóng)藝性狀的測定 將所有試驗(yàn)材料的種子分為3批， 作為3個生物學(xué)重復(fù)， 在光照培養(yǎng)箱中于28℃催芽24 h， 然后將其種在育苗砵里放進(jìn)光照培養(yǎng)箱， 于為28℃光培養(yǎng)16 h， 25℃暗培養(yǎng)8 h， 在三葉期收獲葉片， 同時對每個生物學(xué)重復(fù)的所有基因型隨機(jī)選取 10株， 測量第 3片葉的葉長、葉寬、株高、以及10株的鮮重、干重， 并計(jì)算各性狀的中親優(yōu)勢。中親優(yōu)勢（ MPH）%=（ F1-雙親平均）/雙親平均×100。將所有收集的試驗(yàn)材料立即在液氮里固定后放于-80℃冰箱保存待用。

1.2.2 高丹草葉片總蛋白的提取 參照Ajit等［19］和 Han等［20］方法并加以改進(jìn)提取高丹草葉片總蛋白。將每個試驗(yàn)材料的 3個生物學(xué)重復(fù)的葉片等量混合后稱取1 g， 剪碎放入研缽中， 加液氮磨成粉末后加入10 mL裂解緩沖液（LB， 含8 mol L-1尿素， 2 mol L-1硫尿， 4% CHAPS， 20 mmol L-1Tris-base， 30 mmol L-1二硫蘇糖醇， 2%兩性電解質(zhì)pH 4～7）， 混合的勻漿經(jīng)超聲處理后， 在冰上裂解1 h， 在25 000×g，4℃條件下離心30 min取上清液， 將預(yù)冷的3倍體積的丙酮加入上清液， 放4℃冰箱沉淀除鹽2 h， 隨后離心15 min （25 000×g， 4℃）， 所得沉淀在同樣條件下用冷丙酮洗滌2次， 棄去上清液， 收集沉淀， 經(jīng)室溫干燥后加 LB使其完全溶解， 所得溶液即為蛋白樣品。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白樣品濃度后分裝，置-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙向電泳 每個樣品的蛋白雙向電泳分析均進(jìn)行 3次技術(shù)重復(fù)， 且上樣量均為 800 μg， 采用pH 4～7， 17 cm非線性IPG膠條（Bio-Rad）。20℃條件下， 第一向等電聚焦程序設(shè)置為∶ 50 V主動水化14 h， 250 V線性30 min， 1000 V快速30 min， 9000 V線性5 h， 9000 V快速9000 Vh。等電聚焦結(jié)束后， 將IPG膠條在平衡液I （0.375 mol L-1Tris-HCl （pH 8.8），6 mol L-1尿素， 20%甘油， 2%SDS， 2%DTT）、平衡液II ［0.375 mol L-1Tris-HCl （pH 8.8）， 6 mol L-1尿素，20%甘油， 2%SDS， 2.5%碘乙酰胺］中先后平衡 15 min， 然后配制 12%的 SDS-PAGE凝膠對平衡后的IPG膠條進(jìn)行第二向分離。待電泳結(jié)束后， 將凝膠于G-250考馬斯亮藍(lán)染液中染色12 h。

1.2.4 凝膠圖像處理 用 UMAX Powerlook （2100XL-USB）掃描儀掃描采集圖像， 分辨率為 300 dpi。利用Progenesis SameSpots （Nonlinear Dynamics，British）軟件處理分析圖像。

1.2.5 差異蛋白的表達(dá)模式 用SameSpots軟件分析雜種高丹草與親本間蛋白豐度的表達(dá)差異。每個品種3個重復(fù)， 蛋白點(diǎn)豐度變化在1.5倍以上被認(rèn)為是差異蛋白點(diǎn)， 以t測驗(yàn)（P＜0.05）鑒定雜種與親本間的差異表達(dá)模式。根據(jù)郭寶健等［17］和Hoecker等［21］的研究將差異表達(dá)模式分為質(zhì)和量的模式。質(zhì)的差異表達(dá)模式為雜種特異表達(dá)和單親沉默。量的差異表達(dá)模式即 4種為超高親表達(dá)（ 在雜種和雙親都表達(dá)， 且雜種表達(dá)量高于高表達(dá)的親本）； 超低親表達(dá)（在雜種和雙親都表達(dá)， 且雜種表達(dá)量低于低表達(dá)的親本）； 偏高親表達(dá)（在雜種和雙親中都表達(dá)， 且雜種表達(dá)量與低親表達(dá)量差異顯著， 與高親表達(dá)量差異不顯著）； 偏低親表達(dá)（在雜種和雙親中都表達(dá)，且雜種表達(dá)量與高親表達(dá)量差異顯著， 與低親表達(dá)量差異不顯著）。

