河南太行山區(qū)野生山葡萄表皮酵母菌的分離與鑒定

張俊杰，楊　旭，張文葉，劉崇懷（.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州45000；.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

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河南太行山區(qū)野生山葡萄表皮酵母菌的分離與鑒定

張俊杰1，楊旭1，張文葉1，劉崇懷2
（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009）

摘要：為了獲取更多的野生酵母優(yōu)質(zhì)菌種資源，本研究采用傳統(tǒng)的微生物分離手段，從河南輝縣太行山區(qū)的野生葡萄表皮共分離純化得到6株酵母菌（W1—W6）。首先采用形態(tài)學觀察方法對其進行初步分類，然后采用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析，對6株酵母菌進行分子生物學鑒定。形態(tài)學初步鑒定結果表明，6株酵母菌呈現(xiàn)出菌落形態(tài)、細胞顯微形態(tài)、子囊孢子形態(tài)和液體生長特征的多樣性，并初步歸為5個形態(tài)學群；而26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結果表明，6株供試菌分別屬于酵母菌4個屬的5個種：Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）。該結果與形態(tài)學鑒定結果一致，共同確定了對6株酵母菌菌株的鑒定結果。該結果也豐富了對野生山葡萄蘊含酵母菌資源的認識。

關鍵詞：微生物；野生山葡萄；酵母菌；26S rDNAD1/D2；分離鑒定

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1335.002.html。

我國葡萄種植分布廣泛，由于不同產(chǎn)區(qū)的生態(tài)條件差異較大，葡萄品種較多，其所含酵母菌種類也有較大差異［1］。葡萄酒釀造是一個復雜的微生物代謝過程，其中酵母菌是最重要的微生物菌群［2］。酵母作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒質(zhì)量和發(fā)酵過程影響很大，而且對葡萄酒色澤、香氣、感官質(zhì)量及風格的形成有重要貢獻。用不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其酒質(zhì)和風味差別很大。所以尋找能夠適應當?shù)仄咸言咸匦裕⑶矣欣谛纬傻赜蚱咸丫骑L格的新土著酵母菌株及新酵母種已成為研究的焦點［3］。酵母菌是葡萄酒釀造的關鍵因素之一，其遺傳多樣性分析和分類鑒定是選育優(yōu)良釀酒酵母菌種的重要基礎［4-5］。但并非所有酵母菌都能夠起到有益的作用，在一些野生的葡萄中還可能含有亟待開發(fā)的優(yōu)質(zhì)釀酒酵母種群。因此，鑒定腐敗葡萄中酵母菌的種類，有助于抑制葡萄中敗壞性酵母的負面影響［1］，而鑒定野生葡萄中的酵母菌種群，則有利于發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母，為我國葡萄酒釀造積累更多的酵母菌種資源。

葡萄酒相關酵母迄今為止已發(fā)現(xiàn)有20多個屬的百余種，幾乎遍及酵母的主要屬種［3］。受到環(huán)境因素的影響，某些酵母菌屬、種在形態(tài)學及生理生化特性方面的差異并不顯著，采用傳統(tǒng)方法對其進行準確分類就顯得相當困難［6］。隨著DNA序列分析技術的日趨成熟和簡化，rRNA基因（rDNA）序列分析已經(jīng)被廣泛應用于酵母菌的鑒定。大亞基rRNA基因（26S rDNA）中的D1/D2區(qū)域，能將絕大部分子囊菌酵母和擔子菌酵母的種屬區(qū)分開來，而種內(nèi)不同菌株間D1/D2區(qū)域序列差異一般在1%以內(nèi)，堿基差異在1%以上則可能代表著不同的種，由此對酵母進行鑒定分類［7］。

本實驗以河南輝縣太行山區(qū)野生山葡萄為原料，采用形態(tài)學和26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析相結合的方法，對從葡萄表皮分離得到的6株酵母菌進行了表型及分子鑒定，為葡萄表皮酵母菌的檢測和鑒定提供參考，也為選育優(yōu)良的野生葡萄優(yōu)質(zhì)酵母菌種資源提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

采自河南省輝縣太行山區(qū)的野生山葡萄。

1.1.2主要藥品和試劑

葡萄糖、酵母粉、瓊脂、孔雀綠、番紅、碘液、蛋白胨、Taq酶、dNTP、1kb DNA Ladder、酵母基因組提取試劑盒等。

26S rDNA引物：NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCGGAG GAA AAG- 3'）和NL- 4（5'- GGT CCG TGT TTCAAGACG G-3'）。

