獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1基因的克隆及低溫適應(yīng)功能檢測(cè)

王桂志，張　永， 張　弛，許強(qiáng)華、2、3、4、5

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，上海201306；4.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海201306；5.遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306）

?

獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1基因的克隆及低溫適應(yīng)功能檢測(cè)

王桂志1，張永1， 張弛1，許強(qiáng)華1、2、3、4、5

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.農(nóng)業(yè)部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，上海201306；4.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海201306；5.遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201306）

摘要：為從細(xì)胞水平上研究獨(dú)角雪冰魚Chionodraco hamatus和伯氏肩孔南極魚Trematomus bernacchii的低溫適應(yīng)能力，采用RT-PCR方法，獲得獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白（transient receptor potential channels V1，TRPV1）基因序列，其開放閱讀框全長(zhǎng)均為2310 bp；生物信息學(xué)分析表明，兩種南極魚TRPV1基因均編碼769氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別為88 210和88 160，理論等電點(diǎn)分別為7.63和8.26；兩種南極魚TRPV1蛋白均無信號(hào)肽；亞細(xì)胞定位顯示，TRPV1蛋白主要在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)功能；理化性質(zhì)分析表明，兩種南極魚的TRPV1為不溶性跨膜蛋白，分別有34、35個(gè)磷酸化位點(diǎn)和6、5個(gè)糖基化位點(diǎn)，二者均含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、5個(gè)錨蛋白結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲為主；同源性分析顯示，獨(dú)角雪冰魚TRPV1氨基酸序列與伯氏肩孔南極魚的一致性最高，為93.4％，與其他物種的一致性為44.3％～69.8％；低溫適應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種南極魚的TRPV1基因不能被溫度所激活。研究表明，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1基因可能與低溫適應(yīng)無關(guān)。

關(guān)鍵詞：獨(dú)角雪冰魚；伯氏肩孔南極魚；TPRV1基因；低溫適應(yīng)

瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白 （transient receptor potential ion channel protein，TRP）是研究比較廣泛的一類非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白，主要存在于生物膜上，其超家族由TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN等7個(gè)亞家族組成［1-2］。TRPV亞家族蛋白主要由6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和3～4個(gè)錨蛋白結(jié)構(gòu)域組成，在第5和第6跨膜結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)孔道環(huán)［1］，作為陽(yáng)離子進(jìn)出的門戶。TRP超家族中有不少蛋白與溫度感應(yīng)有關(guān)，其中包括TRPV亞家族的 TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4，TRPM亞家族的TRPM8，TRPA亞家族的TRPA1［3-4］。TRPV1是TRP超家族中的一種可以感受高溫的非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白，該蛋白可被多種因子激活，包括溫度、辣椒堿、滲透壓刺激、機(jī)械力刺激、化學(xué)刺激、膜電位刺激等因子［1，3］。研究表明，當(dāng)溫度高于43℃時(shí)，小鼠的TRPV1基因可被激活［1，3］，但當(dāng)溫度高于25℃時(shí)，斑馬魚的TRPV1基因即可被激活，同時(shí)隨著pH值的減小，TRPV1基因的熱激活溫度閾值也相應(yīng)降低［5-6］。此外，敲除小鼠的TRPV1基因后，小鼠對(duì)熱的反應(yīng)能力明顯降低甚至缺失，且TRPV1基因的阻斷劑能夠使動(dòng)物的體溫升高［3］；Gau等［6］的研究顯示，敲除TRPV1基因后，斑馬魚的溫度適應(yīng)能力明顯降低。以上研究表明，TRPV1基因在動(dòng)物的熱覺感受及體溫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用［3-4］。目前的研究已經(jīng)確認(rèn)，TRPV1基因被激活時(shí)細(xì)胞外的鈣離子流到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增高，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理功能或病理機(jī)制［7-8］。在心血管系統(tǒng)中，TRPV1基因還參與血管張力變化［9］以及高血壓［10］、心肌缺血［11］、動(dòng)脈粥樣硬化［12］等多種心血管疾病的生理和病理過程。