1.2.6 膠內(nèi)酶解 用槍頭尖端挖取差異蛋白凝膠置離心管， 用超純水清洗2次干燥的膠粒， 加入100 mmol L-1碘乙酰胺125 μL完成烷基化反應(yīng)， 避光室溫反應(yīng)1 h。加入Trypsin酶以1∶50酶/蛋白的比例37℃消化14 h。之后加入1 μL甲酸終止酶切反應(yīng)，真空干燥濃縮肽段， 每個樣品加入 0.1%的甲酸 60 μL重新溶解， 用于質(zhì)譜分析。

1.2.7 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定 使用Agilent Technologies 6520 Q-TOF LC/MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定， 得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Peaks 7.0 （Bioinformatics Solutions Inc.， Waterloo， Canada）軟件中進(jìn)行搜庫分析， 所用數(shù)據(jù)庫2014年11月下載于NCBI中， 物種為玉米（Zea mays）， 非冗余序列共66 024條， 搜庫參數(shù)設(shè)置如下， 未水解的酶切位點(diǎn)數(shù)（max missed cleavages）最多允許 1個不完全裂解位點(diǎn)； 固定修飾（fixed modifications）為脲甲基化［carboxymethyl （C）］；可變修飾（variable modifications）為氧化［oxidation （M）］； 肽片段質(zhì)量數(shù)最大容許誤差范圍（peptide mass tolerance）為±50 mg L-1； 二級質(zhì)譜最大誤差范圍（MS/MS tolerance）為±0.05 Da， 若鑒定肽段覆蓋率大于10%， 則認(rèn)為搜庫結(jié)果可信。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 通過搜索Uniprot （http∶//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫， 擬南芥數(shù)據(jù)庫獲得的結(jié)果，按其參與的生物學(xué)進(jìn)程對鑒定的差異蛋白分類。利用Cluster 3.0軟件對已鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)量的聚類分析。使用GeneMania （http∶//genemania.org/）對已鑒定的差異蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)互作預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀測量

產(chǎn)量是雜種優(yōu)勢的主要指標(biāo)， 而葉長、葉寬、株高、鮮重、干重又是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素， 因此，在三葉期（圖1）測量雜種高丹草及其親本的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀， 對各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析， 并計(jì)算中親優(yōu)勢。結(jié)果（圖2）表明雜種高丹草與親本間的差異均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）， 且葉長、葉寬、株高、鮮重、干重的中親優(yōu)勢分別為33.73%、41.82%、25.63%、31.19%和28.15%， 說明高丹草葉片具有明顯的雜種優(yōu)勢。

2.2 高丹草與親本的差異蛋白表達(dá)譜

圖1 高丹草與親本在三葉期的表型特征Fig.1 Phenotype of three-leaf stage sorghum-sudangrass hybrid and parents

雙向電泳圖譜中每張凝膠可以檢測到的蛋白點(diǎn)至少為400個。其中有34個蛋白點(diǎn)（圖3）在雜種與親本間差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， 雜種高丹草與親本間的差異蛋白表達(dá)模式中質(zhì)的差異為4個， 量的差異為30個。且特異表達(dá)為1個，單親沉默為3個， 偏高親所占比例最高17個， 超高親6個， 偏低親5個， 超低親2個（圖4）。

圖2 高丹草及其親本苗期雜種優(yōu)勢分析Fig.2 Heterosis at seeding stage of sorghum-sudangrass hybrid and its parents

圖3 高丹草與親本葉片差異蛋白表達(dá)譜Fig.3 Differential protein expression profile of leaves of sorghum-sudangrass hybrid and its parents

圖4 差異蛋白的表達(dá)模式.Fig.4 Pattern of differentially expressed protein between sorghum-sudangrass hybrid and its parents

2.3 差異蛋白的質(zhì)譜鑒定與功能分類

挖取凝膠上定量分析后的所有差異蛋白點(diǎn)并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定， 27個差異蛋白點(diǎn)被成功鑒定（表1）。為進(jìn)一步確定差異蛋白的功能， 按照生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行功能分類（圖5和表1）， 27個差異蛋白共涉及8個功能類別， 表達(dá)類別最多的蛋白為光合作用相關(guān)的蛋白（8個）， 其次是碳水化合物代謝相關(guān)蛋白（5個）， 脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白為3個， ATP合成蛋白3個， 蛋白質(zhì)合成2個， 電子轉(zhuǎn)移2個， 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)1個， 另外還有未知蛋白3個。

