Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義

張　宏，王　文，田　甜，趙茜茜，馬興聰，閆婉君，高曉燕，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安　710004)

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◇臨床研究◇

Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義

張宏，王文，田甜，趙茜茜，馬興聰，閆婉君，高曉燕，張淑群

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，陜西西安710004)

摘要：目的研究Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義。方法應(yīng)用免疫組化SP法測(cè)定24例三陰性乳腺癌、58例非三陰性乳腺癌及20例乳腺良性疾病組織中Ezrin的表達(dá)，比較各組Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率的差異，分析其與三陰性乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果Ezrin在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及乳腺良性疾病組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.00%、48.28%、15.00%，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。三陰性乳腺癌中Ezrin高表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和臨床TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤大小及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論Ezrin在三陰性乳腺癌中高表達(dá)，提示其可以作為三陰性乳腺癌預(yù)后不良的一個(gè)重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：Ezrin；三陰性乳腺癌；免疫組化

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)均為陰性的乳腺癌，約占全部乳腺癌的15%～20%，具有發(fā)病年齡早、侵襲性強(qiáng)、無(wú)病生存率低、病理惡性程度高、早期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移、內(nèi)分泌治療及Her-2分子靶向治療無(wú)效等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者的身心健康，現(xiàn)已成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1-2]。Ezrin是ERM(ezrin-radixin-moesin)蛋白家族成員之一，是一種細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜的連接蛋白，幾乎存在于任何細(xì)胞之中。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin高表達(dá)與乳腺癌等多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ezrin可通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、改變腫瘤細(xì)胞的極性及細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞間粘附及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附等多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，是抗腫瘤藥物作用的重要潛在靶點(diǎn)[3-5]。Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及乳腺良性疾病組織中Ezrin的陽(yáng)性表達(dá)率，比較Ezrin在各組之間表達(dá)情況的差異，并分析其與三陰性乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以期探討三陰性乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差的分子基礎(chǔ)，從而為三陰性乳腺癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1試劑及標(biāo)本來(lái)源小鼠抗人Ezrin單克隆抗體(Thermo Fisher公司)；SP免疫組化染色試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。收集2014年3月至2015年3月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科收治的82例乳腺癌患者，均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。用免疫組化檢測(cè)ER、PR及Her-2的表達(dá)情況，只有ER、PR及Her-2均不表達(dá)時(shí)定義為三陰性乳腺癌，有任何一個(gè)或幾個(gè)表達(dá)則定義為非三陰性乳腺癌。82例中三陰性乳腺癌患者24例，非三陰性乳腺癌患者58例。三陰性乳腺癌患者年齡30～56歲，平均為(43.94±1.67)歲，臨床分期包括：Ⅰ期6例、Ⅱ期6例、Ⅲ期12例。58名非三陰性乳腺癌患者年齡38～77歲，平均(50.78±2.01)歲，臨床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期29例、Ⅲ期17例。另有乳腺良性疾病患者20例，包括9例乳腺囊性增生及11例乳腺纖維腺瘤。所有患者均為女性，全部經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診且術(shù)前均未行放化療。

1.2免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Ezrin表達(dá)標(biāo)本經(jīng)400 mL/L甲醛(100 mL/L福爾馬林)固定，常規(guī)制作5 μm 厚連續(xù)切片。1張切片HE染色并進(jìn)行復(fù)診。

另采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Ezrin表達(dá)。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，熱平臺(tái)修復(fù)抗原15 min，冷卻至室溫。30 mL/L H2O2室溫孵育20 min后，PBS洗5 min×3次。正常山羊血清封閉20 min后，傾去不洗，滴加一抗(小鼠抗人Ezrin單克隆抗體，稀釋比1∶100)，4 ℃放置過(guò)夜。PBS洗5 min×3次后，滴加二抗，室溫放置20 min；磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次后，滴加SP，37 ℃孵育10 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Ezrin的陽(yáng)性染色主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒。采用雙盲法，在鏡下隨意選取5個(gè)視野，按染色深淺程度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比，并參考李瓊等[6]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將Ezrin的表達(dá)情況分為3個(gè)等級(jí)：(-)，無(wú)表達(dá)；(+)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比<50%或染色程度較淺；()，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥50%或染色程度較深。(-)及(+)判為Ezrin表達(dá)陰性，而()判為Ezrin表達(dá)陽(yáng)性。

