從珍珠龍躉體內(nèi)分離的1株創(chuàng)傷弧菌的鑒定及耐藥性分析

辜良斌，徐力文，王　雨，蘇友祿，劉廣鋒，郭志勛，馮　娟

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南三亞572018）

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從珍珠龍躉體內(nèi)分離的1株創(chuàng)傷弧菌的鑒定及耐藥性分析

辜良斌1、2，徐力文1，王雨3，蘇友祿1，劉廣鋒1，郭志勛1，馮娟1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南三亞572018）

摘要：為研究創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus對藥物的敏感性，減少珍珠龍躉養(yǎng)殖業(yè)中的病害影響，從患病珍珠龍躉 （pearl gentian）（棕點(diǎn)石斑魚Epinephelus fuscoguttatus♀×鞍帶石斑魚E.lanceolatus♂）肝腎中分離出一株病原菌，編號為X11XC26，并對其進(jìn)行了鑒定及耐藥性分析。經(jīng)攻毒試驗(yàn)證明，該菌對斜帶石斑魚E.coioides有較強(qiáng)的致病性，半數(shù)致死濃度 （LD50）為1.70×105CFU/g，呈急性感染型；對該菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化試驗(yàn)、API（32E）系統(tǒng)鑒定和16S rDNA、rctB、topA、mreB、rpoD等5種管家基因序列分析，可將該菌株鑒定為創(chuàng)傷弧菌；通過紙片擴(kuò)散K-B法測試了該菌株對16種藥物的敏感性，結(jié)果顯示，該菌株對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星和阿莫西林5種藥物敏感，對多粘菌素B等11種藥物不敏感。本研究中從患病珍珠龍躉體內(nèi)分離出創(chuàng)傷弧菌在國內(nèi)屬首次報(bào)道，而該菌株較強(qiáng)的耐藥性應(yīng)引起人們的關(guān)注。

關(guān)鍵詞：珍珠龍躉；創(chuàng)傷弧菌；藥物敏感；管家基因

創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，隸屬于弧菌科Vibrio、弧菌屬Vibrio，生活在溫帶和熱帶生態(tài)系統(tǒng)中，是水域常見的一類細(xì)菌［1-2］。1976年，Holli從血液中分離出該菌，鑒定為乳酸陰性嗜鹽弧菌，1979年，F(xiàn)armer正式將其命名為創(chuàng)傷弧菌［3］。創(chuàng)傷弧菌是一類重要的病原菌，已報(bào)道的感染對象有鰻鱺Anguilla anguilla、大菱鲆Scophthalmusmaximus、黃姑魚Nibea albiflora、矛尾復(fù)蝦虎魚Synechogobius hasta等，該菌均能引起這些魚類嚴(yán)重的出血和潰爛癥狀［4-7］。創(chuàng)傷弧菌同時(shí)還是人魚共患菌，能引起創(chuàng)口感染及原發(fā)性敗血癥，死亡率超過了50％［8］。

石斑魚是海水養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖種類。珍珠龍躉 （pearl gentian）又稱珍珠斑或龍虎斑，是由棕點(diǎn)石斑魚Epinephelus fuscoguttatus♀與鞍帶石斑魚Epinephelus lanceolatus♂雜交培育出來的新品種。育苗成功后，在天津、山東、海南、福建、廣東等地得到廣泛推廣［9］。珍珠龍躉結(jié)合了父本生長快速和母本肉質(zhì)細(xì)膩的特點(diǎn)，又具有虎斑頭、龍膽尾的外形，可作為觀賞魚養(yǎng)殖，被稱為 “石斑魚的后起之秀”［10-11］。珍珠龍躉適應(yīng)能力強(qiáng)，適合網(wǎng)箱、池塘多種養(yǎng)殖模式，特別是高密度養(yǎng)殖［12］。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害問題接連發(fā)生，尤其是細(xì)菌性疾病 （弧菌?。┑挠绊懽顬閺V泛［13-14］，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前，關(guān)于珍珠龍躉的研究多集中在育種、養(yǎng)殖方面，未見有關(guān)珍珠龍躉弧菌病的報(bào)道［15-16］。

