南海鳶烏賊肌原纖維蛋白加熱過程中理化性質(zhì)的變化

馬海霞，馬靜蓉、2，楊賢慶，李來好

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

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南海鳶烏賊肌原纖維蛋白加熱過程中理化性質(zhì)的變化

馬海霞1，馬靜蓉1、2，楊賢慶1，李來好1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東廣州510300；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

摘要：為研究南海鳶烏賊Symplectoteuthis oualaniensis肌原纖維蛋白在加熱過程中理化性質(zhì)的變化，以南海鳶烏賊胴體肌肉為原料，對其肌原纖維蛋白在加熱過程中濁度、溶解度、Ca2+-ATPase活性和總巰基（-SH）含量進(jìn)行了測定，并對該蛋白質(zhì)在整個(gè)加熱過程中SDS-PAGE電泳圖的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在25～35℃時(shí)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的濁度、溶解度、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量的變化均比較緩慢；在35℃后繼續(xù)升溫，濁度、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量均發(fā)生明顯變化；總巰基含量在40～50℃時(shí)出現(xiàn)短暫升高現(xiàn)象后又急劇降低，溶解度在50℃時(shí)開始明顯降低；在25～35℃時(shí)，隨著溫度的逐漸升高，鳶烏賊肌原纖維蛋白的肌球蛋白重鏈 （MHC）略有減少，副肌球蛋白 （PM）和肌動(dòng)球蛋白 （Actin）基本上未發(fā)生變化，但在35℃后，鳶烏賊肌原纖維蛋白開始產(chǎn)生大分子物質(zhì)，逐漸發(fā)生變性。

關(guān)鍵詞：鳶烏賊；肌原纖維蛋白；熱處理；理化性質(zhì)

鳶烏賊Symplectoteuthis oualaniensis隸屬于鞘亞綱、槍形目、柔魚科，其生命周期短、生長率高、繁殖力強(qiáng)，可承受較大的捕撈壓力，廣泛分布于印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域，其中分布在中國南海和印度洋西北部海域的數(shù)量較多，是一種極具開發(fā)潛力的頭足類資源［1］。隨著傳統(tǒng)漁業(yè)資源的衰退以及中國遠(yuǎn)洋漁業(yè)的快速發(fā)展，人們?nèi)找骊P(guān)注頭足類資源的開發(fā)利用，對南海豐富的鳶烏賊資源的加工利用已成為水產(chǎn)品加工的研究熱點(diǎn)。

南海鳶烏賊具有高蛋白質(zhì)、低脂肪、肉美味鮮的特點(diǎn)，含有豐富的氨基酸、DHA、EPA、鋅、鐵等元素，具備一定的保健功效［2］。鳶烏賊的可食部分高達(dá)80％以上，較已開發(fā)的其他頭足類動(dòng)物都高［3］。然而鳶烏賊肉質(zhì)較硬，不符合大眾口味，故一直未打開生鮮市場［1］，參考其他頭足類的加工利用方法［4-5］，用鳶烏賊胴體肌肉來制備冷凍魚糜及相關(guān)的魚糜制品，不失為其高值化利用的一條可行性途徑，同時(shí)也能確保鳶烏賊漁業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展。魚糜的主要成分是肌原纖維蛋白，通常用熱加工的方式來生產(chǎn)魚糜制品。在魚糜凝膠化過程中，通過添加鹽使肌原纖維蛋白 （主要是肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白）溶解形成肌動(dòng)球蛋白，加熱預(yù)先獲得的魚糜，當(dāng)存在足夠的分子間鍵時(shí)便形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且通過離子交換聯(lián)系、疏水相互作用、共價(jià)鍵 （二硫鍵和共價(jià)交聯(lián)）、氫鍵來穩(wěn)定［5］。肌原纖維蛋白在加熱過程中的聚集和變性，是其熱凝膠特性研究的基礎(chǔ)［6］。目前，對頭足類肌肉蛋白質(zhì)的研究多集中在熱穩(wěn)定性［7-8］和蛋白質(zhì)降解［9-11］等方面，頭足類動(dòng)物肌肉中存在大量蛋白酶，這些酶主要是金屬蛋白酶［11］，在40℃附近活性較強(qiáng)，它會降解肌球蛋白重鏈 （MHC），并將其分解成重酶解肌球蛋白 （HMM）和輕酶解肌球蛋白 （LMM）。楊芳［12］、陸海霞［13］分別對阿根廷魷魚和秘魯魷魚肌原纖維蛋白的熱理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，但關(guān)于鳶烏賊肌原纖維蛋白熱理化性質(zhì)的研究目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中，對鳶烏賊肌原纖維蛋白的熱理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在為設(shè)計(jì)合理的熱凝膠加工工藝及鳶烏賊魚糜加工提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為南海水產(chǎn)研究所 “南鋒號”科考船捕撈于南海海域的鳶烏賊 （胴體長約15 cm，-20℃下凍藏1個(gè)月）。

