辛伐他汀對食管癌細胞放療敏感性的影響

金迎迎，衛(wèi)　陽，王　力，何　赟，賈　輝，馬紅兵，孫曉力

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1. 腫瘤科；2. 科研中心實驗室；3. 普外科，陜西西安　710004)

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◇臨床研究◇

辛伐他汀對食管癌細胞放療敏感性的影響

金迎迎1，衛(wèi)陽2，王力1，何赟1，賈輝1，馬紅兵1，孫曉力3

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1. 腫瘤科；2. 科研中心實驗室；3. 普外科，陜西西安710004)

摘要：目的觀察辛伐他汀對食管癌細胞放療敏感性的影響。方法應(yīng)用間斷照射的方法誘導(dǎo)食管癌細胞EC9706的放射抗拒細胞R-resistant；Cell Counting Kit-8檢測辛伐他汀聯(lián)合放療對食管癌細胞EC9706及其放射抗拒細胞R-resistant增殖的影響；集落形成實驗檢測辛伐他汀對食管癌細胞EC9706及其放射抗拒細胞R-resistant的放療敏感性的影響。結(jié)果成功誘導(dǎo)出食管癌細胞EC9706的放射抗拒細胞R-resistant，Cell Counting Kit-8實驗及集落形成實驗結(jié)果都顯示辛伐他汀可以增強食管癌細胞EC9706及其放射抗拒細胞R-resistant對放療的敏感性。結(jié)論辛伐他汀可以增強食管癌細胞的放療敏感性。

關(guān)鍵詞：辛伐他??；食管癌；放療抗拒；增敏

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，國際癌癥研究中心(IARC)全球癌癥統(tǒng)計報告顯示[1]：2012年食管癌發(fā)病人數(shù)為45.58萬人，我國為25萬，發(fā)病占全世界人數(shù)一半以上。放射治療是EC三大治療手段之一。然而，單純放療治療局部晚期食管癌的療效并不理想。美國腫瘤放射治療協(xié)作組(RTOG)85-01臨床試驗，患者接受64 Gy(2 Gy/d)常規(guī)放療，結(jié)果顯示單純放療的患者都在3年內(nèi)死亡，而放化療聯(lián)用組的患者的5年生存期也僅為26%[2]。雖然放療設(shè)備和方法不斷改進，但EC療效并無明顯改善。目前，調(diào)強放射治療(intensity modulated radiation therapy, IMRT)技術(shù)已成為放療的主流，但也僅是在照射范圍和劑量方面更加精確，減少心肺等危及器官毒性上有一定的優(yōu)勢，對EC療效并無明顯提高[3]。眾多研究表明，癌細胞經(jīng)過射線反復(fù)照射后放射敏感性能發(fā)生改變，只有放射抗拒細胞能夠在射線作用下繼續(xù)增殖，放療后殘留的這些腫瘤細胞不僅放射抗拒性增強，而且更具侵襲性、容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。因此，放療抗拒是制約EC療效的瓶頸[4]。

他汀類藥物包括洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀和普伐他汀等。該類藥物通過競爭性抑制肝臟合成膽固醇的限速酶3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶的活性，減少肝內(nèi)膽固醇合成，該類藥目前被廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管疾病。近年來，大量細胞模型和臨床觀察顯示他汀類藥物對癌癥具有一定的抑制作用，特別是在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中顯示出較好的效果[5-12]。多個臨床試驗的結(jié)果顯示他汀類藥物對食管癌不僅有預(yù)防作用，還有治療效果，而關(guān)于他汀類藥物增強食管癌細胞對放療的敏感性，以及逆轉(zhuǎn)食管癌細胞的放射抗拒性也鮮有研究[13-14]。本研究首次顯示辛伐他汀可以增強食管癌放射抗拒細胞對放療的敏感性，將為臨床上放療抗拒食管癌的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1主要試劑細胞培養(yǎng)試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清購自美國GIBCO公司；細胞生長曲線測定CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，辛伐他汀結(jié)晶紫染液購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2細胞培養(yǎng)食管癌細胞系EC9706為本研究室保存，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。建立放射抗拒食管癌細胞株: 將培養(yǎng)的細胞在室溫下用直線加速器6MV-X射線(2100EX，Varian)滿射野照射細胞，照射劑量為2、4、6、8、10 Gy，吸收劑量率為300 cGy/min，射距100 cm，培養(yǎng)板下放置一個“水箱”和培養(yǎng)板上覆蓋1.5 cm厚的組織膠補償塊，經(jīng)計算機定位確保高能X線均勻、準確地照射到細胞，照射后繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細胞生長和死亡情況，確定亞致死劑量的放射線。在亞致死劑量確定后，食管癌細胞接受5次亞致死劑量放射線照射：食管癌細胞用亞致死劑量放射線照射后立即放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直至存活細胞形成克隆，收集照射后存活的克隆細胞作為第一代亞克隆細胞；如此反復(fù)照射5次，直到第五代亞克隆細胞產(chǎn)生，定義第五代存活的亞克隆細胞作為放射抗拒的食管癌細胞，并命名。相同步驟處理但未照射的食管癌細胞作為放射敏感的食管癌細胞。