2.4 已鑒定的差異蛋白的表達(dá)量聚類分析

高丹草及其親本中的差異蛋白質(zhì)表達(dá)量的聚類分析（圖 6）表明， 差異蛋白主要為兩大類， 一類是在高丹草相對于親本表達(dá)量上調(diào)的蛋白質(zhì)， 主要涉及光合作用， 碳水化合物代謝， 脅迫響應(yīng)， ATP合成。另一類是高丹草中相對于親本表達(dá)量下調(diào)的蛋白質(zhì)，主要是電子轉(zhuǎn)移類蛋白。

2.5 差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

在一個活細(xì)胞里， 蛋白質(zhì)執(zhí)行其功能時并不是孤立的， 而是在一個網(wǎng)絡(luò)環(huán)境下協(xié)同作用的。因此，我們通過 GeneMANIA對鑒定的差異蛋白生成互作網(wǎng)絡(luò)圖， 以期在高丹草葉片雜種優(yōu)勢中找到關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)蛋白。結(jié)果顯示， 被識別的蛋白基于蛋白質(zhì)間的互作形成了2個功能群（圖7）， 分別涉及光合作用、電子轉(zhuǎn)移。表達(dá)最多的功能群是與光合作用相關(guān)的蛋白， 涉及7個蛋白， 電子轉(zhuǎn)移涉及2個蛋白。

圖5 差異蛋白的功能分類Fig.5 Functional categories of the differentially expressed proteins

表1 已鑒定的27個蛋白的相關(guān)信息Table 1 Relevant information of twenty-seven proteins identified

（續(xù)表1）

圖6 差異蛋白聚類分析Fig.6 Clustering analysis of differentially expressed proteins

圖7 差異蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（不同顏色代表不同種類）Fig.7 Interaction network of differentially expressed proteins （color codes represent different functional protein groups）

3 討論

雜種優(yōu)勢廣泛應(yīng)用在增加作物產(chǎn)量， 提高作物品質(zhì)等諸多方面， 高丹草表現(xiàn)突出的雜種優(yōu)勢， 如產(chǎn)草量高， 飼用品質(zhì)好， 在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用。為更好地理解高丹草雜種優(yōu)勢形成的分子機(jī)制， 我們建立了高丹草葉片三葉期的差異蛋白表達(dá)譜， 共檢測到差異蛋白34個， 包括單親沉默、偏高親、偏低親、特異表達(dá)、超高親、超低親等差異表達(dá)模式。其中差異蛋白表現(xiàn)為單親沉默， 偏高親， 偏低親可認(rèn)為是顯性效應(yīng)（25個）， 表現(xiàn)為特異表達(dá)， 超高親， 超低親被認(rèn)為是超顯性效應(yīng)（9個）， 由此， 我們推測顯性效應(yīng)與超顯性效應(yīng)共同作用， 促進(jìn)高丹草葉片雜種優(yōu)勢的形成［17］。功能分類和互作網(wǎng)絡(luò)分析表明增強(qiáng)的光合作用是雜種優(yōu)勢形成的主要因子。