試驗(yàn)用主要試劑：Tris（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、氯化鉀 （廣州化學(xué)試劑廠）、Triton X-100（廣州市博理生物科技有限公司）均為分析純；巰基測試盒、超微量ATP酶測試盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，考馬斯亮藍(lán)R250購自南京建成科技有限公司。

試驗(yàn)用主要儀器與設(shè)備：UltraTurrax T50均質(zhì)機(jī) （德國IKA公司）、Sigma-3K30高速冷凍離心機(jī) （德國 SIGMA公司）、PB-10型精密 pH計(jì)（Sartorius公司）、UV2550紫外可見分光光度計(jì)（日本SHIMADZU公司）、Powerpac@HV等電聚焦電泳儀 （美國Bio-rad公司）、Tanon1600凝膠成像系統(tǒng) （上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提?。?4］取10 g鳶烏賊碎肉加入6倍的A液 （pH 7.5，0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液）和2倍的 B液 （pH 7.5，1％Triton，0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液），用勻漿機(jī)勻漿 （9600 r/min、30 s、5次），用紗布過濾，除去結(jié)締組織。再用冷凍離心機(jī)在4℃下以8000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀用8倍的A液混合后均勻離心，重復(fù)3次。得到的沉淀即為鳶烏賊肌原纖維蛋白，用A液清洗沉淀并稀釋至150 m L，分裝于10 mL的塑料離心管中，于超低溫冰箱（-70℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白濃度的測定 采用雙縮脲法［14］測定，以牛血清蛋白 （BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.3 濁度和溶解度的測定［15］

（1）濁度。用冰冷的20 mmol/L Tris-HCI緩沖液 （pH 7.5，0.1 mol/L KCl）將肌原纖維蛋白溶液濃度調(diào)整至2 mg/m L，取不同加熱溫度 （25～75℃）樣液各3 mL，在350 nm下測定其吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

（2）溶解度。將測定濁度后的蛋白溶液再用冷凍離心機(jī)在4℃下以13 500 r/min離心15 min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白的質(zhì)量濃度，即為溶解度。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)算公式為

某溫度下濁度變化率=（后一溫度下的濁度值-該溫度下的濁度值）/相鄰點(diǎn)溫度差值，

某溫度下溶解度變化率=（前一溫度下的蛋白濃度-該溫度下的蛋白濃度）/相鄰點(diǎn)溫度差值。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性的測定 用冰冷的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH 7.5，0.1 mol/L KCl）將肌原纖維蛋白溶液濃度調(diào)整至4 mg/mL，取不同加熱溫度 （20～55℃）樣液各5 mL，參考吳燕燕等［16］的方法，采用超微量 ATP酶檢測試劑盒進(jìn)行測定。測定原理：ATP酶可分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量可判斷ATP酶活力的高低。吸取100μL的樣品溶液，同Ca2+-ATPase測試盒中的各試劑混合，于37℃下水浴10 min，然后將反應(yīng)混合物以3500 r/min離心10min，取上清液150μL進(jìn)行定磷反應(yīng)，與測試盒中相應(yīng)試劑混勻，室溫下靜置5 min，在636 nm處測定其吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)算公式為