南極海域的海水溫度最低可以降到-1.8℃，南極魚類生活在如此低的溫度環(huán)境中，經(jīng)過長(zhǎng)期低溫適應(yīng)，其負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣的器官選擇壓力有所下降。獨(dú)角雪冰魚Chionodraco hamatusis隸屬于鱸形目、南極魚亞目、鱷冰魚科，與其他脊椎動(dòng)物不同的是其終生沒有血紅蛋白的表達(dá)［13-14］，該魚生活的水域水深為800 m，是南極整個(gè)大陸架生物多樣性的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，南極獨(dú)角雪冰魚心臟的大小及收縮強(qiáng)度、組織血管化程度、血管內(nèi)徑和線粒體密度均比非南極魚大，這些特殊的適應(yīng)特性與TRPV1蛋白參與調(diào)節(jié)心血管疾病的性狀有相似之處，作者猜測(cè)TRPV1蛋白是南極冰魚低溫適應(yīng)過程中的一個(gè)重要的通道，故本研究中選其作為目的物種；伯氏肩孔南極魚Trematomus bernacchii為鱸形目、南極魚亞目、南極魚科的一種，經(jīng)過初步試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其與冰魚有較近的親緣關(guān)系，不同的是其心血管系統(tǒng)并沒有發(fā)生像獨(dú)角雪冰魚一樣的適應(yīng)進(jìn)化，故選其作為獨(dú)角雪冰魚的第一種對(duì)照物種；尼羅羅非魚Oreochromis niloticus是世界上重要的淡水養(yǎng)殖魚類，最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃，因其生長(zhǎng)在熱帶，故選其作為研究獨(dú)角雪冰魚低溫適應(yīng)功能的另一種對(duì)照物種。本研究中，通過克隆首次獲得了兩種南極魚的TRPV1基因序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在細(xì)胞水平上對(duì)其低溫適應(yīng)性進(jìn)行了探討，旨在為進(jìn)一步研究TRPV1基因在魚類的低溫功能適應(yīng)方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚均采自南極埃默里冰架和熊貓碼頭，體質(zhì)量分別為450 g和125 g；尼羅羅非魚采自上海南匯水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為355 g。

真核細(xì)胞CHO-K1是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的一種，為大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存，直接復(fù)蘇后使用。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚解剖后，取其腦組織于超低溫冰箱 （-80℃）中保存?zhèn)溆?；將尼羅羅非魚活體解剖后，直接取腦組織使用。

1.2.2 腦組織總RNA的提取 通過Trizol法提取3種魚的腦組織總RNA。

1.2.3 TRPV1 ORF序列的克隆 運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)目的基因ORF片段進(jìn)行擴(kuò)增。使用M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，USA）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用于PCR擴(kuò)增。根據(jù)南極美露鱈Dissostichusmawsoni基因組測(cè)序相關(guān)序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的同源序列設(shè)計(jì)引物（表1）。PCR反應(yīng)體系 （共25μL）：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPMix（2.5 mmol/L each）2.0μL，上、下游引物各0.5μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5μL，用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序：95℃下預(yù)變性3 min；95℃下變性30 s，52～68℃下退火30 s，72℃下延伸1～2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后與pGEM?-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑選陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒，將陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程 （上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選取限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SacⅡ，設(shè)計(jì)相應(yīng)的酶切引物 （表1），以TRPV1各自兩段序列的膠回收產(chǎn)物為模板，應(yīng)用高保真酶進(jìn)行ORF全長(zhǎng)PCR，并進(jìn)行克隆、提取質(zhì)粒、測(cè)序，方法同上。

表1　擴(kuò)增TRPV1 ORF所用引物Tab.1 Nucleotide sequences of p rimers used in cloning of TRPV1 open reading frame（ORF）

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用DNAStar進(jìn)行TRPV1序列片段的拼接和氨基酸序列的推導(dǎo)；分別用ProtParam、IBCP、PHYRE2和TMHM程序推測(cè)蛋白的理化性質(zhì)［15］、二級(jí)結(jié)構(gòu)［16］、三級(jí)結(jié)構(gòu)［17］和跨膜結(jié)構(gòu)［18］；分別用Protscale、NetPhos和NetNGlyc軟件推測(cè)蛋白的親疏水性、磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)；分別用 TargetP、SignalP 4.0軟件推測(cè)蛋白的潛在信號(hào)肽和分泌途徑，用PSORT IIPrediction程序分析蛋白的亞細(xì)胞定位，用Smart程序推測(cè)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；分別使用BLAST和MEGA 5.1軟件分析其同源性以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［19］。