1.3細胞增殖將待放射處理后的細胞以每孔2 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，并同時聯(lián)合辛伐他汀處理，培養(yǎng)72 h，每天在同一時間取出3孔按照CC K-8試劑盒要求檢測。Micro-ELISA儀讀取光密度，檢測波長為450 nm，繪制細胞生長曲線，此實驗重復(fù)3次。

1.4集落形成集落形成實驗測定單個細胞的增殖能力，是判斷細胞對放射敏感性的金標準，計算存活分數(shù)。將放療聯(lián)合辛伐他汀處理的EC9706細胞接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1周后，PBS洗3次，多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，實驗重復(fù)3次。對照組選取完全空白組和DMSO對照組(由于本研究用的DMS溶解的辛伐他汀，故DMSO組設(shè)對照組)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法細胞存活率隨著放射劑量的變化用半對數(shù)線圖進行描述，用一般線性模型進行兩條半對數(shù)曲線的比較；不同組別的細胞集落數(shù)用誤差條圖進行描述，直條的高度表示均數(shù)，誤差線表示1個標準差。經(jīng)檢驗，不同組間細胞集落數(shù)具有方差齊性，組間集落數(shù)的比較用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較。用 Microsoft Excel和SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計圖的繪制和統(tǒng)計分析，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1辛伐他汀增強食管癌細胞對放療的敏感性本研究比較了幾種常見的食管癌細胞對放療的敏感性，結(jié)果顯示EC9706對放療最為敏感，進一步的研究顯示辛伐他汀可以增強食管癌細胞EC9706對放療的敏感性。單獨加入辛伐他汀可以抑制細胞的存活率(圖1)。隨著放射劑量的增加，加入辛伐他汀組的食管癌細胞EC9706存活率相對于完全空白組呈現(xiàn)明顯的下降，集落形成實驗結(jié)果也顯示辛伐他汀和放療有協(xié)同抗腫瘤的作用，聯(lián)合組相對于單獨放療組和辛伐他汀組集落的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的減少(P<0.001，圖2)。

圖1辛伐他汀聯(lián)合放療對食管癌細胞EC9706存活率的影響

Fig.1 The effect of simvastatin combined with radiotherapy on the survival rate of esophageal squamous cell carcinoma EC9706

2.2食管癌放射抗拒細胞的成功誘導(dǎo)本研究通過間斷照射的方法成功誘導(dǎo)出食管癌細胞EC9706的放射抗拒細胞R-resistant，相對于親代細胞，放射抗拒細胞R-resistant對放療的敏感性呈現(xiàn)明顯的降低(F=17.637，P<0.05，圖3)。

圖2集落形成實驗驗證辛伐他汀和放療在食管癌細胞EC9706中的協(xié)同抗腫瘤作用

Fig.2 The colony formation assay indicated that simvastatin could sensitize esophageal squamous cell carcinoma to irradiation

A：集落形成實驗的代表圖；B：數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖。單因素方差分析結(jié)果為F=574.105，P<0.001；LSD多重比較中與Simvastatin+6 Gy組比較，***P<0.001。

圖3食管癌細胞EC9706及其放射抗拒細胞對放療的敏感性

Fig.3 The radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma EC9706 and the radioresistant cell R-resistant

2.3辛伐他汀增強食管癌放射抗拒細胞對放療的敏感性CCK8的結(jié)果顯示，相對于單獨放療組來說，聯(lián)合組對腫瘤放射抗拒細胞具有明顯的抑制效果(圖4)；而集落形成實驗的結(jié)果也顯示聯(lián)合組相對單獨放療組和辛伐他汀組可以明顯增強放射抗拒細胞R-resistant對放療的敏感性(P<0.001，圖5)。

圖4辛伐他汀聯(lián)合放療對食管癌放射抗拒細胞EC9706(R-resistant)存活率的影響

Fig.4 The effect of simvastatin combined with radiotherapy on the survival rate of radioresistant EC9706 (R-resistant)

