大蒜素對鯽非特異免疫指標(biāo)影響的研究

康淑媛，王　荻，盧彤巖

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

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大蒜素對鯽非特異免疫指標(biāo)影響的研究

康淑媛1、2，王荻1，盧彤巖1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

摘要：為評價(jià)大蒜素對鯽Carassius auratus非特異性免疫功能的影響，在鯽基礎(chǔ)飼料中分別添加250、500 mg/kg的大蒜素，并對鯽進(jìn)行42 d的養(yǎng)殖試驗(yàn)，其中試驗(yàn)的第1～28天飼喂含大蒜素的試驗(yàn)飼料，第29～42天飼喂不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料。結(jié)果表明：與投喂基礎(chǔ)飼料的對照組相比，添加250 mg/kg劑量的大蒜素能顯著提高鯽血清補(bǔ)體C3活力 （P＜0.05），而添加500 mg/kg劑量的大蒜素則能顯著抑制鯽血清補(bǔ)體C3、C4活力 （P＜0.05），改投不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料后，該劑量組C4活性仍顯著低于對照組 （P＜0.05）；添加250、500mg/kg劑量的大蒜素能顯著提高鯽血清、肝胰臟、腎臟和脾臟中溶菌酶 （LZM）活力 （P＜0.05），改投不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料的14 d內(nèi)，250、500 mg/kg劑量組血清LZM活性及500 mg/kg劑量組腎臟和脾臟LZM活性仍有顯著升高 （P＜0.05）；添加250 mg/kg劑量的大蒜素能顯著提高肝胰臟和脾臟中一氧化氮 （NO）含量 （P＜0.05），添加500mg/kg大蒜素能顯著提高血清和脾臟中NO含量（P＜0.05），但該劑量顯著抑制肝胰臟NO含量（P＜0.05），250、500 mg/kg劑量組腎臟中NO含量在第42天時(shí)均顯著高于對照水平（P＜0.05）。研究表明，鯽基礎(chǔ)飼料中大蒜素的適宜添加劑量為250 mg/kg。

關(guān)鍵詞：大蒜素；鯽；非特異免疫指標(biāo)

大蒜素 （Garlicin）又名大蒜新素，是大蒜的提取液或合成物，主要成分為二烯丙基三硫化物［1］。大蒜素具有健胃殺菌、解毒保健、護(hù)肝降脂、誘食增食、驅(qū)蟲殺蟲、促生長和提高免疫力等生物活性，且在動物體內(nèi)無積存、無耐藥性、毒性低、無 “三致”（致癌、致畸、致突變），現(xiàn)已作為一種飼料添加劑及免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中［2-6］。鯽Carassius auratus是中國淡水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚類之一［7］。非特異免疫防御機(jī)制是魚類抵抗病原入侵的第一道防線，主要包括補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、溶菌酶 （LZM）、一氧化氮 （NO）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛 （MDA）等非特異免疫體液因子、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬等［8］。目前，有關(guān)大蒜素對暗紋東方鲀［9］、鯉［10］、鏡鯉［11］、虹鱒［12］、草魚［13］和異育銀鯽［14］等魚免疫功能影響的研究已見報(bào)道。本試驗(yàn)中，在鯽飼料中添加兩種不同水平的大蒜素，投喂飼養(yǎng)一段時(shí)間后，通過測定鯽血清補(bǔ)體 C3、補(bǔ)體 C4、LZM、NO，以及鯽肝胰臟、腎臟和脾臟中的LZM和NO指標(biāo)，評價(jià)不同添加劑量的大蒜素對鯽非特異性免疫功能的影響，以期為大蒜素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚購自黑龍江省哈爾濱市某水產(chǎn)市場，初始體質(zhì)量為 （280±15）g；飼料為鯉魚商品料 （批號083），購自正大飼料有限公司。

試驗(yàn)藥品大蒜素 （批號162033），購自北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限公司，二烯丙基三硫醚含量為60％。

試驗(yàn)儀器包括：3K15離心機(jī) （美國Sigma公司）、FJ 200-S調(diào)速混勻器 （上海標(biāo)準(zhǔn)模型廠）、T-214電子天平 （德國賽多利斯公司）、XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 （北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、FJ 200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī) （上海標(biāo)準(zhǔn)模型廠）、Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