1.2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)所得ORF序列與pIRES2-EGFP-ToL2-CMV真核表達(dá)載體 （本實(shí)驗(yàn)室擁有）序列，選取限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SacⅡ構(gòu)建3種試驗(yàn)魚TRPV1的真核重組表達(dá)載體。

1.2.6 真核細(xì)胞低溫適應(yīng)試驗(yàn) 將CHO細(xì)胞提前24 h轉(zhuǎn)移至96孔黑板 （可以加PS+FBS），且保證次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為60％～80％。24 h后采用1∶3比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染 （轉(zhuǎn)染試劑為英格恩生物公司的EntransterTM-D），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；換液后，將細(xì)胞分常溫和低溫兩組，分別置于常溫37℃培養(yǎng)箱和低溫10℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。兩組分別加入培養(yǎng)基 （90 μL培養(yǎng)基+10μL PrestoBlue試劑），于37℃下放置15 min，用FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)到560 nm激發(fā)光和590 nm散射光，獲得每孔的熒光強(qiáng)度值。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)平行，取其平均值，根據(jù)Zulkifli Mustafa相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［6］進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞類型X的活性=細(xì)胞類型X熒光值-培養(yǎng)基熒光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，利用One-Way ANOVA分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRPV1基因的序列分析

以試驗(yàn)魚腦組織總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1基因ORF全長(zhǎng)均為2310 bp，推定其均編碼769個(gè)氨基酸殘基 （圖1、圖2），預(yù)測(cè)其相應(yīng)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為88 210 和88 160，pH為7.0時(shí)的理論等電點(diǎn)分別為7.63 和8.03。

圖1　由獨(dú)角雪冰魚TRPV1基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Am ino acid sequence deduced by TRPV1 gene in icefish Chionodraco hamatusis

圖2　由伯氏肩孔南極魚TRPV1基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Am ino acid sequence deduced by TRPV1 gene in Trematomus bernacchii

2.2 TRPV1氨基酸序列的同源性分析

將獨(dú)角雪冰魚TRPV1氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析 （表2）。結(jié)果顯示：獨(dú)角雪冰魚TRPV1氨基酸序列與伯氏肩孔南極魚的一致性最高，為93.4％；與爬行類 （響尾蛇）的一致性最低，為44.3％；與兩棲類 （非洲爪蟾）的一致性為47.5％；與鳥類 （原雞）的一致性為47.1％；與其他哺乳類動(dòng)物的一致性為45.1％～45.6％。

表2　獨(dú)角雪冰魚與其他物種TRPV1氨基酸序列的同源性分析Tab.2 Identity of TRPV1 am ino acid sequence in icefish Chionodraco hamatusis com paried w ith other species

2.3 TRPV1基因的遺傳分析

獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1系統(tǒng)發(fā)育樹 （N-J樹）如圖3所示，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1氨基酸序列與其他魚類的氨基酸序列聚為一支，而哺乳類、兩棲類、爬行類和禽類也分別與氨基酸序列聚類。

圖3　獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的TRPV1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phy logenetic tree based on putative TRPV1 am ino acid sequences in Chionodraco hamatus，and Trematomus bernacchii

2.4 TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 TRPV1蛋白的理化性質(zhì) 經(jīng)DNAStar軟件分析顯示，獨(dú)角雪冰魚TRPV1蛋白含84個(gè)堿性氨基酸 （K、R），占所有氨基酸總數(shù)的10.9％；含83個(gè)酸性氨基酸 （D、E），占所有氨基酸總數(shù)的10.8％；含278個(gè)疏水氨基酸 （A、I、F、W、V），占所有氨基酸總數(shù)的36.2％；含201個(gè)極性氨基酸 （N、C、Q、S、T、Y），占所有氨基酸總數(shù)的26.1％。伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白含90個(gè)堿性氨基酸 （K、R），占所有氨基酸總數(shù)的11.7％；含86個(gè)酸性氨基酸 （D、E），占所有氨基酸總數(shù)的11.2％；含276個(gè)疏水氨基酸 （A、I、F、W、V），占所有氨基酸總數(shù)的35.9％；含199個(gè)極性氨基酸 （N、C、Q、S、T、Y），占所有氨基酸總數(shù)的25.9％。