3.1 光合作用相關(guān)蛋白

光合作用為植物的生長和發(fā)育提供能量和有機(jī)物， 是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)［22］。在本研究中， 8個差異顯著的蛋白與光合作用相關(guān)， 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基（Rubisco）是非常重要的酶， 在葉綠體中合成， 結(jié)合小亞基形成全酶。Rubisco是光合作用中催化光合碳循環(huán)和光呼吸的第一個酶， 且Rubisco含量豐富也是光合作用的限速酶。Rubisco在高丹草葉片的特異性表達(dá)說明雜種在光合作用中碳的固定與光呼吸的氧化能力上具有超強(qiáng)的優(yōu)勢，可能通過高效的光合作用同化更多的有機(jī)物來增加高丹草的產(chǎn)量。捕光葉綠素 a/b結(jié)合蛋白與色素形成色素蛋白復(fù)合體， 該復(fù)合體能捕獲光能并把能量迅速傳到反應(yīng)中心促進(jìn)光化學(xué)反應(yīng)［23］。其在光系統(tǒng)I和光系統(tǒng) II之間激發(fā)能量的分配和光保護(hù)等過程中具有非常重要的調(diào)節(jié)作用［24］。捕光葉綠素 a/b結(jié)合蛋白5和葉綠素a/b結(jié)合蛋白6A均是偏高親表達(dá)，推測雜種相對于親本具有更高的光捕獲轉(zhuǎn)化能力，更好的能量分配與光保護(hù)能力。氧不斷變化的增強(qiáng)蛋白2 （點(diǎn)1）對維持光系統(tǒng)II的穩(wěn)定性以及確保植物正常光合作用起著關(guān)鍵性作用。本研究的結(jié)果顯示，蛋白點(diǎn) 1的超高親表達(dá)說明高丹草可能有更高效的光合作用。PsbP蛋白是光系統(tǒng)II的外在組分， 它連同PsbO和PsbQ兩個亞基構(gòu)成放氧復(fù)合物的腔內(nèi)組分［25］， 本研究中 PsbP蛋白的同源蛋白 PsbP-like protein 2 （點(diǎn)8）為偏高親表達(dá)， 另外還有2個光合蛋白（點(diǎn)5和點(diǎn)6）也是偏高親表達(dá)模式。這些蛋白都明顯地證明高丹草比其親本具更強(qiáng)的光合作用， 這在很大程度上解釋了其高產(chǎn)的原因。

3.2 碳水化合物代謝相關(guān)蛋白

碳水化合物是大多數(shù)有機(jī)體內(nèi)最豐富的有機(jī)產(chǎn)物， 同時也是化學(xué)能的主要來源［26］。本研究中的碳水化合物代謝相關(guān)蛋白主要涉及糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑。三磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶， 這 3種酶表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)表達(dá)， 說明雜種高丹草增強(qiáng)的糖酵解途徑可以產(chǎn)生更多的能量以滿足其生長發(fā)育的高能量需求。三羧酸循環(huán)是主要的能量代謝通路，負(fù)責(zé)呼吸底物的氧化以合成ATP［27］。蘋果酸脫氫酶（MDH）是生物糖代謝的關(guān)鍵酶之一， 催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換， 在本研究中檢測到MDH（點(diǎn) 19）偏高親表達(dá)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（點(diǎn) 17）催化天冬氨酸產(chǎn)生草酰乙酸， 從而會影響高丹草的能量代謝系統(tǒng)， 蛋白點(diǎn)17的超高親表達(dá)會催化產(chǎn)生更多的草酰乙酸， 為三羧酸循環(huán)高效進(jìn)行提供更多的中間介質(zhì)， 這將有助于促進(jìn)高丹草雜種優(yōu)勢的形成。

3.3 脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白

環(huán)境脅迫是全球作物生產(chǎn)的主要限制條件， 每年導(dǎo)致主要農(nóng)作物的平均產(chǎn)量損失達(dá)50%以上［28］，所以脅迫響應(yīng)蛋白在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演著重要的角色。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是典型的脅迫響應(yīng)蛋白， 大量研究表明， GST在植物體內(nèi)的表達(dá)能夠有效增強(qiáng)植物對干旱、低溫、高鹽、重金屬等多種非生物脅迫的抵抗能力［29-32］。在本研究中 GST 1偏高親表達(dá)， 可以推測雜種對環(huán)境脅迫的抵抗能力高于親本， 為機(jī)體正常代謝活動提供了更穩(wěn)定的系統(tǒng)。L-抗壞血酸過氧化氫酶（點(diǎn)26）和乙二醛酶1 （點(diǎn)15）是另外2個參與脅迫響應(yīng)的蛋白， 抗壞血酸過氧化氫酶主要是參與清除植物體內(nèi)的過氧化氫， 對維持生物體正常的生理功能尤為重要［33］。蛋白點(diǎn)26為單親沉默表達(dá)， 可以將其歸為顯性表達(dá)， 點(diǎn)26在高丹草中的顯性表達(dá)大大減少了活性氧的積累對植物體造成的傷害。乙二醛酶有效去除體內(nèi) α-羰基醛毒性，對生物體有極大的保護(hù)作用， 而蛋白點(diǎn)15的表達(dá)是偏低親表達(dá)模式， 還需對其進(jìn)行更深入的研究。