鯽在自動循環(huán)水魚缸 （100 cm×50 cm×50 cm）中暫養(yǎng)7 d后開始正式試驗(yàn)，暫養(yǎng)期間水溫為（25±1）℃，持續(xù)充氣，并投喂全價(jià)基礎(chǔ)飼料。

1.2.1 樣品的采集 將試驗(yàn)鯽隨機(jī)分成 A（對照）、B、C 3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放25尾魚。將大蒜素分別以0、250、500 mg/kg劑量添加到基礎(chǔ)飼料中，混勻后用絞肉機(jī)、制粒機(jī)制成直徑5 mm的3種試驗(yàn)飼料顆粒，置于陰涼通風(fēng)處晾干，于冰箱（-20℃）中保存待用。試驗(yàn)期間，每天8：00和17：00按鯽體質(zhì)量的2.5％分別投喂3種試驗(yàn)飼料，連續(xù)投喂28 d后改投基礎(chǔ)飼料14 d。

分別于試驗(yàn)的第7、14、28、35、42天從每個(gè)重復(fù)組中隨機(jī)選取5尾魚，從其尾靜脈采血，將血液以3500 r/min離心15 min，取血清；再將魚解剖，取其肝胰臟、腎臟和脾臟組織，將血清與組織樣品均置于超低溫冰箱 （-80℃）中保存待測。

1.2.2 樣品的處理 將血清樣品在37℃下水浴融化后即可檢測補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、LZM活性和NO含量。將肝胰臟、腎臟和脾臟樣品與預(yù)冷的生理鹽水按質(zhì)量 （g）與體積 （mL）比為1∶9稀釋，勻漿，根據(jù)檢測指標(biāo)及試劑盒要求進(jìn)行離心，并取組織上清液于冰箱 （-40℃）中保存，用于LZM活性和NO含量的測定。

1.2.3 指標(biāo)的測定 分別采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、比濁法、硝酸還原酶法測定補(bǔ)體C3與C4、LZM活性、NO含量。各指標(biāo)的測定均使用南京建成生物技術(shù)研究所的試劑盒。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S.E.）表示。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加不同水平大蒜素對鯽血清補(bǔ)體C3 和C4活性的影響

由表1可知：B組血清補(bǔ)體C3活性僅在第28天時(shí)顯著高于對照組 （A組）和C組 （P＜0.05），并達(dá)到最大值，C組血清補(bǔ)體C3活性在第28天時(shí)顯著低于對照組和B組 （P＜0.05），并達(dá)到最小值；B組血清補(bǔ)體C4活性與對照組無顯著性差異（P＞0.05），C組血清補(bǔ)體C4活性顯著低于對照組和B組 （P＜0.05），且在第35天時(shí)達(dá)到最小值。

表1　攝食添加不同水平大蒜素飼料對鯽血清補(bǔ)體C3和C4含量的影響Tab.1 Effects of different dietary levels of garlicin on contents of com p lement C3 and C4 in serum of crucian carp Carassius auratus　U/m L

表2　攝食添加不同水平大蒜素飼料對鯽血清和肝胰臟溶菌酶活性的影響Tab.2 Effects of different dietary levels of garlicin on activities of lysozyme（LZM）in serum and hepatopancreas of crucian carp Carassius auratus

2.2 不同添加水平大蒜素對鯽溶菌酶活性的影響

由表2可知：B組血清LZM活性在第14天和第35天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），C組血清LZM活性在第7～35天時(shí)均顯著高于對照組 （P＜0.05），B組和C組均在第28天時(shí)達(dá)到最大值；B、C組肝胰臟LZM活性均在第28天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），并達(dá)到最大值。

由表3可知：B組腎臟LZM活性在第14天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），并達(dá)到最大值，C組腎臟LZM活性在第7～35天時(shí)均顯著高于對照組（P＜0.05），并在第28天時(shí)達(dá)到最大值；B組脾臟LZM活性在第14、28天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），并在第14天時(shí)達(dá)到最大值，C組脾臟LZM活性在第14、28、35天時(shí)均顯著高于對照組 （P＜0.05），并在第14天時(shí)達(dá)到最大值。

