煉油廢水中好氧反硝化菌的篩選及降解特性

武文麗，顏家保，陳佩，霍曉瓊，吳優(yōu)，胡茜茜（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

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研究開發(fā)

煉油廢水中好氧反硝化菌的篩選及降解特性

武文麗，顏家保，陳佩，霍曉瓊，吳優(yōu)，胡茜茜
（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

摘要：為了提高煉油廢水生物處理裝置的反硝化性能，從武漢石化污水處理廠的活性污泥中篩選出一株好氧反硝化菌AD10，經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析，將其鑒定為假單胞菌屬。通過單因素實驗研究了該菌的最適培養(yǎng)條件：以丁二酸鈉為碳源，C/N=14，溫度30℃，初始pH=6.0，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。在此條件下，ρ（NO3--N）= 556.81mg/L時72h的去除率為97.2%，且耐受的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度達到654.00mg/L。菌株AD10培養(yǎng)11.5 h，對ρ（NO3--N）=140.31mg/L和ρ（TN）=141.62mg/L的去除率分別為95.8%和93.9%，其反硝化速率高于大部分已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌，檢測到的ρ（NO2--N）≤2.30mg/L，未出現(xiàn)明顯的積累，菌株AD10能夠進行完全反硝化。

關(guān)鍵詞：煉油廢水；假單胞桿菌；好氧反硝化；硝酸鹽氮；總氮

第一作者：武文麗（1990—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：顏家保，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail 121135637@qq.com。

傳統(tǒng)生物脫氮是由好氧硝化作用和厭氧反硝化作用共同完成的，這兩個過程需在不同的反應(yīng)器中分開進行，工藝耗時且運行費用高、操控復(fù)雜、能耗大［1］。近年來，國內(nèi)外的研究表明，反硝化也可以在有氧條件下進行，1983年ROBERTSON等［2］首次分離出了好氧反硝化菌，目前具有好氧反硝化功能的菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、紅球菌屬（Rhodococcus）等［3-6］。好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)，使得硝化作用和反硝化作用能在同一反應(yīng)器內(nèi)進行，克服了傳統(tǒng)工藝成本高、效率低的問題［7］，在好氧條件下進行同時硝化反硝化是目前廢水生物處理中的研究熱點，也是生物脫氮中的重點研究方向。

本實驗從煉油廢水活性污泥中分離鑒定出 1株好氧反硝化菌AD10，對菌株生長及其反硝化性能的影響因素如碳源種類、C/N、溫度、pH值等進行了考察，同時考察了其對硝酸鹽氮的耐受性，并研究了反硝化過程中亞硝酸鹽氮和總氮的變化規(guī)律，以期為其應(yīng)用于煉油廢水生物脫氮提供理論支持。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

活性污泥:采自中國石化武漢石油化工廠煉油廢水生化處理裝置。

LB培養(yǎng)基（g/L）:酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，自然pH值。

好氧反硝化培養(yǎng)基（g/L）:Na2HPO4·12H2O 7.9，KH2PO41.5，KNO31.0，MgSO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，微量元素溶液2mL，pH=7.0。微量元素儲備液，見文獻［8］。

1.2 實驗方法

1.2.1 好氧反硝化菌株的篩選

將活性污泥接入LB培養(yǎng)基中活化，后轉(zhuǎn)接至好氧反硝化培養(yǎng)基中進行馴化，過程中ρ （NO3--N）從100～600mg/L梯度增加，馴化3～4次。通過稀釋涂平板及平板劃線法得到若干株好氧反硝化菌；對各菌株進行反硝化性能測試，將性能最好的1株作后續(xù)研究。

1.2.2 好氧反硝化菌株的鑒定

菌株的初步鑒定依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］進行；基因組DNA的提取及PCR產(chǎn)物純化/回收均通過試劑盒完成，試劑盒由北京鼎國生物技術(shù)有限公司提供；16S rDNA測序工作委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司進行。

1.2.3 菌株的生長及反硝化性能

按φ（A）=3%的接種量，將活化至對數(shù)期的種子液接入好氧反硝化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始ρ（NO3--N）≈140mg/L，在一定培養(yǎng)條件下，分別考察碳源種類、C/N、培養(yǎng)溫度、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速等對菌體生長及反硝化性能的影響；在優(yōu)化條件下，考察了菌株對硝酸鹽氮的耐受性，并研究了菌株在反硝化過程中亞硝酸鹽氮和總氮的變化規(guī)律。