2.4.2 TRPV1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用ProtParam程序推測(cè)獨(dú)角雪冰魚TRPV1蛋白中，α-螺旋 （alpha helix，h）占整個(gè)蛋白的40.83％；隨機(jī)卷曲 （random coil，c）占整個(gè)蛋白的43.82％；延伸鏈 （extendedstrand，e）占整個(gè)蛋白的15.34％。推測(cè)伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白中，α-螺旋 （h）占整個(gè)蛋白的44.08％；隨機(jī)卷曲 （c）占整個(gè)蛋白的41.09％；延伸鏈 （e）占整個(gè)蛋白的14.82％。通過PHYRE2程序推測(cè)兩種魚的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白均含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和錨蛋白結(jié)構(gòu)域 （圖4）。

2.4.3 TRPV1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和親疏水性 根據(jù)Smart和TMHM軟件分析顯示，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白并不確定是否含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，非洲爪蟾同樣也不確定是否含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，而其他高等脊椎動(dòng)物和斑馬魚的TRPV1蛋白確定含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域 （圖5）。從圖5還可以看出，所有物種的TRPV1蛋白均具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域 （后面的物種未在圖上標(biāo)出）和5～6個(gè)錨定蛋白結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域?yàn)門RPV1蛋白相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域。

利用Protscale推測(cè)蛋白的疏水性，結(jié)果表明，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白疏水性最大值均為4.500，最小值均為-4.500，其氨基酸序列內(nèi)親水和疏水性殘基都大量存在，推測(cè)兩種魚的TRPV1均為不溶性跨膜蛋白。

2.4.4 亞細(xì)胞定位 利用TargetP和SignalP預(yù)測(cè)獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚的TRPV1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種魚的TRPV1蛋白均沒有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白 （表3）。獨(dú)角雪冰魚TRPV1蛋白主要在細(xì)胞膜 （65.2％）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （30.4％）中發(fā)揮作用，少量在細(xì)胞支架（4.3％）中發(fā)揮作用；伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白主要在細(xì)胞膜 （69.6％）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （21.7％）中發(fā)揮作用，少量在細(xì)胞支架 （4.3％）和過氧化物酶體（4.3％）中發(fā)揮作用，從而推斷兩種魚TRPV1蛋白在細(xì)胞質(zhì)附著核糖體上合成，其中伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白功能與過氧化物酶體有關(guān)。

注：藍(lán)色區(qū)域表示跨膜結(jié)構(gòu)域；綠色區(qū)域表示錨定蛋白結(jié)構(gòu)域；pink粉紅色區(qū)域表示低復(fù)雜性區(qū)段；FDB表示FDB數(shù)據(jù)庫(kù)已有蛋白；BLAST代表已知結(jié)構(gòu)的同系物；Ion_trans代表離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域Note：Blue area shows transmembrane structure domain；green area represents the ANK structure domain；pink area shows low complexity region；FDB shows protein in the PDB database；BLAST shows homologues of known structure；Ion_trans represents translocation domain圖5　TRPV1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Conservative structure domain analyses of TRPV1 protein

表3　獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白亞細(xì)胞定位Tab.3 The sub-cellular localization of TRPV1 protein predicted by TargetP in icefish Chionodraco hamatus and Trematomus bernacchii

2.4.5 TRPV1蛋白的磷酸化與糖基化位點(diǎn) 經(jīng)NetPhos 2.0軟件分析表明：獨(dú)角雪冰魚TRPV1蛋白的磷酸化位點(diǎn)有21個(gè)絲氨酸、7個(gè)酪氨酸、6個(gè)蘇氨酸，可以成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)；伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白的磷酸化位點(diǎn)有21個(gè)絲氨酸、8個(gè)酪氨酸、6個(gè)蘇氨酸，可以成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)NetNGlyc 1.0軟件推測(cè)，獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白N端分別有6、5個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.5 真核細(xì)胞的低溫適應(yīng)結(jié)果