表3　攝食添加不同水平大蒜素飼料對鯽腎臟和脾臟溶菌酶活性的影響Tab.3 Effects of different dietary levels of garlicin on activities of LZM in kidney and sp leen of crucian carp Carassius auratusU/mg

2.3 不同添加水平大蒜素對鯽NO含量的影響

由圖1可知：C組鯽血清NO含量僅在第14、28天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），B組血清NO含量與對照組、C組無顯著性差異 （P＞0.05）；B組鯽肝胰臟NO含量在第28、35天時(shí)顯著高于對照組和C組 （P＜0.05），并第28天時(shí)達(dá)到最大值，C組肝胰臟NO含量僅在第14、35天時(shí)顯著低于對照組和B組 （P＜0.05）；B、C組鯽腎臟NO含量均在第42天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05）；B組和C組鯽脾臟NO含量均在第14天時(shí)顯著高于對照組 （P＜0.05），并達(dá)到最大值，且C組顯著高于B組 （P＜0.05）；其余時(shí)間點(diǎn)各組織的各組間NO含量均無顯著性差異 （P＞0.05）。

注：標(biāo)有不同小寫字母者表示同一時(shí)間點(diǎn)組間有顯著性差異 （P＜0.05），標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異 （P＞0.05）Note：Themeans with different letters are significant differences at same time at the 0.05 probability level，and themeans with the same letters are not significant differences圖1　攝食添加不同水平大蒜素飼料對鯽血清、肝胰臟、腎臟、脾臟中NO含量的影響Fig.1 Effects of different dietary levels of gar licin on con tents of NO in serum，hepatopancreas，kidney，and sp leen of crucian carp Carassius auratus

3 討論

3.1 大蒜素對補(bǔ)體C3、C4活性的影響

補(bǔ)體系統(tǒng)是魚體非特異免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，鱒科、鯉科等養(yǎng)殖魚類旁路途徑的活性比哺乳動物高出5～60倍，不需要抗體即可激活補(bǔ)體反應(yīng)［15］。補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最多的成分，能發(fā)揮溶菌殺菌、免疫調(diào)節(jié)、免疫復(fù)合物溶解和清除等生物學(xué)功效［16-18］。補(bǔ)體C4是補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑中的主要成分，它在機(jī)體防御過程中可以調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞機(jī)制、清除病原微生物，并通過活化炎性細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用等來提高機(jī)體的免疫機(jī)能［19］。周顯青等［20］研究發(fā)現(xiàn)，維生素C只有在一定劑量范圍內(nèi)才能促進(jìn)補(bǔ)體C3和C4合成，低于此范圍對補(bǔ)體的產(chǎn)生無影響，高于此范圍則產(chǎn)生抑制作用，且此劑量范圍在不同動物間存在一定差異?？梢?，給藥劑量、動物種類是影響補(bǔ)體C3和C4合成的重要因素。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的大蒜素在飼喂相同時(shí)間后對鯽血清補(bǔ)體C3、C4活力的影響不同。連續(xù)投喂含大蒜素的飼料28 d后，250 mg/kg大蒜素顯著提高了血清補(bǔ)體C3活力，顧雪飛等［10］研究表明，在每千克鯉飼料中添加30 g新鮮大蒜素，飼喂30 d后可以顯著提高鯉血清中補(bǔ)體C3活力，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。改投不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料2周后，250 mg/kg劑量組鯽血清補(bǔ)體C3活力下降到對照水平，但此劑量大蒜素對血清補(bǔ)體C4無顯著影響，這與徐奇友等［11］報(bào)道的低劑量（0.5％）大蒜莖粉顯著提高血清C4活力的結(jié)果不同。而投喂500 mg/kg大蒜素顯著抑制鯽血清補(bǔ)體C3、C4活力，這可能與高劑量大蒜素會減弱補(bǔ)體C3、C4對吞噬細(xì)胞機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，破壞炎性細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用有關(guān)，改投不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料后，補(bǔ)體C3活力升高并恢復(fù)到對照水平，但補(bǔ)體C4活力仍顯著低于對照組。

