針刺完骨穴對血管性癡呆大鼠海馬炎性細胞因子的影響

房雅楠，隋汝波，張　磊

(錦州醫(yī)科大學：1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州　121001；2. 護理學院，遼寧錦州　121000)

?

◇中醫(yī)藥研究◇

針刺完骨穴對血管性癡呆大鼠海馬炎性細胞因子的影響

房雅楠1，隋汝波1，張磊2

(錦州醫(yī)科大學：1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州121001；2. 護理學院，遼寧錦州121000)

摘要：目的探討針刺完骨穴(GB 12)對血管性癡呆大鼠海馬炎性細胞因子的影響，為針刺治療血管性癡呆提供理論依據(jù)。方法選用健康SD大鼠(n=54，300～450 g)，隨機分為假手術(shù)組、血管性癡呆組、針刺組，進行行為學評分并測定海馬炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表達，HE染色觀察海馬組織變化。結(jié)果與血管性癡呆組相比，針刺組大鼠學習能力顯著提升且炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表達下降；同時，海馬神經(jīng)細胞損傷程度下降，其形態(tài)學恢復到接近正常。結(jié)論電針完骨穴可以降低海馬炎性細胞因子水平，降低神經(jīng)細胞損傷程度，為血管性癡呆提供了新的神經(jīng)保護機制。

關鍵詞：血管性癡呆(VD)；海馬；細胞因子；針刺；完骨穴；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；白細胞介素-6(IL-6)；白細胞介素-1β(IL-1β)

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是卒中后常見并發(fā)癥，發(fā)生率高達20%～33%[1]。卒中1年后VD損傷的發(fā)生率達70%。伴有VD的卒中患者生活質(zhì)量嚴重下降并且有著極高的致死率。目前，雖然對于VD治療的研究方法很多，但是其發(fā)生機制仍尚未闡明[2]。神經(jīng)生物化學研究、細胞和分子機制研究都報道了VD患者學習記憶受損與海馬區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、凋亡關系密切[3-5]，研究人員提出了神經(jīng)解剖學的假說。此外，異常的細胞因子對神經(jīng)細胞的損害在卒中后認知障礙中占有重要作用[6-8]。BATTI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可能影響大鼠海馬在突觸傳遞過程中氧的恢復。 ZULIANI等[10]進一步研究發(fā)現(xiàn)，VD患者細胞因子水平的顯著增加，證明了細胞因子和VD的嚴重程度之間有著很強相關性。還有許多方法已被用于治療，但很少有藥物有效。本實驗建立VD大鼠模型，探討針刺完骨穴(GB 12)對VD大鼠海馬細胞因子的影響，為針刺治療VD提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物選用成年雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量300～450 g。給予大鼠自由飲水和進食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活動時間。

1.2大腦中動脈結(jié)扎模型(MCAO)的制作及成功評分大鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上。頸部正中切開后，鈍性分離周圍組織，暴露左頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)和迷走神經(jīng)。用微動脈夾暫時夾閉CCA。距CCA分叉處近心端0.5 cm處將CCA剪一小口，插入肝素化的燒頭尼龍線從CCA沿著ICA推進，使進入ICA的尼龍線從CCA分叉處到MCA大約18 mm左右，有效地阻斷了MCA血流，結(jié)扎CCA并固定尼龍線。模型評價為：0分即無神經(jīng)損傷癥狀；1分即不能完全伸展對側(cè)前爪；2分即向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分即向?qū)?cè)傾倒；4分即不能自發(fā)行走，意識喪失；5分即死亡。

1.3分組及針刺穴位刺激干預54只雄性大鼠按隨機區(qū)組法分為假手術(shù)組、血管性癡呆組(VD組)、針刺組，每組18只。VD組僅行MCAO手術(shù)；假手術(shù)組則將進入ICA的尼龍線從CCA分叉處到大腦中動脈(MCA)大約10 mm左右時，結(jié)扎CCA并固定尼龍線(不能抵達MCA，即不能有效阻斷MCA血流)；電針組行MCAO手術(shù)并應用電子針灸針(蘇州華佗醫(yī)療電針儀SDZ-Ⅱ)進行電針刺激。完骨穴的定位根據(jù)文獻[11]描述(解剖位置：耳后的后下和乳突區(qū)，深度：0.3～0.5 cm)。參數(shù)如下：方波30 Hz，密波100 Hz，強度6～15 V。肢體輕微震動表明針刺成功. 每次刺激20 min，1次/d，持續(xù)4月。

1.4Morris水迷宮進行定位航行試驗[12]白色圓形水池直徑為120 cm，高60 cm，平臺高40 cm，平臺直徑10 cm。水池等分4個象限，任一象限放置平臺。水深42 cm，加入奶粉使水顯乳白色。各組大鼠每天上午、下午各訓練1次，連續(xù)2周。90 s仍未找到平臺者，則將其放置于平臺上站立10 s，第2周至第4周每間隔1 d后，上午將大鼠從平臺正對的象限入水，測定每只大鼠學習能力，觀察指標為：觀察90 s內(nèi)找到平臺的時間(上臺潛伏期)。

