PRM2 G398C多態(tài)性與386例漢族男性生育力的相關(guān)性研究*

李　俊，劉　芳，楊雪梅，宋亞曼，馮艷萍，譚宇哲

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科　050031)

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PRM2 G398C多態(tài)性與386例漢族男性生育力的相關(guān)性研究*

李俊，劉芳，楊雪梅△，宋亞曼，馮艷萍，譚宇哲

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科050031)

[摘要]目的研究魚精蛋白2(PRM2)基因 G398C多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性。方法選取386例原發(fā)不育男性患者為觀察組，255例生育男性為對照組，分別分析兩組常規(guī)精液參數(shù)及DNA 完整性、核蛋白成熟度等精子功能參數(shù)，采用DNA測序技術(shù)對PRM2 G398C位點進行基因分型，統(tǒng)計該多態(tài)性位點與男性不育發(fā)病率的關(guān)系。結(jié)果不育患者 PRM2 G398C位點CC基因型頻率(11.92%)高于生育男性(6.67%)，分析顯示CC基因型與男性不育的遺傳易感性明顯相關(guān)(OR=2.002，95%CI=1.097～3.653，P<0.05)。CC基因型可使精子DNA完整性、核蛋白成熟度等精子功能參數(shù)明顯下降，可能是其導(dǎo)致男性不育的主要因素。結(jié)論PRM2 G398C多態(tài)性改變與漢族男性生育力相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]魚精蛋白2；多態(tài)性，單核苷酸；不育，男(雄)性；遺傳易感性

國外不孕不育患者約占已婚夫婦的10%～15%，其中，由男性因素導(dǎo)致的不育比例達50%[1]。魚精蛋白1(promatine1,PRM1)及魚精蛋白2(promatine2,PRM2)是人類兩種主要的魚精蛋白，分別由位于16p13.3的PRM1、PRM2基因編碼。魚精蛋白在精子DNA凝聚及包裝中發(fā)揮重要作用，是主要的DNA結(jié)合蛋白[2]。小鼠敲除PRM1或PRM2基因可導(dǎo)致單倍劑量不足、染色質(zhì)凝聚異常、精子損傷及雄性不育[3]。報道指出魚精蛋白基因編碼區(qū)、非編碼區(qū)的微小改變可導(dǎo)致其表達的完全異常[4]，進而影響男性生育力。G398C SNP位點位于PRM2基因的內(nèi)含子區(qū)，目前尚未見其多態(tài)性改變與漢族男性生育力的相關(guān)性研究，本研究旨在分析PRM2 G398C多態(tài)性改變對漢族男性生育力的影響。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年8月至2014年8月，于本院生殖醫(yī)學(xué)科就診患者為研究對象。不育組為排除女方因素，未避孕大于或等于1年未育的男性患者，除外染色體異常及Y染色體微缺失患者。生育組(對照組)男性為未借助輔助生殖技術(shù)的已育查體患者255例。觀察組包括386例不育患者。觀察組與對照組精子濃度、活力、前向運動比例、精子形態(tài)等常規(guī)精液參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1　不育與生育組男性常規(guī)精液參數(shù)比較±s)

1.2方法

1.2.1精液分析患者禁欲2～7 d手淫法無菌采集精液，按WHO標(biāo)準(zhǔn)[5]分析精液常規(guī)參數(shù)及精子形態(tài)，精子濃度、活力及前向運動精子比例采用計算機輔助分析方法。留取部分精液用于精子DNA完整性及核蛋白成熟度分析。精子核DNA完整性由染色質(zhì)擴散實驗試劑盒檢測(深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)，苯胺藍染色法用于分析精子核蛋白成熟度(深圳博銳德生物科技有限公司)。

1.2.2PRM2基因型分析應(yīng)用DNA提取試劑盒由精液標(biāo)本分離DNA(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，上游引物序列：5′-CCC ATG GCC AGT CTC ACT AT-3′，下游引物序列：5′-CCA GGT TTG TGT GAT TCG TG-3′，建立25.0 μL PCR反應(yīng)體系，包括2.0 μL模板DNA，12.5 μL 高保真2×GoldStar Taq Master Mix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，上、下游引物各1.0 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物為641 bp，將擴增得到的PCR產(chǎn)物純化(天根生化科技凝膠純化試劑盒)后雙向測序(上海英濰捷基公司)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，χ2檢驗用來檢測SNP位點在檢測人群中的分布是否符合哈迪-溫伯格定律并檢測基因型在觀察組及對照組中的分布頻率、關(guān)聯(lián)比值比(OR)及95%CI，t檢驗用于比較觀察組及對照組常規(guī)精液參數(shù)的差異，不同基因型間精子功能參數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PRM2 G398C多態(tài)性與漢族男性生育力的相關(guān)性分析觀察組及對照組男性中均可檢測到3種基因型(圖1)，且均符合哈迪-溫伯格平衡定律。CC基因型在觀察男性中的分布頻率為11.92%(表2)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；數(shù)據(jù)分析表明，CC基因型可增加男性不育癥的發(fā)病風(fēng)險(OR=2.002，95%CI:1.097～3.653，P<0.05)。