3.2 大蒜素對LZM活性的影響

LZM是水生動物體內(nèi)重要的非特異性免疫防御因子，廣泛存在于魚類體表的黏液、鰓、血清、腸胃分泌液和吞噬細(xì)胞的溶酶體顆粒中，它在水產(chǎn)動物抵抗病原微生物感染中具有重要作用［21-23］。魚類 LZM的殺菌活性遠(yuǎn)強(qiáng)于高等脊椎動物L(fēng)ZM［24］。LZM能對某些細(xì)菌發(fā)揮先天抵抗作用，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，致使細(xì)菌內(nèi)容物溢出，從而殺死細(xì)菌，亦可誘導(dǎo)其他免疫因子的合成和分泌［24-26］。國內(nèi)外研究表 明，種屬［27-28］、環(huán)境［29-30］、溫度［31-32］、pH［33-34］、給藥劑 量［35-37］、給藥時(shí)間［10］等復(fù)雜原因可造成不同動物間LZM活性的差異。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過一段時(shí)間飼喂后，劑量為250、500 mg/kg的大蒜素均能提高鯽血清、肝胰臟、腎臟和脾臟LZM活性，并在一定時(shí)間范圍內(nèi)達(dá)到酶活力最高峰，增強(qiáng)鯽的非特異性免疫力，從而提高鯽的抗病力。這可能與大蒜素可激活組織中巨噬細(xì)胞的分泌功能，促使溶菌酶大量釋放功能，增強(qiáng)魚體非特異性免疫功能有關(guān)［23，38］。曹丹等［9］研究表明，在飼料中添加100 mg/kg的大蒜素，能提高暗紋東方鲀脾臟中LZM活性。宋文華等［13］發(fā)現(xiàn)，添加不同劑量的大蒜素在經(jīng)過一段時(shí)間飼喂后能提高草魚血清LZM活性。徐奇友等［11］發(fā)現(xiàn)，在鏡鯉飼料中添加0.5％和2.5％的大蒜莖粉，均可提高魚血清LZM活性。呂富等［14］研究表明，飼料中添加大蒜渣可顯著提高異育銀鯽肝胰臟和肌肉中LZM活性。李嬋等［12，39］在飼料中添加15 mg/kg大蒜素后，虹鱒鰓和肝臟中LZM活性顯著提高。以上研究結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果相同。改投不含大蒜素的基礎(chǔ)飼料一段時(shí)間內(nèi)，250 mg/kg和500 mg/kg劑量組鯽血清LZM活性及500 mg/kg劑量組鯽腎臟和脾臟LZM活性仍有顯著升高，但隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，以上各組織器官中LZM活性均恢復(fù)到對照水平。由此說明，停喂大蒜素后，鯽體內(nèi)LZM活性在一段時(shí)間內(nèi)仍保持較高水平。本試驗(yàn)中高劑量組鯽血清、肝胰臟、腎臟和脾臟LZM活性好于低劑量組，這說明添加劑量對鯽各組織器官中LZM活性具有重要影響作用。

3.3 大蒜素對NO含量的影響

NO是體內(nèi)非特異性防御反應(yīng)系統(tǒng)的組成部分，它在機(jī)體內(nèi)是由誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （iNOS）或結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶 （nNOS）與底物作用生成，能對抑制脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基發(fā)揮重要的作用［40-41］。曹麗萍等［42］在研究黃芪多糖（APS）對鯉免疫細(xì)胞的免疫活性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，低濃度的黃芪多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，高濃度黃芪多糖卻表現(xiàn)為抑制作用。張晉強(qiáng)等［43］以腹腔注射的方式給予小鼠5種不同濃度的APS，發(fā)現(xiàn)100 mg/kg和200 mg/kg劑量的APS可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生?？梢?，動物體內(nèi)NO的生成與給藥劑量密切相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，250 mg/kg劑量的大蒜素顯著提高了鯽肝胰臟和脾臟中NO含量，500 mg/kg的大蒜素顯著提高了鯽血清和脾臟中NO含量，而500 mg/kg的劑量則顯著抑制了肝胰臟中NO含量。究其原因，可能是不同劑量大蒜素對鯽各組織選擇性作用不同，故產(chǎn)生NO的量也不同。本試驗(yàn)中各劑量組鯽血清、肝胰臟和脾臟NO含量均隨含大蒜素飼料的停喂而恢復(fù)到對照水平，而腎臟中NO含量在第42天時(shí)仍顯著高于對照水平，出現(xiàn)此現(xiàn)象的具體原因仍需進(jìn)一步研究。馮永輝等［44］研究表明，黑大蒜提取物能顯著增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)NO的分泌，增強(qiáng)其細(xì)胞免疫應(yīng)答。蔡春芳等［45］在銀鯽飼料中添加0.5％大蒜素，表現(xiàn)出顯著的免疫增強(qiáng)作用和一定程度的促生長作用。