3.4 ATP合成相關(guān)蛋白

ATP合酶是生物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶， 并參與氧化磷酸化與光合磷酸化反應(yīng)， ATP是機(jī)體生命活動的主要能量來源， ATP合酶利用質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)形成的跨膜質(zhì)子動力勢催化光合磷酸化的末端反應(yīng)， 將ADP和無機(jī)磷Pi合成ATP［34-35］。在本研究中檢測到3個ATP合酶， 葉綠體ATP合酶CF1亞基有α和β兩種形式， 均為偏高親表達(dá)模式， ATP合酶gamma亞基為超高親表達(dá)模式。ATP合酶在雜種高丹草葉片的高親或者超高親的表達(dá)模式， 也許可以表明隨著質(zhì)子流入葉綠體， 雜種有更高的光合速率， 創(chuàng)造更多的ATP產(chǎn)物， 因此能更好地滿足葉片生長發(fā)育對能量的需求［36］。

3.5 其他種類的蛋白

除上述功能類蛋白外還有一些重要的差異表達(dá)蛋白分別涉及蛋白質(zhì)合成、電子轉(zhuǎn)移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。核糖體蛋白在細(xì)胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮著重要作用， 研究表明核糖體蛋白與細(xì)胞的分化和發(fā)育有關(guān)［37］， 30S核糖體蛋白在高丹草的偏高親表達(dá)說明其增強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成促進(jìn)雜種優(yōu)勢的形成。與電子轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白點(diǎn)24、25均參與鐵硫蛋白代謝的電子轉(zhuǎn)移， 且在子代為偏低親表達(dá)模式。蛋白點(diǎn)23是唯一一個與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異蛋白， 它的偏高親表達(dá)模式可能說明雜種子代的信號傳導(dǎo)比較靈敏， 更容易完成生命活動中信號網(wǎng)絡(luò)的傳遞。

4 結(jié)論

成功建立了高丹草及其親本的差異蛋白表達(dá)譜，檢測到差異蛋白34個， 包括顯性（單親沉默、偏高親、偏低親）和超顯性（特異表達(dá)、超高親、超低親）表達(dá)模式。顯性和超顯性效應(yīng)共同形成雜種優(yōu)勢， 而顯性效應(yīng)的貢獻(xiàn)更大。在成功鑒定的27個差異蛋白中，共涉及8個功能類別， 其中光合蛋白最多。其中葉綠體氧不斷變化的增強(qiáng)蛋白2為超高親表達(dá)， 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基呈雜種特異表達(dá)， 其他光合蛋白也多數(shù)為偏高親表達(dá)模式。雜種光合作用的增強(qiáng)表明其子代同化有機(jī)物能力增強(qiáng)， 能有效維持植物的生長發(fā)育， 這可能是產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的最主要原因。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00696

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 逯曉萍， E-mail∶ lxpnmnd@126.com

收稿日期Received（）∶ 2015-09-07； Accepted（接受日期）∶ 2016-01-11； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-02-18.

Analysis of Heterosis in Sorghum-Sudangrass Hybrid Seedlings Based on Proteomics

HAN Ping-An1， LU Xiao-Ping1，*， MI Fu-Gui2， ZHANG Rui-Xia3， LI Mei-Na3， XUE Chun-Lei1， DONG Jing1，and CONG Meng-Lu1

1College of Agronomy， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， China；2College of Ecology and Environmental Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， China；3Hohhot Seed Management Station， Hohhot 010020， China

Abstract：Sorghum-sudangrass hybrids are typically used for studying heterosis in forage crops.In this study， we carried out proteomic research on sorghum-sudangrass hybrids and their parents at the three-leaf stage by two dimensional electrophoresis-based proteomics and bioinformatic methods.More than 400 protein spots were detected， in which 34 proteins showed significant differences between hybrid and parents in expression， including dominant expression （showing three single-parent silent， seventeen high-parent and five low-parent expression） and overdominant expression （showing one hybrid-specific， six above-high-parent，two below-low-parent expression）.Thus， we speculated that dominant and overdominant effects play key roles， and dominant effect is a major factor in the formation of heterosis in sorghum-sudangrass hybrid.Moreover， 27 out of 34 proteins were related to eight functional categories， i.e.， photosynthesis， carbohydrate metabolism， stress response， ATP synthesis， protein synthesis，electron transfer， signal transduction and unknown.The up-regulated photosynthetic proteins were the biggest category， which indicates that photosynthesis in the leaves of sorghum-sudangrass hybrid is enhanced resultig in producing more organic matter，so that showing heterosis.The identified key node proteins in the interaction networks were the potential target proteins for future genetic manipulation of the specific proteins of heterosis.Our findings provide a theoretical basis on heterosis analysis of sorghum-sudangrass hybrids， which is potentially useful for other forage plants.

Keywords：Sorghum-sudangrass hybrid； Leaves； Heterosis； Proteomics