EGFP蛋白和目的蛋白在本載體中同時(shí)表達(dá)，再加上目前還暫時(shí)無檢測(cè)南極魚TRPV1蛋白表達(dá)的抗體，本試驗(yàn)中通過觀察EGFP熒光來驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。帶有3種魚TRPV1基因的質(zhì)粒在熒光顯微鏡下都觀察到大量的熒光，證明3種魚的TRPV1蛋白均已得到表達(dá) （圖6）。

圖6　轉(zhuǎn)染20 h后3種魚細(xì)胞的瞬時(shí)熒光表達(dá)情況Fig.6 Instantaneous fluorescence expression of cells in three fish species exposed to cell transfection for 24 h

顯著性檢驗(yàn)分析顯示：各種樣品的CHO細(xì)胞存活率在不同溫度之間均無顯著性差異 （P＞0.05）；轉(zhuǎn)染獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚和尼羅羅非魚TRPV1基因的CHO細(xì)胞，其存活率同野生型細(xì)胞 （對(duì)照WT）相比無顯著性差異 （P＞ 0.05），同時(shí) 3種魚之間也無顯著性差異 （P＞0.05）。可以推測(cè)，TRPV1基因可能并無低溫適應(yīng)的功能 （圖7）。

注：TB、CH、ON、TOL2、WT分別為伯氏肩孔南極魚、獨(dú)角雪冰魚、尼羅羅非魚、TOL2空白載體、CHO細(xì)胞野生型Note：Themeans of TB，CH，ON，TOL2，and WT are icefish Trematomus bernacchii，Chionodraco hamatus，and Nile tilapia Oreochromis niloticus，pure supporter of TOL2，and wild-type cell of CHO圖7　溫度對(duì)CHO細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effects of tem perature on the viability of CHO

3 討論

本研究中通過RT-PCR技術(shù)首次克隆了獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1基因，其開放閱讀框全長(zhǎng)均為2310 bp，推定均編碼769個(gè)氨基酸殘基。同源性分析表明，獨(dú)角雪冰魚TRPV1氨基酸序列與伯氏肩孔南極魚的一致性最高（93.4％），與其他魚類的一致性次之（54.2％ ～69.8％），同其他高等脊椎動(dòng)物的一致性較低 （44.3％ ～47.1％）?；赥RPV1氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化分析也顯示，魚類TRPV1聚為一支，而兩棲類、爬行類、禽類和哺乳類也分別與相應(yīng)TRPV1氨基酸序列聚類。由此可見，TRPV1基因在動(dòng)物由低等到高等的進(jìn)化過程中發(fā)生了較大的適應(yīng)性進(jìn)化。

對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白均無信號(hào)肽，有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，為不溶性跨膜蛋白。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明：獨(dú)角雪冰魚 TRPV1蛋白主要在細(xì)胞膜（65.2％）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （30.4％）中發(fā)揮作用，少量在細(xì)胞支架 （4.3％）中發(fā)揮作用；伯氏肩孔南極魚TRPV1主要在細(xì)胞膜 （69.6％）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（21.7％）中發(fā)揮作用，少量在細(xì)胞支架 （4.3％）和過氧化物酶體 （4.3％）中發(fā)揮作用。由此推斷，兩種魚TRPV1蛋白均在細(xì)胞質(zhì)附著核糖體上合成，且伯氏肩孔南極魚TRPV1功能還與過氧化物酶體有關(guān)。這表明，南極魚類的TRPV1同其他高等脊椎動(dòng)物的TRPV1相同，也是一種通道蛋白。