綜上所述，投喂添加500 mg/kg大蒜素飼料能顯著提高鯽部分組織器官的非特異免疫指標(biāo)活性，且停止投喂含大蒜素的飼料后，鯽血清、腎臟和脾臟中LZM活性仍顯著高于對照水平，但此劑量會抑制鯽血清補(bǔ)體C3和C4活性，并降低其肝胰臟中NO含量；而投喂添加250 mg/kg大蒜素飼料，均能提高鯽各組織的非特異免疫指標(biāo)，且停喂含大蒜素的飼料后，鯽血清中LZM活性在一段時(shí)間內(nèi)仍能保持較高水平。因此，建議鯽基礎(chǔ)飼料中大蒜素的添加劑量為250 mg/kg，且需長期投喂。

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Effects of garlicin on nonspecific immune indices of crucian carp Carassius auratus

KANG Shu-yuan1，2，WANG Di1，LU Tong-yan1
（1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

Abstract：A 42 day feeding trailwas conducted to evaluate impactof diets supplemented with garlicin at a dose of 250 mg/kg and 500 mg/kg on non-specific immune function of crucian carp Carassius auratus.The crucian carp with initial body weight of（280±15）g was fed the diets containing garlicin in the early 28 days，and then fed the control dietwithout supplementation of garlicin for the rest later days.The results showed that the serum C3 activity was increased significantly in the fish fed the diet containing garlicin at a rate of250 mg/kg compared with the fish in the control group（P＜0.05）.However，the serum C3，and C4 activitieswere shown to be decreased significantly in the fish fed the diet containing garlicin ata rate of500 mg/kg（P＜0.05）and the serum C4 activity was still declined significantly（P＜0.05）in the fish fed the control diet.The fish fed the diets containing garlicin ata rate of 250 mg/kg and 500 mg/kg had significantly higher LZM activities in serum，hepatopancreas，kidney and spleen （P＜0.05）than the fish fed the control diet did.There was significantly higher LZM activity in serum in the fish fed the diet containing garlicin at a rate of 250 mg/kg and significantly higher LZM activities in serum，kidney and spleen in the fish fed the diet containing garlicin ata rate of500 mg/kg garlicin（P＜0.05）even when the fish fed the control diet.Therewere significantly higher contents of NO in hepatopancreas and spleen in the fish fed the diet containing garlicin at a rate of250mg/kg，and in serum and spleen in the fish fed the diet containing garlicin ata rate of500 mg/kg（P＜0.05），instead of hepatopancrease，compared with the fish in the control group（P＜0.05）. There were significantly higher contents of NO in kidney in the fish fed the diet containing garlicin at a rate of 250 mg/kg and 500 mg/kg in 42 days（P＜0.05）than in the fish fed the control diet.It is recommended that the optimal addition of garlic in feed was at a dose of 250 mg/kg diet.

Key words：garlicin；Carassius auratus；nonspecific immune index

中圖分類號：S948

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.009

文章編號：2095-1388（2016）02-0168-06

收稿日期：2015-05-29

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè) （農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng) （201203085）

作者簡介：康淑媛 （1989—），女，碩士研究生。E-mail：kangshuyuan0116@163.com

通信作者：盧彤巖 （1967—），女，博士，研究員。E-mail：lutongyan@hotmail.com