某溫度下Ca2+-ATPase活性變化率=（前一溫度下的Ca2+-ATPase活性值-該溫度下的Ca2+-ATPase活性值）/相鄰點(diǎn)溫度差值。

1.2.5 總巰基含量的測定 用冰冷的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH 7.5，0.1 mol/L KCl）將肌原纖維蛋白溶液濃度調(diào)整至4 mg/m L，取不同加熱溫度樣液各5 mL，采用巰基測試盒測定其總巰基含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)算公式為

-SH（mol/g）=A×D/（C×B）。

其中：-SH為總巰基含量 （mol/g）；A為412 nm處的吸光度差值；D為稀釋倍數(shù)；B為待測蛋白溶液的濃度 （mg/m L）；C為分子吸光系數(shù)，C= 13 600 mol/（cm·L）。

某溫度下總巰基含量變化率=（前一溫度下的總巰基含量-該溫度下總巰基含量）/相鄰點(diǎn)溫度差值。1.2.6 電泳 取一定量熱處理過程中不同溫度下的樣品與凝膠上樣緩沖液，以體積比為1∶1的比例混合，煮沸10 min，置于冰箱 （4℃）中保存?zhèn)溆?。電泳采?％濃縮膠，10％分離膠，初始電壓為80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓增大至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對鳶烏賊肌原纖維蛋白濁度的影響

濁度可以反映蛋白的聚集變性程度，溶液中蛋白聚集形成的顆粒體積越大，數(shù)目就越多，相應(yīng)的濁度也就越大［17］。肌原纖維蛋白的聚集程度會影響其所形成凝膠的結(jié)構(gòu)及其凝膠產(chǎn)品的品質(zhì)［18］。從圖1可見：隨著溫度的升高，鳶烏賊肌原纖維蛋白的濁度逐漸增大，溫度為25～35℃時(shí)，濁度緩慢上升，說明在此溫度范圍內(nèi)，蛋白還未發(fā)生明顯的變性；溫度為35～40℃時(shí)，濁度明顯增加，變化率的最大峰值為35℃，表明在此溫度區(qū)間蛋白發(fā)生了嚴(yán)重的變性聚集；40℃之后，濁度繼續(xù)增加，但速度較為緩慢，說明蛋白聚集物在生成過程中濁度的變性比其在變得致密過程中的變化更加顯著；溫度到達(dá)65℃時(shí)，肌原纖維蛋白析出聚集達(dá)到最大程度，濁度達(dá)到最大值，此后再升高溫度，肌原纖維蛋白析出大量的蛋白絮狀物，已經(jīng)不能較為準(zhǔn)確地測定其吸光度，濁度開始出現(xiàn)下降的趨勢。

圖1　鳶烏賊肌原纖維蛋白濁度在加熱過程中的變化Fig.1 　Changes in turbidity of m yofibrillar protein from purp leback flying squid during heating

2.2 溫度對鳶烏賊肌原纖維蛋白溶解度的影響

蛋白的溶解度變化會影響其起泡性、保水性和熱誘導(dǎo)凝膠的性質(zhì)［19］，可作為肉制品熟制程度的判斷標(biāo)志［18］。從圖2可見：隨著溫度的增加，肌原纖維蛋白的溶解度呈逐漸下降的趨勢，溫度為25～40℃時(shí)，溶解度下降較為緩慢；溫度為40～65℃時(shí)，出現(xiàn)明顯的下降，變化率在55℃時(shí)出現(xiàn)最大峰值，也說明在此溫度范圍內(nèi)溶解度變化明顯，即蛋白變性聚集明顯；65℃之后，隨著溫度的繼續(xù)升高，溶解度基本保持不變，這也進(jìn)一步證明當(dāng)溫度達(dá)到65℃時(shí)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的濁度達(dá)到最大值，變性聚集達(dá)到了最大程度。

圖2　鳶烏賊肌原纖維蛋白溶解度在加熱過程中的變化Fig.2 Changes in solubility of myofibrillar protein from purp leback flying squid during heating