圖5集落形成實驗顯示辛伐他汀可以增強食管癌放射抗拒細胞對放療的敏感性

Fig.5 The colony formation assay indicated that simvastatin could sensitize the radioresistance of esophageal squamous cell carcinoma to irradiation

A：集落形成實驗的代表圖；B數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖。單因素方差分析結(jié)果為F=105.576，P<0.001；LSD多重比較中與Simvastatin+6 Gy組比較，**P<0.01，***P<0.001。

3討論

食管癌以綜合治療為主要手段，放療是食管癌的三大治療手段之一，而放射抗拒則是制約EC放療療效的瓶頸。雖然放療設(shè)備和方法不斷改進，但單純放療治療局部晚期EC的療效并無明顯改善。因此，提高食管癌細胞對放療的敏感性的研究顯得尤為重要，放療增敏藥物的研究也隨之成為一個熱點問題。對于新的放療增敏藥物的研究因為其對機體的毒性不明成為研究的難點。他汀類藥物目前廣泛用于預(yù)防和治療心腦血管疾病，并且展現(xiàn)出良好的安全性。近年來，大量的研究顯示他汀類藥物在多種腫瘤治療中呈現(xiàn)出對腫瘤細胞較好的抑制效果[5-12]。

近年來，大量細胞模型和臨床觀察顯示他汀類藥物對癌癥具有一定的抑制作用。深入研究表明，他汀類藥物具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制血管生成等作用[6]。關(guān)于他汀類藥物增強放射抗拒細胞對放療的敏感性的機制目前已有部分進展。MILLER等[15]的研究顯示Ras參與了骨肉瘤的放射抗拒，而洛伐他汀則可以通過抑制甲羥戊酸途徑抑制Ras蛋白的翻譯后修飾，抑制其和細胞膜的作用，繼而促進Ras轉(zhuǎn)化的骨肉瘤對放療的敏感性。有報道顯示Rac1介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞對放療的響應(yīng)可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，而他汀類藥物則可以通過抑制Rac1的翻譯后修飾來降低其活性，繼而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。在肺癌細胞A549中的研究顯示，洛伐他汀可以增強肺癌細胞對放療的敏感性，其機制可能通過抑制Akt和激活A(yù)MPK通路來誘導(dǎo)細胞的凋亡實現(xiàn)的[9]。而目前關(guān)于他汀類藥物是否可以增強食管癌細胞對放療的敏感性則鮮有研究[13-14]。

本研究主要以放射敏感的食管癌細胞EC9706為研究對象，研究結(jié)果顯示，加入辛伐他汀后隨著放射劑量的增加，細胞EC9706的存活率降低。集落形成實驗顯示，辛伐他汀聯(lián)合放療相對于單獨放療組和辛伐他汀組集落的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的減少(P<0.001)。因此，本研究結(jié)果顯示辛伐他汀可以增強親代食管癌細胞對放療的敏感性。另一方面，本研究通過間斷照射的方法成功誘導(dǎo)出食管癌細胞EC9706的放射抗拒細胞R-resistant，進一步的研究顯示，辛伐他汀聯(lián)合放療與單獨放療組相比，放射抗拒細胞R-resistant的存活率明顯降低，具有明顯的腫瘤抑制效果；集落形成實驗的結(jié)果也顯示聯(lián)合組相對單獨放療組和辛伐他汀組，集落的數(shù)量呈現(xiàn)明顯的減少(P<0.01)。由此說明辛伐他汀可以明顯增強放射抗拒細胞R-resistant對放療的敏感性，可逆轉(zhuǎn)R-resistant的放射抗拒。

辛伐他汀作為預(yù)防和治療心腦血管疾病方面的一種老藥，在臨床上顯示出良好的安全性，未見明顯不良反應(yīng)，將其作為EC放療的增敏藥物，具有安全應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)。因此，“老藥新用”作為放療增敏藥物的辛伐他汀具備良好的安全性優(yōu)勢。辛伐他汀對EC放療敏感性的具體的作用機制尚不明確，筆者正在開展更進一步的深入研究。本研究將為食管癌的臨床放療增敏，尤其是放射抗拒的食管癌患者的治療提供新的治療策略。

參考文獻：

[1] TORRE LA, BRAY F, SIEGEL RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] COOPER JS, GUO MD, HERSKOVIC A, et al. Chemoradiotherapy of locally advanced esophageal cancer: long-term follow-up of a prospective randomized trial (RTOG85-01)[J]. JAMA, 1999, 281(17):1623-1627.