1.5Real-time PCR檢測腦組織炎性細胞因子mRNA表達在進行2月、4月的電針刺激后，處死并分離大鼠腦組織(根據(jù)大鼠腦圖譜)，留取部分海馬組織(備作HE染色)后，Trizol提取大鼠海馬組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行Real-time PCR檢測。PCR擴增反應條件：IL-1β和TNF-α循環(huán)參數(shù)為95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，95 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸20 s的循環(huán)共40次；IL-6循環(huán)參數(shù)為95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，進行95 ℃變性10 s→64 ℃退火30 s→72 ℃延伸25 s的循環(huán)共40次。

1.6HE染色觀察海馬CA1區(qū)形態(tài)學變化在立體定向儀上留取海馬CA1區(qū)并制作腦組織石蠟切片，進行HE染色，光學顯微鏡下(×400)觀察。

2結(jié)果

2.1大鼠定位航行實驗結(jié)果VD組平均逃避潛伏期為(37.01±7.69)s，與假手術(shù)組的(12.89±4.73)s相比，明顯延長(P<0.05)，說明VD組SD大鼠出現(xiàn)了學習記憶功能受損。而針刺組大鼠平均逃避潛伏期為(28.19±7.18)s，較VD組明顯縮短(P<0.05)，但與假手術(shù)組相比仍有延長(P<0.05)。

2.2電針對神經(jīng)細胞形態(tài)學變化的影響實驗進行4月后的海馬HE染色顯示，正常的神經(jīng)細胞相對較圓而且邊界清晰；受損的神經(jīng)細胞腫脹而且不對稱，或核聚集、深染。所有受損的神經(jīng)細胞都呈三角形；VD組神經(jīng)細胞受損最明顯，細胞腫脹而且不對稱，呈三角形；電針組細胞水腫較輕，神經(jīng)細胞形態(tài)接近正常，數(shù)量增加(圖1)。

2.3TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達情況將提取出的大鼠海馬組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行Real-time PCR檢測，通過PCR對TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達進行測定。結(jié)果顯示，VD組的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達比假手術(shù)組高，且差異有統(tǒng)計學意義(第2月P<0.01，第4月P<0.01)，針刺組各炎性因子的mRNA表達比VD組低(第2月P<0.05，第4月P<0.01，圖2)。

圖1各組海馬CA1區(qū)域中神經(jīng)細胞的變化

Fig.1 Changes in nerve cells in the hippocampal CA1 region in each group (HE, ×400)

A：假手術(shù)組，箭頭所示為正常的神經(jīng)細胞；B：VD組，箭頭所示為受損的神經(jīng)細胞；C：針刺組，箭頭所示為損壞的神經(jīng)細胞。

圖2各組大鼠第2月和第4月海馬組織中TNF-α、IL-6 、IL-1β mRNA的表達情況

Fig.2 The mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β in the hippocampal tissues at months 2 and 4, respectively

與假手術(shù)組第2月相比，△P<0.01；與假手術(shù)組第4月相比，#P<0.01；與VD組第2月相比，*P<0.05；與VD組第4月相比，□P<0.01。

3討論

隨著社會的老齡化，VD已成為日益嚴重的社會問題。迄今為止已有很多關于VD的理論，但其發(fā)病機制仍不清，重要的研究有神經(jīng)解剖學假說和異常的細胞因子對神經(jīng)細胞的損害作用[6-8]。最近的研究表明，VD組不僅炎性細胞因子增加而且受損的神經(jīng)細胞也增加。另有研究表明，適當電治療可以通過神經(jīng)調(diào)節(jié)增加缺血腦組織的血流量而保護腦組織[13]。因此，本研究檢測了VD大鼠及針刺完骨穴治療時，其學習記憶能力的變化及炎性細胞因子在海馬組織的表達。結(jié)果表明，針刺完骨穴顯著降低了VD大鼠逃避潛伏期，提示針刺完骨穴可以改善VD大鼠學習能力，為臨床治療VD提供一定的實驗依據(jù)。

本研究進一步檢測海馬炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表達變化并觀察VD大鼠海馬神經(jīng)細胞的病理學變化。結(jié)果表明，針刺組大鼠學習能力較VD組顯著提升，且炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表達下降。同時，海馬神經(jīng)細胞損傷程度下降，其形態(tài)學恢復到接近正常。國外NI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小腦頂核損害加速胸腺細胞分化為成熟的T輔助淋巴細胞，并能提高外圍免疫組織的T輔助淋巴細胞的功能，提示免疫系統(tǒng)由小腦頂核大幅調(diào)節(jié)。有研究也有類似結(jié)果，電刺激小腦頂核不僅抑制星形膠質(zhì)細胞的過度增殖，而且可減輕伴有缺血缺氧腦損傷新生大鼠的星形細胞結(jié)構(gòu)損害[15]。因此，本研究針刺完骨穴時，觀察到可穩(wěn)定細胞因子，降低海馬損傷，增進學習記憶能力，其可能與針刺小腦頂核(完骨穴位)使免疫系統(tǒng)抑制，防止炎性細胞因子過度產(chǎn)生有關。這可能為探索VD的發(fā)病機制和選擇治療目標提供了新的途徑。但是，觀察炎性細胞因子變化的時間相對較短，也沒有觀察細胞因子對于海馬長期的影響。這尚需進一步實驗研究。

參考文獻：

[1] 汪洋. 血管性癡呆的常見臨床類型及其危險因素分析[D]. 大連醫(yī)科大學, 2013.