1.3 分析方法

NO3--N測定采用酚二磺酸法［10］；NO2--N測定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法［10］；總氮測定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法［10］；菌體濃度（OD600）采用比濁法［11］測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)富集馴化、分離純化，共得到19株好氧反硝化菌，將性能最好的1株命名為AD10。圖1為AD10菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖片，從圖1可以看出，菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，有熒光綠色素產(chǎn)生，革蘭氏染色呈陰性。生理生化試驗結(jié)果表明:吲哚試驗、V-P試驗呈陰性，而淀粉水解試驗、甲基紅試驗、糖酵解試驗呈陽性。

圖1 AD10菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖片

2.2.1 16S rDNA鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)16S rDNA測序分析后，獲得長為1419 bp的堿基序列，將其輸入到GenBank中進行Blast比對，表1為部分與AD10同源性較高的菌株?？梢钥闯觯cAD10同源性達99%以上的菌株均為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），結(jié)合其形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，將菌株AD10鑒定為假單胞菌屬。

表1中的各菌株分別為硝基苯降解菌、喹啉降解菌、吡嘧磺隆降解菌、產(chǎn)硫酸酯酶菌、鄰苯二酚降解菌、尼古丁降解菌等，雖與AD10有很高的同源性，但它們并不具有好氧反硝化性能。

表1 菌株AD10 16S rDNA序列比對結(jié)果

2.2 AD10生長及培養(yǎng)條件的選擇

2.2.1 碳源的選擇

將活化后的種子液接入5種不同碳源的好氧反硝化培養(yǎng)基中，在30℃、200r/min條件下，碳源種類對菌株生長及反硝化性能的影響見圖 2。由圖 2可知，菌株生長越快，硝酸鹽氮降解效果越好；以丁二酸鈉為碳源時效果最佳（11h的脫氮率為88.2%），檸檬酸鈉次之，蔗糖效果最差。反硝化速率受碳源種類的影響很大，丁二酸鈉分子結(jié)構(gòu)簡單，可直接以酸的形式被反硝化菌利用，而糖類必須被分解為有機酸才能被吸收，這與李慧穎［12］、周云云［13］等的研究結(jié)果類似。因此，在后續(xù)實驗中，培養(yǎng)基碳源選丁二酸鈉。

2.2.2 C/N的選擇

王薇［14］等的研究表明，C/N是影響好氧反硝化菌反硝化作用的主要因素。以丁二酸鈉為碳源的好氧反硝化培養(yǎng)基中，初始ρ（NO3—-N）≈140mg/L，在30℃、200r/min條件下，圖3為C/N對菌體生長及反硝化速率的影響。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，C/N越高，菌體生長和反硝化速率越快；C/N為12 和 14時，二者的生長曲線和降解曲線幾乎各自重合，培養(yǎng)11h的脫氮率分別為90.5%和91.4%，此時C/N不再是反硝化的限制因素，繼續(xù)增大C/N已無明顯作用。因此，在后續(xù)實驗中，培養(yǎng)基C/N選為14。

2.2.3 溫度的選擇

圖2 碳源種類對菌體生長及ρ（NO3--N）的影響

圖3 C/N對菌體生長及ρ （NO3--N）的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對菌體生長及ρ（NO3--N）的影響

溫度主要影響微生物體內(nèi)酶的活性，從而影響其生長代謝的速率。將活化后的種子液接入C/N=14的好氧反硝化培養(yǎng)基中，在200r/min條件下，溫度對菌株生長及反硝化速率的影響見圖4。由圖4可以看出，溫度過高或過低都不利于菌株的生長及代謝；當溫度為30℃時，菌株生長及反硝化效果最好，經(jīng) 10.5h的培養(yǎng)，菌株 AD10對質(zhì)量濃度為144.58mg/L的硝酸鹽氮的降解率為92.2%，因此，將菌株AD10的培養(yǎng)溫度選為30℃。

2.2.4 初始pH值的選擇

圖5為30℃、200r/min條件下，培養(yǎng)基初始pH值對菌株生長及反硝化速率的影響。由圖5可知，菌株AD10在弱酸及中性環(huán)境中活性較高，這與反硝化過程產(chǎn)堿有關(guān)；培養(yǎng)基pH值為6.0和7.0時，菌株培養(yǎng)10.5h，硝酸鹽氮的降解率分別為93.8%和91.2%，而堿性環(huán)境（pH≥9.0）對菌株生長及硝酸鹽氮的降解均有抑制。在后續(xù)實驗中，培養(yǎng)基 pH值調(diào)至6.0。