2011年，海南新村養(yǎng)殖的珍珠龍躉突發(fā)大量死亡，筆者從病魚體內(nèi)分離出一株細(xì)菌，采用生理生化方法和分子生物學(xué)方法對致病菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究了該株菌對16種藥物的敏感性，以期為該病毒的防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病珍珠龍躉于2011年取自發(fā)生嚴(yán)重疾病的海南新村珍珠龍躉養(yǎng)殖場，病魚體表觀察無明顯癥狀。健康斜帶石斑魚Epinephelus coioides體質(zhì)量為（31.7±5.4）g，體長為 （11.4±0.6）cm，取自深圳某養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 組織樣品的制備 將患病的珍珠龍躉解剖后觀察到病魚肝臟、腎臟腫大，隨機(jī)選取2尾瀕死病魚的肝、腎組織，分別劃線于TCBS和營養(yǎng)瓊脂平板，28℃下培養(yǎng)過夜，將得到的優(yōu)勢細(xì)菌 （編號為X11XC26）純化培養(yǎng)，同時(shí)取腎臟組織固定，做組織病理切片以觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.2.2 菌株致病性檢測 將健康斜帶石斑魚在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為E1、E2、E3、E4、對照組，每組設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)組、對照組每個(gè)平行分別放 10、7尾魚。將供試菌 X11XC26接種到2216E斜面上培養(yǎng)12～16 h，用無菌生理鹽水制備4個(gè)濃度梯度的菌懸液，分別對試驗(yàn)組魚進(jìn)行腹腔注射，劑量為0.2 m L/尾，對照組注射等量生理鹽水。注射菌液后正常飼養(yǎng)，觀察并記錄7 d內(nèi)的情況，在試驗(yàn)組瀕死魚肝、腎中劃線分離細(xì)菌，利用寇式法計(jì)算半數(shù)致死濃度 （LD50，CUF/g）：

其中：Xg為死亡率為100％組劑量的對數(shù)；d為相鄰兩組劑量對數(shù)之差；∑P為各組死亡率之和。

1.2.3 菌株形態(tài)及生理生化特性分析 將菌株X11XC26用革蘭氏染色后鏡檢觀察染色情況。取純培養(yǎng)的細(xì)菌，接種于2216E斜面培養(yǎng)基中，按常規(guī)生理生化鑒定步驟進(jìn)行試驗(yàn)［17］，同時(shí)做API （32E）系統(tǒng)鑒定。

1.2.4 16S rDNA、mreB、rctB、rpoD、topA序列的測定和分析 采用煮沸法提取分離菌DNA用作PCR模板。PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性1 min，48～63℃下退火2 min，72℃下延伸10 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系（共50μL）：Premix rTaq 25μL，上、下游引物各1.5μL，DNA 2μL，ddH2O 20μL。PCR引物見表1［18-19］。取5μL PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，在130 V、25 min條件下檢測結(jié)果。將擴(kuò)增所得陽性產(chǎn)物送英濰捷基 （廣州）公司進(jìn)行測序。

1.2.5 菌株對藥物的敏感試驗(yàn) 按照NCCL試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)［20］，采用紙片擴(kuò)散 K-B法，取100μL菌懸液 （濃度約為108CFU/mL）涂布于MHA培養(yǎng)基上，10 min后貼藥敏紙片，于28℃下培養(yǎng)24 h后，觀察并測量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑的大小判斷菌株對藥物的敏感性。

表1　引物信息Tab.1 The primers used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

將患病的珍珠龍躉肝、腎組織劃線于TCBS平板及營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)12～18 h后，觀察到兩種平板上均有優(yōu)勢細(xì)菌存在，且TCBS平板中上只有該種細(xì)菌存在。將平板上的細(xì)菌純化分離后得到一菌株，將其命名為X11XC26。

2.2 患病珍珠龍躉腎組織的病理觀察

通過對患病珍珠龍躉腎組織的病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)患病魚腎臟組織已纖維化，且可見大量細(xì)菌聚集（圖1）。

圖1　腎臟組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.1 Histopathological section of the kidney

2.3 菌株X11XC26的致病性

人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株X11XC26對健康斜帶石斑魚有強(qiáng)致病性 （表2），計(jì)算得出其半數(shù)致死濃度LD50為1.70×105CFU/g。取感染后斜帶石斑魚的肝、腎組織，進(jìn)行細(xì)菌分離、純化，得到的菌株命名為X11-01。