2.3 溫度對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性是評價(jià)蛋白變性的重要指標(biāo)。從圖3可見，肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性在20～35℃時(shí)下降緩慢，35℃之后活性急劇下降，40℃時(shí)活性完全喪失變?yōu)?，而Ca2+-ATPase活性變化率在40℃時(shí)達(dá)到最大值，說明在35～40℃時(shí)，酶活變化最為劇烈。Ca2+-ATPase的活性來自于肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)，其數(shù)值大小反映蛋白的聚集和變性程度［20］，在35～40℃內(nèi)，肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的改變，使得蛋白聚集變性，Ca2+-ATPase活性急劇下降。潘錦峰等［21］在研究草魚肌原纖維蛋白加熱過程中Ca2+-ATPase活性變化時(shí)指出，Ca2+-ATPase活性迅速下降可能是由于疏水氨基酸和巰基的相互作用導(dǎo)致的。與此同時(shí)，鳶烏賊體內(nèi)存在大量自溶酶［8］，自溶酶在此溫度范圍時(shí)活性增強(qiáng)，催化了蛋白的降解反應(yīng)，可能會破壞蛋白的穩(wěn)定性。

圖3　鳶烏賊肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性在加熱過程中的變化Fig.3 Changes in Ca2+-ATPase activity ofm yofibrillar protein from purp leback flying squid during heating

2.4 溫度對鳶烏賊肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

總巰基含量的變化是用來衡量蛋白變性的重要參數(shù)指標(biāo)之一，它包含了活性巰基和隱藏的巰基。從圖4可見：鳶烏賊肌原纖維蛋白隨著加熱溫度的升高，總巰基含量整體呈下降趨勢；溫度為25～35℃時(shí)，總巰基含量變化緩慢；溫度為35～40℃時(shí)巰基含量急劇下降，這是由于溫度升高導(dǎo)致巰基集團(tuán)活性區(qū)域暴露，使得巰基氧化，含量減少，蛋白變性聚集，進(jìn)而引起濁度、溶解度和酶活的變化；溫度為40～50℃時(shí)，總巰基含量又出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，可以看到，變化率在40℃時(shí)存在一個(gè)峰值，姚磊等［22］對鯽肌原纖維蛋白在加熱過程中理化性質(zhì)變化的研究中指出，加熱過程中由于肌原纖維蛋白構(gòu)象的改變也會引起總巰基含量的增加，田悅等［23］也指出，蛋白在形成凝膠前，蛋白中的二硫鍵經(jīng)還原反應(yīng)形成巰基，使得蛋白構(gòu)象變松散，形成松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于凝膠的形成；溫度為50℃之后，總巰基含量又顯著下降，這是由于高溫作用使得鳶烏賊肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生較大改變，巰基被快速氧化成二硫鍵，各種作用力加強(qiáng)，蛋白聚集變性［20］，變化率在55℃時(shí)也出現(xiàn)了一個(gè)較大峰值。

圖4　鳶烏賊肌原纖維蛋白總巰基含量在加熱過程中的變化Fig.4 Changes in total levels of SH groups of m yofibrillar protein from purp leback flying squid during heating

2.5 鳶烏賊肌原纖維蛋白熱處理過程中 SDSPAGE的變化

鳶烏賊屬于頭足類動(dòng)物，其肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白重鏈 （MHC）、肌動(dòng)蛋白 （Actin）、軟體動(dòng)物所特有的副肌球蛋白 （PM）和相對分子量更小的原肌球蛋白等［24］。圖5為鳶烏賊肌原纖維蛋白連續(xù)加熱過程的SDS-PAGE電泳圖，由于樣品處理及貯藏過程中，肌原纖維蛋白發(fā)生了一定程度的降解，導(dǎo)致MHC含量較低?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度到達(dá)50℃及以上時(shí)，鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC略有減少，而隨著溫度的升高，PM和Actin未發(fā)生明顯變化。姚磊等［22］在研究鯽肌原纖維蛋白升溫過程中SDS-PAGE的變化中發(fā)現(xiàn)，Actin在加熱過程中未發(fā)生明顯變化，然而MHC卻隨著溫度的升高而減少，肌原纖維蛋白在加熱過程中產(chǎn)生了蛋白重鏈聚合物以及其他大分子物質(zhì)。然而，這種MHC逐漸減少的現(xiàn)象在鳶烏賊肌原纖維蛋白上表現(xiàn)得并不顯著，這可能與鳶烏賊肌原纖維蛋白中所含MHC量較低以及物種肌肉蛋白之間的差異有關(guān)。