1.1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

麥氏培養(yǎng)基：葡萄糖1 g、KCl 1.8 g、酵母膏2.5 g、醋酸鈉8.2 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

WL培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氫鉀0.055 g、氯化鉀0.425 g、氯化鈣0.125 g、硫酸鎂0.125 g、氯化鐵0.0025 g、硫酸錳0.0025 g、溴甲酚綠2.2 g、瓊脂20 g，pH6.5。

1.1.4主要設備與儀器

立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、恒溫水浴鍋、電泳儀、搖床等。

1.2實驗方法

1.2.1酵母菌的分離純化

首先將完整無破損的葡萄粒放入盛有無菌水的三角瓶中，然后在搖床上振蕩0.5 h，超凈工作臺內(nèi)吸取三角瓶內(nèi)的振蕩液并做10倍梯度稀釋到10-2，在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培養(yǎng)基上涂布，最后在28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。然后隨機挑取不同形態(tài)的菌落在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培養(yǎng)基平板上劃線純化培養(yǎng)3～5 d，然后隨機挑選單菌落在光學顯微鏡下確認其純度，并從形態(tài)學角度初步判斷其是否具有酵母菌的細胞顯微特征，對于陽性的菌體首先劃線保存于YEPD固體斜面，備用。

1.2.2酵母菌的菌落形態(tài)觀察

將分離純化的菌種在YEPD平板上劃線并在28℃下活化培養(yǎng)1～2 d，將活化的菌株接種于WL培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)5 d后觀察記錄菌落顏色和形態(tài)，按菌落不同形態(tài)特征對菌株進行初步分類。

1.2.3酵母菌細胞顯微形態(tài)觀察

取在WL營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上的菌落制成菌懸液，取干凈滅菌的載玻片，在中央滴上1滴菌懸液，蓋上蓋玻片，在酒精燈上方微微加熱，干燥固定；然后在蓋玻片的一側(cè)滴加碘液，在另一側(cè)用濾紙吸去多余的水，碘液會順著水流方向浸入蓋玻片下，直到將多余的碘液吸完，制片完成，置于普通光學顯微鏡下觀察酵母菌細胞的顯微形態(tài)。

同時，將活化的菌種接種于麥氏培養(yǎng)基，28℃下培養(yǎng)2～3 d后，進行染色觀察菌體細胞的顯微形態(tài)及是否有子囊孢子產(chǎn)生。將在麥氏培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)后的菌種制成菌懸液涂片，并干燥固定；在涂片上滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，染色1～2 min后用95%vol乙醇沖洗，再立即用水沖去染液；之后用0.5%番紅水溶液復染0.5～1 min，水洗干燥；將干燥后的涂片用油鏡觀察，分辨菌體及孢子，其中孢子為綠色，菌體和孢子囊為紅色。

1.2.4酵母菌液體培養(yǎng)特征觀察

挑取活化好的菌體接種到裝有40 mLYEPD液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)3 d，觀察并記錄底部有無沉淀，是否產(chǎn)生菌璞，是否沿試管壁向上生長。室溫下繼續(xù)培養(yǎng)4周后再次觀察并記錄特征。

1.2.5酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列的PCR擴增、檢測及序列測定

酵母菌的DNA提取按照試劑盒說明書進行提取。用引物NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3'）和NL-4（5'-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3'）對菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s；循環(huán)36次；再72℃延伸8 min，-20℃保存。PCR反應采用50 μL反應體系：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0 μL；25 mM MgCl223.0 μL；10 mM dNTP 1.0 μL；10 μM NL1和NL4各1 μL；0.5 U/μL DNA聚合酶3 μL；模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容到50 μL。

取2 μL PCR擴增產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混勻后點樣到1%的瓊脂糖凝膠（已加入Goldview I型核酸染液），然后在100 V電壓下，1×TAE電泳緩沖液中電泳30 min，最后在紫外分析儀上檢測并初步判斷擴增片段的質(zhì)量和大小。擴增合格的PCR產(chǎn)物送測定。

1.2.6序列的分子系統(tǒng)學分析

測序結果采用DNAman軟件進行序列校正，校正后的26S rDNA基因D1/D2區(qū)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索比對（BLAST）。獲得同源酵母菌株的D1/ D2區(qū)序列后，用MEGA6軟件的ClustalW功能對所有供試序列進行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，該分析進行1000次的Bootstraps檢驗。