表2　菌株X11XC26對斜帶石斑魚人工感染結(jié)果Tab.2 Pathogenicity of X11XC26 strain to orange-spotted grouper Epinephelus coioides

2.4 菌株形態(tài)及生理生化特征

經(jīng)革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，菌株X11XC26和X11-01均為革蘭氏陰性細(xì)菌，呈短桿狀；TCBS生長呈綠色，O/129（150μg/片）敏感；該菌在3％NaCl胨水、6％NaCl胨水中均能生長，在無鹽胨水、8％NaCl胨水、10％NaCl胨水中不生長；該菌在28、35℃下均能生長，在4、15、42℃下均不生長；氧化酶、過氧化氫酶為陽性，VP反應(yīng)為陰性，能利用葡萄糖、麥芽糖 （表3）。

表3　菌株X11XC26和X11-01的主要生理生化指標(biāo)檢測結(jié)果Tab.3 M ain phenotyp ic traits of strains X11XC26 and X11-01

2.5 16S rDNA、mreB、rctB、topA、rpoD序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

雙向測序得到菌株X11XC26的上述5個(gè)基因片段，將基因按照mreB-rctB-rpoD-topA的順序串聯(lián)起來，與創(chuàng)傷弧菌菌株進(jìn)行比對，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析 （圖2和圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該株病原菌與創(chuàng)傷弧菌能自然聚類，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征確定X11XC26菌株為創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus。

圖2　菌株X11XC26的16S rDNA序列分析聚類結(jié)果Fig.2 Dendrogram of 16S rDNA sequence analysis of strain X11XC26

圖3　菌株X11XC26 4個(gè)基因串聯(lián)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic constructions of four concatenated genes in strain X11XC26

2.6 菌株的藥敏試驗(yàn)

利用紙片法測定16種抗菌藥物對菌株X11XC26與X11-01的作用效果，兩株菌株對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿莫西林等5種藥物均敏感，對多粘菌素B、卡那霉素、青霉素G、慶大霉素、四環(huán)素、呋喃唑酮、利福平、復(fù)方新諾明、紅霉素、氯霉素、頭孢克肟等11種抗生素均不敏感 （表4）。

表4　致病菌X11XC26與X11-01對不同抗菌藥物的敏感性Tab.4 Antibacterial activities of different antim icrobial agents to the pathogens X11XC26 and X11-01

3 討論

創(chuàng)傷弧菌是一類 “機(jī)會性”人類病原菌，能引起腸胃炎、敗血癥等癥狀，致死率較高。若將攜帶創(chuàng)傷弧菌的水產(chǎn)品流通，很容易引發(fā)大面積的感染。1992年，中國報(bào)道了首例由創(chuàng)傷弧菌引起的疾病，創(chuàng)傷弧菌主要通過傷口感染或食用未煮熟的貝類傳播，其中食用生海鮮為主要的人類感染途徑，如牡蠣Ostrea plicatula、文蛤Meretrixmeretrix、貽貝Mytilus edulis［21］等。曹敏華等［22］的研究顯示，僅珠海地區(qū)89種海產(chǎn)品中，創(chuàng)傷弧菌的總陽性檢出率就達(dá) 43.82％，其中牡蠣的檢出率達(dá)到了60.87％。石亞素等［23］從舟山市區(qū)114份海蝦樣品中檢出了23份創(chuàng)傷弧菌樣品，檢出率為20.18％。以上兩位研究者均發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌的檢出率呈季節(jié)性變化，在4—9月污染率較高，此結(jié)果與 Cantet等［24］的研究結(jié)果吻合。根據(jù)基因型和表型的不同，創(chuàng)傷弧菌可被分為3個(gè)生物型：生物性Ⅰ型，為人類病原菌，分布在世界各地；生物性Ⅱ型，能感染魚和人類，全世界均有分布；生物性Ⅲ型，主要在以色列地區(qū)有報(bào)道，能引發(fā)人類弧菌?。?，25］。由于創(chuàng)傷弧菌的嚴(yán)重危害，該菌在2006年被 《Emerging Infectious Diseases》雜志列入最危險(xiǎn)的細(xì)菌之列［26］。

