實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

王洪，魏杰，于鵬麗，鞏薇*，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

王洪，魏杰，于鵬麗，鞏薇*，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 通過實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃，了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰?，提高?shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗(yàn)證方案，通過樣品制備，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)合格，作為能力驗(yàn)證樣品。采用隨機(jī)編號(hào)，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時(shí)限提交檢驗(yàn)報(bào)告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 共有10個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目，其中滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室8個(gè)，占總參加機(jī)構(gòu)的80%，不滿意的實(shí)驗(yàn)室有2個(gè)，占20%。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)在實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1的檢測(cè)能力較高，實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃能夠反映實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。

【關(guān)鍵詞】能力驗(yàn)證；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；蘋果酸酶-1；異檸檬酸脫氫酶-1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制是保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可靠程度的根本手段，全國已經(jīng)通過國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)技術(shù)審查的實(shí)驗(yàn)室有20多家。各省市級(jí)藥檢院也配備有相應(yīng)的進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的實(shí)驗(yàn)室。為了增加實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流，提高檢測(cè)水平，按照實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)可的有關(guān)要求，中國食品藥品檢定研究院-國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量（遺傳、微生物）檢測(cè)中心，組織實(shí)施本次能力驗(yàn)證活動(dòng)：NIFDC-PT038“實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測(cè)”。

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證計(jì)劃是通過實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)來衡量實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室證明其檢測(cè)技術(shù)能力水平的一種手段。能力驗(yàn)證是國際通行的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法，已成為世界各國政府以及國際實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可組織廣泛采用的重要技術(shù)手段。生化標(biāo)記檢測(cè)法是近交系實(shí)驗(yàn)小鼠遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方法，國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14927.1-2008中要求進(jìn)行14個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)的測(cè)定，其中小鼠腎勻漿中的蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1，這兩個(gè)位點(diǎn)要求的檢測(cè)技術(shù)具有一定的難度。

本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的目的是要了解參加實(shí)驗(yàn)室在本檢測(cè)項(xiàng)目的技術(shù)水平和能力，分析考察實(shí)驗(yàn)室間差異，從而掌握實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，為加強(qiáng)質(zhì)量管理體系建設(shè)提供數(shù)據(jù)支持。更重要的是發(fā)現(xiàn)并解決檢驗(yàn)中存在的問題，促進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)質(zhì)量管理，完善程序，提高檢測(cè)水平［1］。

1　材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8周齡雄性小鼠C57BL/6和BABL/c各10只來源于中國食品藥品檢定研究院【SCXK（京）2014-0013】。SPF級(jí)8周齡CBA雄性小鼠10只，來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（滬）2012-0002】。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 檢測(cè)樣品

本次比對(duì)試驗(yàn)提供的被測(cè)樣品為小鼠腎勻漿凍干樣品。制備方法：按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，處死動(dòng)物，剖腹，取小鼠腎臟2只，加入蒸餾水，蒸餾水與臟器的比例為2∶1（V/W）。勻漿后，放置到4℃低溫高速離心機(jī)中，15 000 r/min，30 min。取上清，加一定體積的保護(hù)劑，分裝，每瓶裝量100 mg，用凍干機(jī)凍干。小鼠腎勻漿凍干樣品為紅色固體。加蓋，封口膜封口，封口袋包裝。采用隨機(jī)數(shù)字方式編號(hào)（表1）。貯藏條件為密封，冷藏。每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室分配3瓶樣品，通過冷鏈運(yùn)輸方式運(yùn)輸。樣品已經(jīng)經(jīng)過均勻性和穩(wěn)定性檢查，滿足質(zhì)量控制的要求［2-4］。

表1　能力驗(yàn)證樣品隨機(jī)分組編號(hào)Tab.1 Random numbers of the samples

1.3 參加實(shí)驗(yàn)室

本次能力驗(yàn)證活動(dòng)面向全國藥檢系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心以及相關(guān)企業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室共計(jì)10個(gè)，10家實(shí)驗(yàn)室全部提交有效結(jié)果。10家實(shí)驗(yàn)室主要是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心、疾控中心、高校和企業(yè)內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室。10家實(shí)驗(yàn)室主要分布于北京、上海、廣東、湖南，、湖北，、遼寧、吉林、陜西和新疆等地。

1.4 比對(duì)項(xiàng)目

本次試驗(yàn)要求進(jìn)行小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1a基因型和蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1b基因型。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

本次能力驗(yàn)證活動(dòng)沒有要求統(tǒng)一的檢測(cè)方法，以各實(shí)驗(yàn)室上報(bào)的檢測(cè)結(jié)果作為依據(jù)。為保證檢測(cè)結(jié)果具有可比性，所提供的樣品無需加工處理，可直接開封，加入70 μL蒸餾水溶解后取樣測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果為定性的結(jié)果，報(bào)告基因型a型或者b型。測(cè)定完成后將結(jié)果報(bào)告單與原始記錄一并提交。