1.2.7菌種的保藏

菌種的保藏采用甘油冷凍法。首先，將經(jīng)過純化和形態(tài)及分子生物學鑒定的酵母菌菌株從斜面接種到YEPD固體平板活化，然后挑取單菌落接種至YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌液與50%的無菌甘油以1∶1（體積比）混合于2 mL無菌甘油凍存管中，最后置于-80℃超低溫冰箱中保藏。

2結果與分析

2.1酵母菌的分離純化及形態(tài)學初步鑒定

本實驗以太行山區(qū)野生葡萄為材料，經(jīng)過對葡萄表皮酵母菌株的分離純化，并在WL培養(yǎng)基上通過表型比較，共得到6株代表菌株，分別編號為W1、W2、W3、W4、W5和W6；通過WL培養(yǎng)基和麥氏培養(yǎng)基對其一系列形態(tài)特征的觀察與描述結果，見圖1和表1。

從圖1可知，6株供試菌株呈現(xiàn)出5種不同的菌落形態(tài)，其中W4和W6菌落形態(tài)一致，可以推測2株菌可能屬于同一個酵母菌種群；其余4株菌呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)，區(qū)別明顯。

從表1可知，對于液體培養(yǎng)特征，W1、W4、W5和W6在液體培養(yǎng)中都形成膜璞，但是W1和W6形成的膜璞較弱，而W4和W5則形成較強的膜璞；W2和W3則沒有膜璞的產(chǎn)生。對于菌株的細胞形態(tài)特征，有圓形、圓形橢圓、橢圓棒狀和檸檬形4種；而就麥氏培養(yǎng)基上產(chǎn)子囊孢子的觀察結果，6株菌都可以產(chǎn)生子囊孢子，但是W1—W3子囊孢子產(chǎn)量較少，而W4—W6則產(chǎn)生較多的子囊孢子。通過以上結果，可以初步把6株酵母菌歸為5個不同的種群，其中W4和W6屬于同一個種群。

圖1　　代表性酵母菌株在WL培養(yǎng)基上菌落特征（左）及顯微形態(tài)（右）

表1　代表性酵母菌株的形態(tài)特征

2.2 26S rDNAD1/D2區(qū)系統(tǒng)發(fā)育分析結果

對6株代表性酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域進行測序，所得的序列通過BLAST搜索比對得出與它們關系最近的參比酵母菌株的相關序列及常見酵母菌的相關序列，通過Mega 6進行序列比對并構建NJ樹，見圖2。由圖2可知，分離得到的6株酵母菌分別與來自4個不同酵母菌屬的已知菌株聚群。其中W1與Hanseniaspora（漢遜酵母屬）的菌株聚為一群，并且與菌株Hanseniaspora uvarum JJZ3（NCBI登錄號：JQ678681）相似性為100%，由此可以判定W1屬于種群Hanseniaspora uvarum；W2 和W3都與來自Metschnikowia（梅奇酵母屬）的菌株聚為一種群，但是W2與菌株Metschnikowia pulcherrima D77 2（HM627131）聚為一個分支，相似性為99.7%，而W3則與菌株Metschnikowia fructicola（KP171590）聚為一個分支，相似性為99.5%，由此判定W2和W3分別屬于已知酵母種群Metschnikowia pulcherrima和Metschnikowia fructicola；W4和W6共同與Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）的菌株Debaryomyces hansenii YE-10（JQ771740）和Debaryomyces hansenii CCFEE 5619（JX124721）聚為同一種群，相似性為100%，由此斷定W4和W6屬于已知種群Debaryomyces hansenii；W5則與Pichia（畢赤酵母屬）的菌株聚為同一種群，其中與Pichia fermentans YS118 （AM882677）聚為一個分支，相似性為100%，由此判定W5屬于已知種群Pichia fermentans。所以，供試的6個代表菌株分別歸屬于已知的4個不同的酵母菌屬和5個不同的酵母菌種群。