本試驗(yàn)中，人工感染試驗(yàn)確認(rèn)菌株X11XC26有強(qiáng)致病性，LD50為1.70×105CFU/g。感染后的斜帶石斑魚游動緩慢，取瀕死魚解剖觀察到肝、腎組織充血腫大。從人工感染發(fā)病死亡的石斑魚體內(nèi)分離到菌株X11-01，該菌株與X11XC26菌株生理生化特性表現(xiàn)一致，由此可確定菌株X11XC26的致病性。試驗(yàn)中，選取健康斜帶石斑魚驗(yàn)證該菌株的病原性，且能復(fù)制出患病珍珠龍躉的典型癥狀，該試驗(yàn)有效地證實(shí)了此次分離到的創(chuàng)傷弧菌的致病性。創(chuàng)傷弧菌具有 “人魚共患性”，本試驗(yàn)中首次從珍珠龍躉中分離到創(chuàng)傷弧菌，創(chuàng)傷弧菌宿主范圍的增大應(yīng)該得到重視。

本試驗(yàn)中，將mreB-rctB-rpoD-topA基因串聯(lián)后，與NCBI中登錄的創(chuàng)傷弧菌的基因比對，結(jié)果顯示，菌株X11XC26與菌株Vvyb1的一致性達(dá)100％。菌株Vvyb1為生物性Ⅲ型菌株，但菌株X11XC26的生物性型尚需通過測定生物型相關(guān)基因才能確定。對16種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株X11XC26對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等4種喹諾酮類藥物及阿莫西林敏感，對其余的11種藥物不敏感，耐藥性強(qiáng)。珍珠龍躉為中國新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，但其耐藥性極強(qiáng)?？咕幬镌谥袊a(chǎn)動物疾病防治中占主要地位，但藥物的過度使用易造成細(xì)菌的耐藥性，同時(shí)細(xì)菌間相互獲得耐藥基因也是耐藥性產(chǎn)生的重要原因［27-28］。因此，合理且有效使用抗菌藥物迫在眉睫，同時(shí)，應(yīng)該找尋其他的途徑進(jìn)行疾病的預(yù)防，如中草藥的應(yīng)用［29-30］等。此外，還應(yīng)研究疾病發(fā)生的流行病學(xué)和病原菌的耐藥機(jī)制，尋找其他合理有效的方法預(yù)防疾病的發(fā)生［31-32］。

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Identification and drug sensitivity of a pathogenic Vibrio vulnificus isolated from pearl gentian，a hybrid of brownmarbled grouper Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂

GU Liang-bin1，2，XU Li-wen1，WANG Yu3，SU You-lu1，LIU Guang-feng1，GUO Zhi-xun1，F(xiàn)ENG Juan1
（1.Key Laboratory of South China Sea Fishery Resouurce Exploitation&Utilization，Ministry of Agriculture，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；3.Tropical Fisheries Research and DevelopmentCenter，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Sanya 572018，China）

Abstract：A bacterium strain X11XC26 was isolated from pearl gentian，a hybrid of brownmarbled Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂，whose virulence to grouper Epinephelus coioides was confirmed by pathogenicity assays，with LD50of 1.70×105CFU/g in the fishes infected by intraperitoneal injection.The physiological test revealed that it had significantly similar characteristics to Vibrio vulnificus.The phylogenetic analysis of 16S rDNA，rctB，topA，mreB and rpoD genes revealed that the strain X11XC26 showed the high similarity to V.vulnificus.Itwas found that the strain X11XC26 was sensitive to norfloxacin，ofloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin and amoxicilin，and not sensitive to polymyxin K-B.The strain X11XC26 of V.vulnificus isolated for the first time from pearl gentian is not reported until now，and should be paid more attention to its drug resistance.

Key words：pearl gentian；Vibrio vulnificus；drug sensitivity；housekeeping gene

中圖分類號：S941.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.008

文章編號：2095-1388（2016）02-0162-06

收稿日期：2015-06-04

基金項(xiàng)目：國家自然基金青年基金資助項(xiàng)目 （31202027）；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院院級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) （2014KX0604）；海南省科技興海項(xiàng)目 （2015XH03）；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （314179）

作者簡介：辜良斌 （1989—），女，碩士研究生。E-mail：guliangbin2012@163.com

通信作者：馮娟 （1973—），女，研究員。E-mail：jannyfeng@163.com