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速的選擇

劉歡等［1］研究認為，好氧反硝化菌體內(nèi)的周質(zhì)硝酸鹽還原酶在有氧條件下可將硝酸鹽還原，而培養(yǎng)液中溶氧濃度的大小與搖床轉(zhuǎn)速密切相關(guān)。圖 6 為30℃、培養(yǎng)基pH值為6.0時，不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株生長及反硝化速率的影響。由圖6可知，在一定轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，菌株的反硝化速率隨轉(zhuǎn)速的增大而增大，在200r/min時達到最大；經(jīng)10.5h的培養(yǎng)，菌株AD10對ρ（NO3--N）=138.02mg/L的降解率達96.0%，這表明好氧反硝化酶與有氧呼吸系統(tǒng)同時存在于AD10體內(nèi)，且較高溶氧濃度更有利于反硝化作用的進行。

2.2.6 菌株對硝酸鹽氮的耐受性

將菌株AD10接種于C/N=14、pH=6.0的好氧反硝化培養(yǎng)基中，在優(yōu)化條件下，不同 ρ（NO3--N）對反硝化速率的影響見圖7。從圖7可以看出，培養(yǎng)基中硝酸鹽氮濃度越低，越容易降解；當ρ（NO3--N）≤557mg/L時，菌株反硝化作用均較徹底，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)，脫氮率可達95%～98%；高濃度的硝酸鹽氮會抑制菌株的反硝化作用，ρ（NO3--N）=654mg/L時，72h的降解率為65.1%，表明菌株AD10至少可耐受質(zhì)量濃度為654 mg/L的硝酸鹽氮。

2.2.7 優(yōu)化條件下菌株的好氧反硝化作用

圖5 pH值對菌體生長及ρ （NO3--N）的影響

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對菌體生長及ρ （NO3--N）的影響搖床轉(zhuǎn)速

圖7 菌株對硝酸鹽氮的耐受性

將菌株AD10活化后接種于 C/N=14、pH=6.0的好氧反硝化培養(yǎng)基中，在優(yōu)化條件下，菌株的好氧反硝化作用見圖8。由圖8可以看出，菌株能有效去除培養(yǎng)液中的總氮及硝酸鹽氮，且二者的降解曲線趨勢同步，菌株經(jīng) 11.5h的培養(yǎng)，對初始ρ（NO3--N）=140.31mg/L和初始 ρ（TN）=141.62mg/L的去除率分別為95.8%和93.9%。周影茹等［15］分離出的RWX31對初始NO3--N濃度為140mg/L時24h的去除率為82%，王慧榮等［16］分離出的菌株CW培養(yǎng)24h對ρ（NO3--N）=108mg/L的去除率為75%，高喜燕等［17］分離出的菌株2-8培養(yǎng)48h對ρ（NO3--N）=140mg/L的降解率為92%；而本研究篩選得到的AD10其反硝化速率均高于它們。

圖8 菌株AD10的反硝化性能研究

在該茵的反硝化過程中，檢測到的 ρ（NO3--N）≤2.30mg/L，并未出現(xiàn)明顯的積累，原因可能是反硝化作用產(chǎn)生的NO2--N在亞硝酸還原酶的作用下直接被還原為含氮氣態(tài)產(chǎn)物，這表明菌株AD10能夠進行完全反硝化。

3 結(jié) 論

（1）從武漢石化污水處理廠的活性污泥中篩選出一株好氧反硝化菌 AD10，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。

（2）該菌最適培養(yǎng)基條件為:以丁二酸鈉為碳源，C/N=14，初始 pH=6.0。最適培養(yǎng)條件為:溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。

（3）在優(yōu)化條件下，ρ（NO3--N）=556.81mg/L時，72h的去除率為97.2%，且能耐受的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為654mg/L。

（4）菌株 AD10培養(yǎng) 11.5h，對ρ（NO3--N）= 140.31mg/L和ρ（TN）=141.62 mg/L的去除率分別為95.8%和93.9%，反硝化速率高于大部分已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌；且檢測到的ρ（NO3--N）≤2.30mg/L，并未出現(xiàn)明顯的積累，表明菌株AD10能夠進行完全反硝化。

參 考 文 獻

［1］ 劉歡，駱靈喜，李旭寧，等.膜生物反應(yīng)器好氧反硝化菌的篩選及鑒定［J］.環(huán)境污染與防治，2015，37（4）:26-29.