3討論與展望

對于酵母菌菌種的鑒定已經(jīng)從傳統(tǒng)的宏觀和微觀形態(tài)學及生理學鑒定發(fā)展到今天的分子生物學鑒定方法，這正是得益于分子生物學的飛速發(fā)展。本實驗從河南輝縣太行山區(qū)野生山葡萄表皮分離得到了6株酵母菌，通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，最終確定6株酵母菌分屬于Hanseniaspora、Metschnikowia、Debaryomyces和Pichia 4個酵母菌已知屬，并且分別歸屬于Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）5個已知酵母菌種群。通過與表1中的菌落形態(tài)描述比較發(fā)現(xiàn)，盡管W4和W6屬于同一個種群，但是在液體培養(yǎng)基中的特征存在一定的差異，可以推測兩者屬于兩個不同的菌株；W2和W3屬于同一個屬的兩個不同種群，所以其形態(tài)特征也有比較顯著的差異；同時，通過縱向比較發(fā)現(xiàn)，來自5個不同種群的菌株，它們在形態(tài)特征上也存在著明顯的差異，所以，只有把傳統(tǒng)的鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學鑒定方法相結合，才可以更加全面有效和準確的對未知酵母菌菌株進行分類鑒定。

圖2　　基于26S rDNAD1/D2區(qū)序列的NJ發(fā)育樹分析結果

酵母菌分類學方法向著簡便、快捷、高效和合理的方向發(fā)展，隨著大量酵母菌26S rDNAD1/D2區(qū)序列在Genbank等核酸數(shù)據(jù)庫的公開，26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析技術目前已經(jīng)廣泛用于酵母菌菌株的鑒定［8-9］。王潔等［1］利用形態(tài)、生理生化特征和26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析方法對4株腐敗葡萄中的酵母菌進行了鑒定，確定4株酵母菌屬于釀酒酵母屬的種群Saccharomyces cerevisiae；王慧等［10］利用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析并結合傳統(tǒng)形態(tài)分析方法對陜甘寧和新疆及山東等地的葡萄果粒中的酵母菌菌株進行了鑒定，最終共鑒定得到13個屬26個種群，其中最占優(yōu)勢的4個屬分別為Hanseniaspora、Candida、Pichia和Issatchenkia；郭冬琴等［11］利用形態(tài)學及26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法對腐敗橙汁中分離的酵母菌進行了鑒定，最終確定得到的8株菌分別屬于4個已知的酵母菌種群。范佳等［12］對葡萄酒發(fā)酵液中的酵母進行菌落形態(tài)、細胞顯微形態(tài)及26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析方法，最終鑒定得到5種分子類型的酵母菌，分別為膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）、誕沫假絲酵母菌（Candida zeylanoides）、發(fā)酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和有孢圓酵母菌（Torulaspora delbrueckii）。

本實驗結合傳統(tǒng)和現(xiàn)代分子生物學2種鑒定方法，最終對分離自河南輝縣太行山區(qū)域的野生葡萄表皮酵母菌進行鑒定，為收集、鑒定和保藏野生優(yōu)質(zhì)酵母菌資源奠定了基礎，也為今后的研究提供了科學的參考和依據(jù)。

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中圖分類號：TS262.6；TS261.1；Q93-3；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0057-04

基金項目：鄭州輕工業(yè)學院博士科研基金資助（2014bsjj006）；國家自然科學基金青年基金資助（31400008）。

收稿日期：2016-01-15

作者簡介：張俊杰（1984-），男，博士，鄭州輕工業(yè)學院特聘教授、碩士生導師，E-mail：kirka640@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2016096

Isolation and Identification of Yeast Strains from Wild Grapes from Taihang Mountain in He'nan

ZHANG Junjie1，YANG Xu1，ZHANG Wenye1and LIU Chonghuai1
（1.School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，He'nan 450002；2. Zhengzhou Fruit Tree Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，He'nan 450009，China）

Abstract：In order to obtain more quality wild yeast strains，six yeast strains（W1—W6）were isolated from the skin of wild grapes from Taihang Mountain in Henan by traditional microbial isolation method. Firstly，the six strains were primarily identified through morphology tests，then 26S rDNA D1/D2 sequences of the strains were analyzed and the phylogenetic tree was reconstructed for molecular identification. According to the morphology test，the six strains presented diversities in colony，microscopic and ascosporic morphologies，and growth characteristics in liquid medium，and they were primarily classified into five morphologic groups. 26S rDNA D1/D2 sequences analysis results indicated that the six yeast strains were distributed into four genus and five species：Hanseniaspora uvarum（W1），Metschnikowia pulcherrima（W2），Metschnikowia fructicola（W3），Debaryomyces hansenii（W4 and W6）and Pichia fermentans（W5）. And the analytic results were identical to morphological results.

Key words：microbe；wild grape；yeast；26S rDNAD1/D2；isolation and identification