研究顯示，TRPV1通道蛋白可被cAMP依賴的蛋白激酶磷酸化，從而導(dǎo)致該蛋白失活，同時(shí)，TRPV1蛋白也可以和蛋白激酶C相結(jié)合，以此來完成細(xì)胞內(nèi)外一系列信號(hào)傳遞過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各項(xiàng)功能［20］。對(duì)蛋白磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1氨基酸序列分別含有34和35個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)可能是TRPV1和蛋白激酶結(jié)合的位點(diǎn)。同時(shí)獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白N端分別有6、5個(gè)糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)可使TRPV1形成糖蛋白，在細(xì)胞膜上發(fā)揮其感知外界信號(hào)調(diào)控離子通透性的功能。蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析表明，獨(dú)角雪冰魚和伯氏肩孔南極魚TRPV1蛋白并不確定含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，除非洲爪蟾外，其他高等脊椎動(dòng)物和斑馬魚確定含有離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，推測(cè)離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可能在魚類環(huán)境適應(yīng)進(jìn)化過程中發(fā)生了比較大的變化，離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的變化可能會(huì)導(dǎo)致TRPV1通道蛋白功能發(fā)生相應(yīng)的變化。但結(jié)構(gòu)分析同時(shí)還顯示，所有物種的TRPV1蛋白都有6個(gè)跨膜螺旋，具備6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，還有5～6個(gè)錨定蛋白結(jié)構(gòu)域，這兩種結(jié)構(gòu)域?yàn)門RPV1蛋白相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域。

研究表明，小鼠的TRPV1基因具有高溫的感應(yīng)功能，當(dāng)溫度大于43℃時(shí)可被激活［3］。本研究中進(jìn)行的低溫耐受性試驗(yàn)表明，獨(dú)角雪冰魚、伯氏肩孔南極魚和尼羅羅非魚TRPV1基因都不具有低溫適應(yīng)的功能，且南極魚類TRPV1蛋白又缺少離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，而對(duì)一個(gè)離子通道蛋白而言，離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域無疑是最重要的一個(gè)結(jié)構(gòu)域。由此推測(cè)，離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的缺失是南極魚類TRPV1蛋白不具有溫度感應(yīng)功能的重要因素。

本試驗(yàn)中僅僅從細(xì)胞水平上做了初步的探索，最終結(jié)論還需要從蛋白水平等領(lǐng)域進(jìn)一步驗(yàn)證；同時(shí)TRPV1基因作為一種重要的多覺感受器，還可被多種激活因子激活，因此，南極魚類的TRPV1基因到底在南極魚類低溫適應(yīng)中發(fā)揮何種作用，還需要做大量的工作來進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Venkatachalam K，Montell C.TRP channels［J］.Annual Review of Biochemistry，2007，76：387-417.

［2］ 馬悅穎，李滄海，霍海如，等.瞬時(shí)感受器電位V亞家族離子通道——溫度感受器［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2007，4（1）：174-177.

［3］ Gavva N R，Treanor J JS，Garami A，et al.Pharmacological blockade of the vanilloid receptor TRPV1 elicitsmarked hyperthermia in humans［J］.Pain，2008，136（1-2）：202-210.

［4］ 鄧可宣，和七一，鄒家麗，等.瞬時(shí)受體電位通道蛋白TRPA1的研究進(jìn)展［J］.重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，30 （1）：33-37.

［5］ Huang Choulong.The transient receptor potential superfamily of ion channels［J］.Journal of the American Society of Nephrology，2004，15（7）：1690-1699.

［6］ Gau P，Poon J，Ufret-Vincenty C，et al.The zebrafish ortholog of TRPV1 is required for heat-induced locomotion［J］.The Journalof Neuroscience，2013，33（12）：5249-5260.

［7］ Golech S A，McCarrion R M，Chen Ye，et al.Human brain endothelium：coexpression and function of vanilloid and endocannabinoid receptors［J］.Molecular Brain Research，2004，132（1）：87-92.

［8］ Wang L，Wang D H.TRPV1 gene knockout impairs postischemic recovery in isolated perfused heart in mice［J］.Circulation，2005，112（23）：3617-3623.

［9］ 隋峰，霍海如，姜廷良，等.TRPV1通道蛋白介導(dǎo)的生理病理機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，5（1）：55-58，64.

［10］ 李魁君，李春剛，劉興君.辣椒素受體（TRPV1）的生物學(xué)作用及其作為藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（11）：917-927.

［11］ 于新宇，柳青.瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2012，33（2）：282-284.

［12］ Joke B，Bert V.Methanandamide hyperpolarizes gastric arteries by stimulation of TRPV1 receptors on perivascular CGRP containing nerves［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2006，47 （2）：303-309.