注：M為蛋白質(zhì)Ladder；20～70分別為在20、30、40、50、60、70℃條件下的誘導(dǎo)表達(dá)Note：M，proteinmolecular weight Ladder；20-70，expression in recombinant bacteria induced at 20，30，40，50，60，and 70℃separately圖5　鳶烏賊肌原纖維蛋白在加熱過程中的變化Fig.5 Changes in m yofib rillar protein from pu rp leback flying squid during heating

3 結(jié)語

隨著加熱溫度的逐漸升高，鳶烏賊肌原纖維蛋白分子發(fā)生構(gòu)象變化，濁度增大，溶解度、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量降低。鳶烏賊肌原纖維蛋白在35℃時(shí)，開始產(chǎn)生大分子物質(zhì)并逐漸發(fā)生變性，濁度、Ca2+-ATPase活性、總巰基含量在35℃時(shí)均發(fā)生顯著變化，在40～50℃時(shí)由于蛋白構(gòu)象的改變，總巰基含量出現(xiàn)短暫的升高現(xiàn)象，溶解度在50℃時(shí)出現(xiàn)明顯降低。因此，漁獲的鳶烏賊原料，應(yīng)嚴(yán)格控制其貯藏溫度，避免溫度達(dá)到35℃或以上時(shí)引起其肌肉蛋白的聚集變性，從而降低原料的品質(zhì)；在進(jìn)行魚糜制品加工時(shí)，為較快獲得魚糜凝膠，熱凝膠溫度應(yīng)選擇在35℃及以上。隨著溫度的逐漸升高，鳶烏賊肌原纖維蛋白的MHC略有減少，但PM和Actin基本上未發(fā)生明顯變化。

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Physiochem ical changes in m yofibrillar protein from purp leback flying squid Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea during heat-treatment

MA Hai-xia1，MA Jing-rong1，2，YANG Xian-qing1，LILai-hao1
（1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，National R&D Center for Aquatic Product Processing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Abstract：The changes in physiochemical properties and SDS-PAGE ofmyofibrillar protein from purpleback flying squid Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea during heat-treatment were studied via turbidity，solubility，Ca2+-ATPase activity and total sulfhydryl content.The results showed that the changes in all the above indicators was inconspicuous at heating temperature of 25-35℃.There were significant changes in turbidity，Ca2+-ATPase activity and total sulfhydryl contentat35℃.The totalsulfhydryl contentwas shown to be increased at40-50℃in short period，and then reduced significantly at 50℃ again，with significant decline in solubility.Myosin heavy chain（MHC）ofmyofibrillar protein from purpleback flying squid in South China Sea showed some degradation as raising temperature，but the paramyosin（PM）and actin remained unchanged basically.At35℃，themyofibrillar protein of purpleback flying squid began to form macromolecular substances and denatured gradually.

Key words：Sthenoteuthis oualaniensis；myofibrillar protein；heat treatment；physiochemical property

中圖分類號：TS254.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.012

文章編號：2095-1388（2016）02-0185-05

收稿日期：2015-06-15

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （1561000228）；農(nóng)業(yè)部中央公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) （2012TS03）；農(nóng)業(yè)部財(cái)政重大專項(xiàng)（NFZX2013）；工信部高技術(shù)船舶科研項(xiàng)目 （DC132101）

作者簡介：馬海霞 （1977—），女，碩士，副研究員。E-mail：58458219@qq.com

通信作者：楊賢慶 （1963—），男，研究員。E-mail：yxqgd@163.com