［2］ ROBERTSON L A，VANNEIL E W J，TORREMANS R A M，et al. Simultaneous nitrification and denitrification in aerobic chemostat cultures of Thiosphaera pantotroph［J］. Appl. Environ. Mcrobiol.，1983，54（11）:2812-2818.

［3］ 王弘宇，馬放，蘇俊峰，等.好氧反硝化菌株的鑒定及其反硝化特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2007，28（7）:1548-1552.

［4］ 李兵，林煒鐵.1株好氧反硝化芽孢桿菌的脫氮特性研究［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2（3）:48-51.

［5］ 楊冠東，鐘瑜，石笛，等.制革廢水中好氧反硝化菌的篩選及其特性［J］.化工環(huán)保，2013，33（5）:402-405.

［6］ 張亞光，方柏山，閔航，等.一株好氧反硝化菌的特征及系統(tǒng)進化分析［J］.華僑大學(xué)學(xué)報，2004，25（1）:75-78.

［7］ 喬楠，陳瑞佳，于大禹.硅藻土負載異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的脫氮性能［J］.化工進展，2015，34（5）:1459-1465.

［8］ TUO Baohua，YAN Jiabao，F(xiàn)AN Baoan，et al. Biodegradation characteristics and bioaugmentation potential of a novel quinoline-degrading strain of Bacillus sp. isolated from petroleum-contaminated soil［J］. Bioresour Technol.，2012，107: 55-60.

［9］ 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:180-181.

［10］ 原國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法［M］.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2000:279-281.

［11］ 林海.環(huán)境工程微生物學(xué)［M］.北京:冶金工業(yè)出版社，2008:73-74.

［12］ 李慧穎，黃少斌，范利榮.一株好氧反硝化菌的反硝化性能研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009，32（8）:9-12.

［13］ 周云云，黃少斌.好氧反硝化菌TADl的同步硝化反硝化性能［J］.環(huán)境工程學(xué)報，2013，7（6）:2160-2166.

［14］ 王薇，蔡祖聰，鐘文輝，等.好氧反硝化菌的研究進展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2007，18（11）:2618-2625.

［15］ 周影茹，陸玉芳，施衛(wèi)明.一株根際好氧反硝化菌的篩選及其反硝化條件研究［J］.土壤，2013，45（4）:683-690.

［16］ 王慧榮，韋彥斐，梅榮武，等.一株好氧反硝化菌的分離及特性研究［J］.環(huán)境保護科學(xué)，2012，38（4）:13-18.

［17］ 高喜燕，劉鷹，鄭海燕，等.一株海洋好氧反硝化菌的鑒定及好氧反硝化特性［J］.微生物學(xué)報，2010，50（9）:1164-1171.

Screening of an aerobic denitrifier from refinery wastewater and its characteristics

WU Wenli，YAN Jiabao，CHEN Pei，HUO Xiaoqiong，WU You，HU Qianqian
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China）

Abstract:In order to improve the denitrification efficiency of the bioreactor of refinery wastewater treatment plant，an aerobic denitrifier AD10 was isolated from the activated sludge of a petrochemical wastewater treatment plant in wuhan city. It was identified as a member of the genus Pseudomonas sp. according to its morphyological and physiological properties and 16S rDNA gene sequence analysis. Through the single factor experiment investigations，the optimum denitrification conditions were: sodium succinate as carbon source，C/N 14，temperature 30℃，initial pH 6.0，rotation speed 200 r/min. Under these conditions，the nitrate remove efficiency of AD10 was 97.2% when it was cultivated in 556.81 mg/L nitrate for 72h，and it could tolerate at least 654 mg/L of nitrate nitrogen. Culturing after 11.5h，AD10 show the NO3--N and TN removal rate of 95.8% and 93.9%，when the concentration of NO3--N and TN were 140.31mg/L and 141.62mg/L，respectively. AD10's denitrification rate is higher than most of the aerobic denitrifying bacteria have been found. During this process，only a very small amount of NO2--N （≤2.30mg/L） was detected，indicating a complete denitrification.

Key words:refinery wastewater；Pseudomonas sp.；aerobic denitrification；nitrate nitrogen；total nitrogen

中圖分類號：X 172

文獻標志碼：A

文章編號：1000-6613（2016）05-1524-05

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.05.039

收稿日期：2015-9-17；修改稿日期：2015-10-29。

基金項目：武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點項目（JCX0006）及武漢科技大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310488009）。