1.6 評(píng)價(jià)方法［5］

本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的結(jié)果是定性的結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14927.1-2008，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致時(shí)，判定為滿意結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致時(shí)，判定為不滿意結(jié)果。如圖1所示。

圖1　蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1均一性檢驗(yàn)Note.1.Sample 1；2.Sample 2；3.Sample 3；4.Sample 4；5.Standard 1；6.Standard 2；7.Standard 3；8.Sample 5；9.Sample 6；10.Sample 7.Fig.1 Results of the homogeneity test of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1

2　結(jié)果

小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1能力驗(yàn)證結(jié)果：

對(duì)于海外品牌而言，阿里巴巴集團(tuán)并非進(jìn)入中國唯一的“快通道”。此次進(jìn)博會(huì)期間，蘇寧海外采購的訂單額預(yù)計(jì)150億歐元（約合人民幣1185億元），5000個(gè)海外品牌由此進(jìn)駐中國。600多個(gè)海外品牌借力唯品會(huì)進(jìn)入中國市場，采購訂單額達(dá)100億元人民幣。談及進(jìn)博會(huì)，網(wǎng)易考拉CEO張蕾認(rèn)為，中國跨境電商市場正在迎來“黃金窗口期”。這次盛會(huì)上，網(wǎng)易考拉與110家海外企業(yè)達(dá)成品牌合作意向，累積達(dá)成200億元人民幣的采購協(xié)議。

本次比對(duì)樣品共發(fā)放給10家報(bào)名實(shí)驗(yàn)室，提交有效結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室共10個(gè)，獲滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室8家，占參加單位的80%；不滿意結(jié)果有2家，占參加單位的20%。見表2。

3　討論

從各實(shí)驗(yàn)室反饋的原始記錄中統(tǒng)計(jì)，本次能力驗(yàn)證活動(dòng)各實(shí)驗(yàn)室均采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14927.1-2008推薦的生化標(biāo)記檢測(cè)法。

表2　能力驗(yàn)證蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1結(jié)果統(tǒng)計(jì)一覽表Tab.2 Results of testing for malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1

3.1 能力驗(yàn)證的重要性

作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室保持有效的檢測(cè)能力，同時(shí)幫助部分實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進(jìn)。我們?cè)?013年實(shí)施相關(guān)的能力驗(yàn)證計(jì)劃時(shí)，發(fā)現(xiàn)有1家實(shí)驗(yàn)室不具備相應(yīng)的檢測(cè)能力。同一家實(shí)驗(yàn)室，在2015年的能力驗(yàn)證活動(dòng)中依然反饋了不滿意結(jié)果。說明該實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量體系存在一定問題，有必要通過持續(xù)地參加相應(yīng)的能力驗(yàn)證活動(dòng)來促進(jìn)該檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理，便于促進(jìn)檢測(cè)水平的提高。

3.2 不滿意結(jié)果的原因分析

不滿意結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室有2家：代碼為905的實(shí)驗(yàn)室將樣品CBG0080010的異檸檬酸脫氫酶-1判斷為A型，而標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果是B型。代碼為301的實(shí)驗(yàn)室將樣品CBG0060007的異檸檬酸脫氫酶-1判斷為B型，而標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果是A型。這兩家實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，判定為不滿意結(jié)果。代碼為905的實(shí)驗(yàn)室提供的原始結(jié)果圖，條帶可見，但沒有圖注釋，無法進(jìn)一步分析不滿意結(jié)果的原因。代碼為301的實(shí)驗(yàn)室提供的原始結(jié)果圖，無法看到條帶，也不能進(jìn)一步分析不滿意結(jié)果的原因。

3.3 沒有進(jìn)行的操作不應(yīng)該出現(xiàn)在原始記錄中

本次能力驗(yàn)證發(fā)放的是凍干樣品，不需要進(jìn)行樣本采集、離心、勻漿等操作步驟，因此這些沒有進(jìn)行的操作不應(yīng)該出現(xiàn)在原始記錄中。有2家實(shí)驗(yàn)室沒有按照實(shí)際情況進(jìn)行原始記錄。

3.4 原始記錄的復(fù)核人以及審核人有漏簽的情況發(fā)生。

3.5 原始記錄中的醋纖膜電泳圖應(yīng)拍照,利于長期保存

醋酸纖維素膜顯色會(huì)隨著時(shí)間逐漸變淡直至完全褪去，雖然可以體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原始性，但不利于結(jié)果的長期保存，建議拍照存檔。

3.6 圖題和圖注應(yīng)詳細(xì)標(biāo)注

內(nèi)容詳盡的圖題和圖注有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，尤其是對(duì)不滿意結(jié)果的原因分析。這次參加能力驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室沒有圖題和圖注，無法對(duì)結(jié)果作分析判斷。