1.4三陰性乳腺癌中Ezrin陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系將三陰性乳腺癌患者分別按年齡、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、組織學(xué)分級(jí)、臨床TNM分期進(jìn)行分組，比較各組間Ezrin表達(dá)情況的差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1乳腺組織中Ezrin的表達(dá)結(jié)果Ezrin陽(yáng)性染色即鏡下觀察到的棕黃色顆粒，多數(shù)彌漫性表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，少部分表達(dá)在細(xì)胞膜上，而細(xì)胞核膜上均未見(jiàn)到陽(yáng)性染色物(圖1)。

圖1Ezrin在不同乳腺組織中的表達(dá)

Fig.1 The expression of Ezrin in different breast tissues (×400)

A：三陰性乳腺癌組織；B：非三陰性乳腺癌組織；C：乳腺良性疾病組織。

Ezrin在乳腺良性疾病組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為15.00%(3/20)，在非三陰性乳腺癌組織中為48.28%(28/58)，在三陰性乳腺癌組織中為75.00%(18/24)。三組的結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.736，P<0.001)。三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中Ezrin的表達(dá)高于乳腺良性疾病，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.876，P=0.009；χ2=15.742，P<0.001)；三陰性乳腺癌組的Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率高于非三陰性乳腺癌組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.923，P=0.027，表1)。

表1乳腺良性疾病組織、非三陰性乳腺癌組織和三陰性乳腺癌組織中Ezrin的表達(dá)情況

Tab.1The expression of Ezrin in breast benign disease tissue, non-triple negative breast cancer tissue and triple negative breast cancer tissue

組別例數(shù)Ezrin陰性陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)乳腺良性疾病2017315.00非三陰性乳腺癌58302849.28*三陰性乳腺癌2461875.00*#

與乳腺良性疾病組比較，*P<0.05；與非三陰性乳腺癌組比較，

#P<0.05。

2.2三陰性乳腺癌中Ezrin陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系三陰性乳腺癌患者年齡≤50歲組的Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率為72.73%(8/11)，>50歲組為76.92%(10/13)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；原發(fā)腫瘤最大直徑≤2cm組和>2cm組的Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%(6/9)、80.00%(12/15)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.635)；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率為87.50%(7/8)，較陰性組的68.75%(11/16)增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.621)，這可能與樣本數(shù)量較小有關(guān)；Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率隨著組織學(xué)分級(jí)的增加而逐漸升高，組織學(xué)分級(jí)G1級(jí)組的Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率為33.33%(2/6)，G2級(jí)組為75.00%(3/4)，G3級(jí)組為92.86%(13/14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)；臨床TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組的Ezrin陽(yáng)性表達(dá)率為50.00%(6/12)，Ⅲ期組為100.00%(12/12)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014，表2)。

3討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌的一種特殊類(lèi)型，與非三陰性乳腺癌相比，有其特有的生物學(xué)特征，預(yù)后差，多發(fā)于絕經(jīng)前女性，多數(shù)有乳腺癌家族史，異質(zhì)性和組織學(xué)分級(jí)較高，部分與遺傳基因BRCA1相關(guān)，多數(shù)具有基底細(xì)胞樣表型的特點(diǎn)。病理類(lèi)型以浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌為主，較早發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，表達(dá)P-cadherin、EGFR、CK 5/6、P53較多而表達(dá)AR、E-cadherin、Cyclin D較少，5年生存率和總生存率均低于非三陰性乳腺癌[7-8]。因此，三陰性乳腺癌已經(jīng)成為目前乳腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的難題。

表2Ezrin表達(dá)與三陰性乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2The expression of Ezrin and its relationship with clinicopathologic features of patients with triple negative breast cancer

臨床病理特征例數(shù)Ezrin表達(dá)(例數(shù))陰性陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)P值年齡(歲)1.000 ≤50113872.73 >501331076.92腫瘤大小(cm)0.635 ≤293666.67 >21531280.00淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.621 陰性1651168.75 陽(yáng)性81787.50組織學(xué)分級(jí)0.016 高分化(G1)64233.33 中分化(G2)41375.00 低分化(G3)1411392.86臨床TNM分期0.014 Ⅰ～Ⅱ期126650.00 Ⅲ期12012100.00