[3] CHANDRA A, GUERRERO TM, LIU HH, et al. Feasibility of using intensity-modulated radiotherapy to improve lung sparing in treatment planning for distal esophageal cancer[J]. Radiother Oncol, 2005, 77(3):247-253.

[4] NGUYEN GH, MURPH MM, CHANG JY. Cancer stem cell radioresistance and enrichment: Where frontline radiation therapy may fail in lung and esophageal cancers[J]. Cancers (Basel), 2011, 3(1):1232-1252.

[5] KELVIN KW, AMIT M, LILLIAN L. The statins as anticancer agents[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(1):10-19.

[6] FRITZ G, HENNINGER C, HUELSENBECK J. Potential use of HMG-CoA reductase inhibitors (statins) as radioprotective agents[J]. Br Med Bull, 2011, 97(1):17-26.

[7] AGARWAL B, HALMOS B, ALEKSANDER S, et al. Mechanism of lovastatin induced apotosis in intestinal epithelial cells[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(3):521-528.

[8] FARINA HG, BUBLIK DR, ALONSO DF, et al. Lovastatin alters cytoskleton organization and inhibits experimental metastasis of mammary carcinoma cell[J]. Clin Exp Metastasis, 2002, 19(6):551-559.

[9] SANLI T, LIU C, RASHID A, et al. Lovastatin sensitizes lung cancer cells to ionizing radiation: modulation of molecular pathways of radioresistance and tumor suppression[J]. J Thorac Oncol, 2011, 6(3):439-450.

[10] LACERDA L, REDDY JP, LIU D, et al. Simvastatin radiosensitizes differentiated and stem-like breast cancer cell lines and is associated with improved local control in inflammatory breast cancer patients treated with postmastectomy radiation[J]. Stem Cells Transl Med, 2014, 3(7):849-856.

[11] LARNER J, JANE J, LAWS E, et al. A phase Ⅰ, Ⅱ trial of lovastatin for anaplastic astrocytoma and glioblastoma multiforme[J]. Am J Clin Oncol, 1998, 21(6):579-583.

[12] HOLLER V, BUARD V, GAUGLER MH, et al. Pravastatin limits radiation-induced vascular dysfunction in the skin[J]. J Invest Dermatol, 2009, 129(5):1280-1291.

[13] AZOULAY L, SUISSA S. Immortal person-time bias in relation to the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and statins in the prevention of esophageal cancer in patients with Barrett's esophagus[J]. Gastroenterology, 2012, 142(5):e20-21.

[14] ALEXANDRE L, CLARK AB, BHUTTA HY, et al. Statin use is associated with reduced risk of histologic subtypes of esophageal cancer: a nested case-control analysis[J]. Gastroenterology, 2014, 146(3):661-668.

[15] MILLER AC, KARIKO K, MYERS CE, et al. Increased radioresistance of EJras-transformed human osteosarcoma cells and its modulation bylovastatin, an inhibitor of p21ras isoprenylation[J]. Int J Cancer, 1993, 53(2):302-307.

[16] HAMALUKIC M, HUELSENBECK J, SCHAD A, et al. Rac1-regulated endothelial radiation response stimulates extravasation and metastasis that can be blocked by HMG-CoA reductase inhibitors[J]. PLoS One, 2011, 6(10):e26413.

(編輯韓維棟)

收稿日期：2015-11-02修回日期：2016-03-12

通訊作者：孫曉力. E-mail: 2697782835@qq.com

中圖分類號：R735.1

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604019

Simvastatin enhances the radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma

JIN Ying-ying1, WEI Yang2, WANG Li1, HE Yun1,JIA Hui1, MA Hong-bing1, SUN Xiao-li3

(1. Department of Oncology, 2. Scientific Research Center, 3. Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the effect of simvastatin on the radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. MethodsInterrupted radiation was used to induce the radioresistance EC9706, named R-resistant cell. The effect of simvastatin on the proliferation and radiosensitivity of EC9706 and R-resistant cells were examined by Cell Counting Kit-8 assay and colony formation assay, respectively. ResultsThe radioresistance EC9706, named R-resistant, was induced successfully. The results of Counting Kit-8 assay and colony formation assay indicated that simvastatin could sensitize EC9706 and the radioresistance of R-resistant to irradiation. ConclusionSimvastatin can sensitize esophageal squamous cell carcinoma to irradiation.

KEY WORDS:simvastatin; esophageal squamous cell carcinoma; radioresistance; sensitization

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160615.1047.020.html(2016-06-15)