[2] ROCHER MN, CARRE D, SPINNEWYN B, et al. Long-term treatment with standardized Ginkgo biloba extract (EGb 761) attenuates cognitive deficits and hippocampal neuron loss in a gerbil model of vascular dementia[J]. Fitoterapia, 2011, 82(7):1075-1080.

[3] WANG F, GENG X, TAO HY, et al. The restoration after repetitive transcranial magnetic stimulation treatment on cognitive ability of vascular dementia rats and its impacts on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area[J]. J Mol Neurosci, 2010, 41(1):145-155.

[4] 槐雅萍. 左旋丁苯酞對血管性癡呆小鼠認知功能的影響及對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的作用[D]. 河北醫(yī)科大學, 2013.

[5] 楊申. P38MAPK抑制劑對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡、Bcl-2、Caspase-3表達及其學習記憶能力的影響[D]. 山東大學, 2013.

[6] ROSENBERG GA. Inflammation and white matter damage in vascular cognitive impairment[J]. Stroke, 2009, 40:20-23.

[7] TROLLOR JN, SMITH E, BAUNE BT, et al. Systemic inflammation is associated with MCI and its subtypes, the Sydney Memory and Aging Study[J]. Dement Geriatr Cogn Disord, 2010, 130:569-578.

[8] ANGELOPOULOS P,AGOURIDAKI H,VAIOPOULOS H, et al. Cytokines in Alzheimer's disease and vascular dementia[J]. Int J Neurosci, 2008, 118:1659-1672.

[9] BATTI L, O'CONNOR JJ. Tumor necrosis factor-alpha impairs the recovery of synaptic transmission from hypoxia in rat hippocampal slices[J]. J Neuroimmunol, 2010, 218:21-27.

[10] ZULIANI G, RANGING M, GUERRA G, et al. Plasma cytokines profile in older subjects with late onset Alzheimer’s disease or vascular dementia[J]. J Psychiatr Res, 2007, 41:686-693.

[11] 解越，劉泓，周煒，等. 多種針法聯(lián)合治療卒中恢復期吞咽困難療效觀察[J]. 中國中醫(yī)西結(jié)合雜志, 2011, 31(6):736-740.

[12] 方松，余化霖. Morris水迷宮實驗中海馬相關空間學習記憶的研究進展[J]. 國際病理科學與臨床雜志, 2010, 30(4):321-326.

[13] ZHOU F, GUO JC, CHENG JS, et al. Electure increased cerebral blood flow and reduced ischemic brain injury, Dependence on stimulation intensity and frequency[J]. J Appl Physiol, 2011, 111:1177-1187.

[14] NI SJ, QIU YH, LU JH, et al. Effect of cerebellar fastigial nuclear lesions on differentiation and function of thymocytes[J]. J Neuroimmunol, 2010, 222:40-47.

[15] 顧海燕，趙德育，王全. 維生素D缺乏對子代大鼠肺形態(tài)結(jié)構(gòu)及血小板源性生長因子-A表達的影響[J]. 中國當代兒科雜志, 2011, 13(4):326-330.

(編輯國榮)

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-09

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81241050；No.81371461)

通訊作者：張磊. E-mail: 264437699@qq.com；隋汝波. E-mail: suirubo521@aliyun.com

中圖分類號：R741

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604024

Electroacupuncture at the Wangu acupoint suppresses expression of inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia

FANG Ya-nan1, SUI Ru-bo1, ZHANG Lei2

(1. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001; 2. Department of Nursing, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo examine whether electroacupuncture at the Wangu acupoint (GB 12), whose position is similar to the cerebellar fastigial nucleus, can reduce inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia (VD) to provide theoretical evidence for treating VD with electroacupuncture. MethodsHealthy Sprague-Dawley rats (n=54, 300-450 g) were randomly divided into three groups: sham surgery group, VD group, and electroacupuncture group. The ethologic scores of VD rats were evaluated and the mRNA expressions of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) in the hippocampus were assessed and the hippocampal tissues were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. ResultsCompared with VD group, in electroacupuncture group the rats’ learning ability improved significantly and the mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β decreased. Simultaneously, the damage extent of nerve cells in the hippocampal tissues decreased, and their morphology recovered to nearly normal. ConclusionElectroacupuncture at the Wangu acupoint can decrease the level of inflammatory cytokines in the hippocampus and reduce the damage extent of nerve cells in the hippocampus, thus providing a new neuroprotective method for VD.

KEY WORDS:vascular dementia (VD); hippocampus; cytokine; electroacupuncture; Wangu acupoint; TNF-α; IL-6; IL-1β

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81241050 and 81371461)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160412.1722.002.html(2016-04-12)