A:GG純合型；B:GC雜合型；C:CC純合型。

圖1　PRM2 G398C基因型

*：野生型。

2.2G398C基因型對精子功能參數(shù)的影響精子DNA完整性及核蛋白成熟度的檢測，3種基因型精子DNA完整性及核蛋白成熟度的比較，CC基因型精子DNA完整性及核蛋白成熟度比例均顯著低于GG及GC基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3　PRM2 G398C基因型與精子功能參數(shù)的

3討論

盡管男性不育診斷取得很大進步，仍不清楚30%原發(fā)不育患者的病因及發(fā)病機制。研究指出遺傳學(xué)異常是男性不育的主要因素[6]。近年來多項研究探討了魚精蛋白基因多態(tài)性改變與男性不育的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同SNP位點在不同種族人群中與不育的相關(guān)性不同。本文首次報道了PRM2 G398C多態(tài)性位點與漢族男性生育力的相關(guān)性，結(jié)果顯示出CC基因型與男性不育患病率相關(guān)，與國外報道[7]不一致，可能是入選對象標(biāo)準(zhǔn)及人群遺傳背景差異造成的。相關(guān)報道也顯示，不同研究人群中PRM基因多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性結(jié)果存在很大差異[8-10]，遺傳背景差異可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的最為重要的原因。由于單一多態(tài)性的低顯性遺傳效應(yīng)通常取決于與其他多態(tài)性位點的相互作用及包括飲食、生活方式等在內(nèi)的特定環(huán)境因素的綜合影響，因此遺傳變異的影響可能被其他尚未發(fā)現(xiàn)的致病因素所掩蓋[1]。

精子發(fā)生過程中，核組蛋白由過渡蛋白取代，而后過渡蛋白又被魚精蛋白取代，魚精蛋白通過分子內(nèi)及分子間的二硫鍵與小溝DNA緊密結(jié)合，使DNA包裹程度增加，染色質(zhì)凝聚水平可達體細胞的6倍。人類精子表達兩種類型的魚精蛋白，即P1和P2，二者比例近似1∶1，其比例升高或降低均與男性不育相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)PRM1及PRM2基因及其相關(guān)調(diào)控區(qū)域的突變可影響魚精蛋白表達，魚精蛋白水平異常可導(dǎo)致染色質(zhì)的不完全凝聚及父源DNA損傷[11]。由于核蛋白成熟度檢測可評估精子染色質(zhì)致密化，檢測與核蛋白相關(guān)的染色質(zhì)缺陷[12]，本實驗通過對核蛋白成熟度及精子DNA完整性的檢測評估G398C多態(tài)性改變對精子染色質(zhì)凝聚的影響。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CC基因型中精子DNA完整性及核蛋白成熟度比例明顯降低，與報道指出的魚精蛋白基因突變可導(dǎo)致精子發(fā)生及印跡基因異常，造成染色質(zhì)損傷及DNA斷裂的結(jié)論一致[2]。推測PRM2 G398C單核苷酸的改變可能導(dǎo)致精子細胞核中魚精蛋白含量的異常，比例過高的組蛋白可阻礙魚精蛋白與精子DNA的正常結(jié)合，影響DNA鏈折疊，降低精子DNA穩(wěn)定性[13]，而精子核DNA完整性及核蛋白成熟度等精子功能指標(biāo)是評估男性生育力的重要參數(shù)[14-15]，推測G398C多態(tài)性可通過改變魚精蛋白表達，引起核蛋白成熟度及DNA完整性下降，造成生育力降低。

綜上所述，PRM2 G398C多態(tài)性改變與漢族男性生育力相關(guān)。CC基因型可使精子DNA完整性及核蛋白成熟度顯著降低，可能是導(dǎo)致男性不育的重要原因。

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Association study of PRM2 gene polymorphism with male infertility in the 386 Chinese Han population*

Li Jun,Liu Fang,Yang Xuemei△,Song Yaman,Feng Yanping,Tan Yuzhe

(DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050031,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the association of one single nucleotide polymorphism loci G398C in PRM2 with male infertility in Chinese Han population.MethodsA total of 386 infertile men were recruited as the observation group and 255 fertile men were recruited as the control group.Routine semen analysis as well as sperm functional parameters such as DNA integrity and nucleoprotein maturity rates were analyzed.Direct sequencing of G398C in PRM2 gene of infertile and fertile men was also conducted to evaluate the association of G398C SNP loci with male infertility.ResultsStatistical analysis showed that the frequencies of CC genotype of PRM2 G398C was significantly different between the infertile (11.92%) and fertile men (6.67%) and it was associated with increased risk of male infertility (OR=2.002,95%CI=1.097-3.653,P<0.05).Moreover,it was discovered that sperm DNA integrity as well as nucleoprotein maturity rate of CC genotype were dramatically decreased compared with other genotypes (P<0.05),which would probably lead to infertility.ConclusionOur results gave the first evidence that PRM2 G398C polymorphism was associated with male infertility in Chinese Han population.

[Key words]protamine 2;polymorphism,single nucleotide;infertility,male;genetic susceptibility

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.017

*基金項目：河北省人口和計劃生育委員會指令課題(2013-A08)。

作者簡介：李俊(1982-)，助理研究員，博士，主要從事人類輔助生殖實驗室工作?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:(0311)85917146;E-mail:meicherrymissyou@163.com。

[中圖分類號]R698+2

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2215-02

(收稿日期：2015-12-23修回日期：2016-02-25)