［13］ Clapham D E.SnapShot：mammalian TRP channels［J］.Cell，2007，129（1）：220.

［14］ Montell C.Physiology，phylogeny，and functions of the TRP superfamily of cation channels［J］.Science's STKE，2001，1：90-93.

［15］ Tyagi N，Srinivasan N.Recognition of nontrivial remote homology relationships involving proteins of Helicobacter pylori：implications for function recognition［M］//Kortagere S.In Silico Models for Drug Discovery.Humana：Humana Press，2013，933：155-175.

［16］ M?ller S，Croning M D R，Apweiler R.Evaluation ofmethods for the prediction ofmembrane spanning regions［J］.Bioinformatics，2001，17（7）：646-653.

［17］ 張寶，黃克勇，郭勁松，等.H7N9病毒的來源和重組模式［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（7）：1017-1021.

［18］ Bhave G，Zhu Weiguo，Wang Haibin，etal.cAMP-dependentprotein kinase regulates desensitization of the capsaicin receptor （VR1）by direct phosphorylation［J］.Neuron，2002，35（4）：721-731.

［19］ Tominaga M，Caterina M J，Malmberg A B，et al.The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli［J］. Neuron，1998，21（3）：531-543.

［20］ Wilkins M R，Gasteiger E，Bairoch A，et al.Protein identification and analysis tools in the ExPASy Server［M］//Link A J.2-D Proteome Analysis Protocols.Humana：Humana Press，1999，112：531-552.

Cloning and cold adaptation verification of TRPV1 genes from icefish Chionodraco hamatus and Trematomus bernacchii

WANG Gui-zhi1，ZHANG Yong1，ZHANG Chi1，XU Qiang-hua1，2，3，4，5
（1.College of Marine Sciences，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；2.Key Laboratory of Sustainable Exploitation ofOceanic Fisheries Resources，Ministry of Education，Shanghai201306，China；3.Scientific Observing and Experimental Station ofOceanic Fishery Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai 201306，China；4.National Engineering Research Center for Oceanic Fisheries，Shanghai 201306，China；5.Collaborative Innovation Center for Distant-water Fisheries，Shanghai201306，China）

Abstract：Transient receptor potential channels V1（TRPV1）gene sequence was cloned in icefish Chionodraco hamatus and Trematomus bernacchii using RT-PCR technology to investigatemolecularmechanism of the two Antarctic fish species to cold adaptation.The bioinformatics analysis indicated that the TRPV1s contained the 2310 bp open reading frame encoding 769 amino acids in length，with relativemolecularweightof88 210 and the theoretical isoelectric point of 7.63 in C.hamatus and relative molecular weight of 88 160 and theoretical isoelectric point of 8.26 in T.bernacchii.Sub-cellular localization revealed that TRPV1 proteins as insoluble transmembrane protein without signal peptide played primrily a role in plasmamembrane and endoplasmic reticulum.Physical and chemical properties showed that there were 34 phosphorylation sites and 6 glycosylation sites in in TRPV1 in C.hamatus and 35 phosphorylation sites，and 5 glycosylation sites in TRPV1 in T.bernacchii，with 6 transmembrane domains and 5 ANK domains.The TRPV1 had secondary structure of random coil.Nucleotide sequence analysis revealed that C.hamatusis TRPV1 had sequence similarity of44.3％-69.8％with TRPV1 in other vertebrates，themaximal similarity（93.4％）with the T.bernacchii TRPV1.Cold adaptation experiments showed that the TRPV1 of both ice fishes was not activated by temperature changes，indicating that the Antarctic fish TRPV1 isnot involved in cold adaptation.

Key words：Chionodraco hamatus；Trematomus bernacchii；TRPV1 gene；cold adaptation

中圖分類號(hào)：R363

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.002

文章編號(hào)：2095-1388（2016）02-0124-07

收稿日期：2015-06-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （31572598）；上海市教育發(fā)展基金會(huì)與上海市教育委員會(huì) “曙光計(jì)劃”（13SG51）；教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （213013A）；上海市教委水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：王桂志 （1989—），男，碩士研究生。E-mail：wangguizhihi@163.com

通信作者：許強(qiáng)華 （1974—），女，博士，教授。E-mail：qhxu@shou.edu.cn