Ezrin蛋白的分子質(zhì)量約為82 ku，由定位于人染色體6q25.2-q26的Villin2基因編碼，其結(jié)構(gòu)主要包括3個(gè)部分：N-端是具有高度同源性的FERM功能域，可與多種細(xì)胞表面粘附分子(CD44、c-Met、ICAM1、ICAM2等)相結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；中間是連接N-端和C-端的α螺旋結(jié)構(gòu)；C-端是可與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白相連的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)，該區(qū)內(nèi)含有Ezrin的磷酸化活化位點(diǎn)。方軍[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Ezrin的表達(dá)顯著高于乳腺良性疾病組織，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小等無(wú)關(guān)。王明喜等[10]的研究也證實(shí)，乳腺癌中Ezrin表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。MAK等[11]研究發(fā)現(xiàn)Src通過(guò)調(diào)節(jié)Ezrin蛋白第477位上的酪氨酸殘基的磷酸化調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。ELLIOTT等[12]用鼠乳腺癌細(xì)胞系A(chǔ)C2M2進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將表達(dá)野生型Ezrin的細(xì)胞移植到同基因型小鼠的乳房脂肪墊中可引起肺轉(zhuǎn)移，而Ezrin活性被抑制的細(xì)胞移植后則沒(méi)有觀察到肺轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Ezrin在乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中是必不可少的。LI等[13]發(fā)現(xiàn)使用RNA干擾技術(shù)使Ezrin基因表達(dá)沉默后可有效降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，證實(shí)Ezrin參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，Ezrin在三陰性乳腺癌組織與非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ezrin在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)提示Ezrin可作為三陰性乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)之一。Ezrin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)以及臨床TNM分期有關(guān)。馬力[14]的研究表明，在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Ezrin的表達(dá)水平隨著組織學(xué)分級(jí)、臨床TNM分期的增加而逐漸升高，其表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和臨床TNM分期呈正相關(guān)。但是本研究中Ezrin的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無(wú)關(guān)，可能是由于樣本量較少的緣故。Ezrin在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中的表達(dá)均顯著高于乳腺良性疾病，這與GSCHWANTLER-KAULICH等[15]的研究結(jié)果一致。

Ezrin在三陰性乳腺癌中高表達(dá)可能是三陰性乳腺癌侵襲性強(qiáng)、早期容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的原因之一，但是其在三陰性乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的具體作用及詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。檢測(cè)Ezrin在三陰性乳腺癌患者中的表達(dá)情況可能有助于判斷其預(yù)后，并為其早期診斷及靶向治療提供一定的依據(jù)。相信隨著大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展與研究，Ezrin有望為三陰性乳腺癌的診治提供新的靶點(diǎn)。

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(編輯國(guó)榮)

收稿日期：2015-12-31修回日期：2016-03-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81274136)

通訊作者：張淑群. E-mail: zhangshuqun1971@aliyun.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604021

The expression and significance of Ezrin in human triple negative breast cancer

ZHANG Hong, WANG Wen, TIAN Tian, ZHAO Xi-xi, MA Xing-cong,YAN Wan-jun, GAO Xiao-yan, ZHANG Shu-qun

(Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression and significance of Ezrin in triple negative breast cancer tissues. MethodsWe selected 102 cases, including 24 ones of triple negative breast cancer, 58 ones of non-triple negative breast cancer, and 20 of benign breast disease. The expression of Ezrin in all the specimens was detected by SP immunohistochemistry. We observed whether there was any difference between the positive expression rates of Ezrin in the three groups. We also analyzed the correlation between Ezrin expression and clinicopathologic parameters of triple negative breast cancer. ResultsThe positive expression rate of Ezrin in groups of triple negative breast cancer, non-triple negative breast cancer, and benign breast disease was 15.00%, 48.28% and 75.00%, respectively. The difference between the three groups differed significantly (P<0.01). The high expression of Ezrin in triple negative breast cancer had relationship with histological grading and clinical TNM staging (P<0.05), but not with patients’ age, tumor size, or axillary lymph node metastasis (P>0.05). ConclusionEzrin is highly expressed in triple negative breast cancer tissues; therefore, it can be used as an important indicator of poor prognosis of triple negative breast cancer.

KEY WORDS:Ezrin; triple negative breast cancer; immunohistochemistry

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81274136)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.1736.018.html(2016-06-08)