3.7 多數(shù)實(shí)驗(yàn)室能夠提供清晰內(nèi)容詳盡的原始記錄電泳圖（如圖2所示）

3.8 組織對(duì)實(shí)驗(yàn)室的培訓(xùn)宣貫

一次能力驗(yàn)證的結(jié)果只能證明實(shí)驗(yàn)室參加的本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的情況，不能說明實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，只有持續(xù)參加同一項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng)，其總體結(jié)果才能反映實(shí)驗(yàn)室的能力狀況［6-10］。CNASRL01：2011《實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可規(guī)則》、CNAS-RL02：2010《能力驗(yàn)證規(guī)則》規(guī)定申請(qǐng)認(rèn)可和獲準(zhǔn)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室必須通過參加能力驗(yàn)證活動(dòng)（包括CNAS組織實(shí)施或承認(rèn)的能力驗(yàn)證計(jì)劃、測(cè)量審核）證明其技術(shù)能力。只有在能力驗(yàn)證活動(dòng)中表現(xiàn)滿意，或?qū)τ诓粷M意結(jié)果能證明已開展了有效糾正措施的實(shí)驗(yàn)室，CNAS方受理認(rèn)可申請(qǐng)或予以認(rèn)可。當(dāng)不滿意結(jié)果已不能符合專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范時(shí)，除實(shí)施糾正措施并驗(yàn)證其有效性外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)自行暫停在相應(yīng)項(xiàng)目的證書/報(bào)告中使用CNAS認(rèn)可標(biāo)識(shí)。在驗(yàn)證糾正措施有效后，實(shí)驗(yàn)室可自行恢復(fù)使用認(rèn)可標(biāo)識(shí)。對(duì)不能滿足能力驗(yàn)證領(lǐng)域和頻次要求，或雖參加了能力驗(yàn)證但結(jié)果不滿意且未在180天（能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告發(fā)布之日起計(jì)）內(nèi)開展糾正措施及其驗(yàn)證活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室，CNAS可撤銷其相應(yīng)項(xiàng)目的認(rèn)可資格。對(duì)參加了CNAS組織及其承認(rèn)的能力驗(yàn)證活動(dòng)且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)室，在CNAS的各類評(píng)審中可考慮適當(dāng)簡化相關(guān)項(xiàng)目的能力確認(rèn)過程。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存上述記錄以備評(píng)審組檢查［11，12］。

通過實(shí)施本次實(shí)驗(yàn)小鼠腎勻漿中蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃，我們發(fā)現(xiàn)，全國藥檢系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心以及相關(guān)企業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具備蘋果酸酶-1和異檸檬酸脫氫酶-1檢測(cè)能力，個(gè)別實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平需要提高，對(duì)個(gè)別檢測(cè)能力有待提高的實(shí)驗(yàn)室建議加強(qiáng)質(zhì)量管理體系的建設(shè)，盡快提高檢測(cè)能力。每次能力驗(yàn)證計(jì)劃完成后，CNAS都及時(shí)公布參加能力驗(yàn)證計(jì)劃的合格實(shí)驗(yàn)室名單，為各級(jí)政府管理部門利用實(shí)驗(yàn)室資源提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域的社會(huì)委托檢驗(yàn)和政府部門布置監(jiān)督抽查任務(wù)提供了可靠的選擇依據(jù)，對(duì)促進(jìn)我國的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作起到了積極的推動(dòng)作用。

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Laboratory proficiency evaluation of the detection ability of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 in mouse kidneys

WANG Hong，WEI Jie，YU Peng-li，GONG Wei*，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To investigate the detection capacity of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 （Mod1&Idh1）in the laboratory animal monitoring laboratories in China in order to understand the detection capacity of laboratories and to improve the detection level of laboratory animals'quality.Methods Based on the program approved by CNAS，samples preparing，homogeneity test and stability test of malic enzyme 1 and isocitrate dehydrogenase 1 in the mouse kidneys were carried out.Standard operation procedure and samples with random numbers were distributed to the laboratories.The laboratories should submit the result reports before the time limit expires.If the laboratory reports were the same with the standard results，the laboratories will receive satisfactory remark.If laboratory reports were not the same with the standard results，the laboratories will receive unsatisfactory remark.If a laboratory did not submit report，the laboratory will also receive unsatisfactory result.Results Eight laboratories out of 10（80%）enrolled laboratories reported satisfactory experiment results，and two laboratories（20%）presented unsatisfactory results.Conclusions The whole detection level of laboratories in Mod1&Idh1 is relatively high in the laboratory animals monitoring laboratories in China.It can reflect the detection level of laboratories to conduct the laboratory capacity evaluation.

【Key words】Capacity evaluation；Laboratory animal；Malic enzyme 1；Isocitrate dehydrogenase 1

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0199-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.017

［基金項(xiàng)目］實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原分子生物學(xué)快速檢測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用（編號(hào)：2015BAI07B02）。

［作者簡介］王洪（1977-），女，副研究員。研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。E-mail：littstar@163.com。

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，E-mail：y6784@126.com。鞏薇（1973-），女，副研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理。E-mail：hou20121221@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com.GONG Wei，Email：hou20121221@126.com

［收稿日期］2016-01-13