鹽酸小檗堿調(diào)節(jié)大鼠實驗性牙周炎牙齦組織MMPs/TIMP表達(dá)變化及其機制

孫俊毅，朱春暉，劉　瑾，李　昂，董　妍，李冬玲

(1. 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，陜西西安　710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中國皮膚性病學(xué)雜志編輯部，陜西西安　710004；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

鹽酸小檗堿調(diào)節(jié)大鼠實驗性牙周炎牙齦組織MMPs/TIMP表達(dá)變化及其機制

孫俊毅1，朱春暉1，劉瑾1，李昂1，董妍2，李冬玲3

(1. 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，陜西西安710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中國皮膚性病學(xué)雜志編輯部，陜西西安710004；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，陜西西安710061)

摘要：目的探討鹽酸小檗堿對牙周炎基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(MMPs/TIMP)的調(diào)控及其機制。方法采用絲線結(jié)扎+菌液注射法建立大鼠牙周炎模型后，給予150 mg/(kg·d)鹽酸小檗堿或生理鹽水干預(yù)。顯微X射線斷層計算機掃描(μ-CT)和蘇木素-伊紅(HE)染色觀察牙周組織學(xué)改變，Western blot檢測大鼠牙齦組織MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表達(dá)及P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平，ELISA測定牙齦組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的含量。結(jié)果牙周檢查發(fā)現(xiàn)牙周炎組大鼠牙齦紅腫明顯，觸之易出血，牙周袋較深，μ-CT顯示牙槽骨吸收明顯，牙齦組織TNF-α和IL-1β含量顯著增加，MMP-2和MMP-9表達(dá)增多，并伴有磷酸化P38 MAPK/NF-κB上調(diào)。鹽酸小檗堿治療后可明顯改善牙周情況，減少牙槽骨吸收，降低牙齦組織TNF-α和IL-1β含量，抑制P38 MAPK/NF-κB磷酸化，最終降低MMP-2和MMP-9的過度表達(dá)并提高TIMP-2的表達(dá)。結(jié)論鹽酸小檗堿可能通過抑制P38 MAPK/NF-κB磷酸化，降低牙齦組織TNF-α和IL-1β，調(diào)節(jié)牙齦組織MMPs/TIMP的過量表達(dá)而發(fā)揮對大鼠牙周炎的治療作用。

關(guān)鍵詞：牙周炎；鹽酸小檗堿；炎癥；基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(MMPs/TIMP)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；白介素-1β(IL-1β); P38 MAPK/NF-κB

牙周炎主要是由細(xì)菌感染引起的牙周組織慢性炎性疾病，會造成進行性牙周附著喪失和牙槽骨吸收，形成牙周袋，最終可導(dǎo)致牙齒脫落，是成人失牙的主要原因[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一類參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶。牙菌斑和感染引起的牙周炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)MMPs大量表達(dá)，使其活性增強，從而介導(dǎo)牙周組織的瓦解[2]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者齦溝液中活化的MMP-9含量明顯增加，經(jīng)有效治療后，可使升高的MMP-9降低[3]。牙周炎患者不僅牙齦組織中MMP-2和MMP-9表達(dá)增加，齦溝液中MMP-2表達(dá)也增多[4]，牙周袋鄰近的非牙齦組織中MMP-2 mRNA表達(dá)也增多[5]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)可直接刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞高表達(dá)MMP-2[6]；MMP-2和MMP-9在牙周炎癥中大量表達(dá)；尤其是炎癥慢性期(30～90 d)MMP-2、MMP-9在牙周的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、浸潤的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中大量表達(dá)。這表明MMP-2、MMP-9不僅在牙周炎癥的發(fā)生過程起到重要作用，也促進了牙周組織損毀過程中細(xì)胞外基質(zhì)的降解[7]。臨床上用于控制牙周炎炎癥的藥物較少。研究發(fā)現(xiàn)黃連的主要有效成分之一鹽酸小檗堿具有抑菌抗炎作用[8-9]，可促進大鼠實驗性牙周炎模型牙周組織的修復(fù)并抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[10]，還可以降低MMPs的表達(dá)[11]。但對MMP-2和MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)機制和信號通路尚不清楚。本研究擬建立大鼠牙周炎模型，應(yīng)用鹽酸小檗堿治療并觀察牙槽骨吸收程度和牙周組織學(xué)改變，檢測MMP-2、MMP-9和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2, TIMP-2)的蛋白表達(dá)、細(xì)胞因子TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)水平以及促炎信號通路P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平，探討鹽酸小檗堿調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和TIMP-2的可能機制及參與調(diào)節(jié)的信號分子。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～250 g)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。該實驗倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。牙齦卟啉單胞菌菌液由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院重點實驗室微生物室提供；鹽酸小檗堿(西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司)；組織蛋白提取試劑RIPA、BCA蛋白定量試劑盒(碧云天，中國江蘇)；小鼠抗大鼠MMP-2抗體、小鼠抗大鼠MMP-9抗體、兔抗大鼠TIMP-2抗體、兔抗大鼠P38 MAPK抗體、兔抗大鼠磷酸化P38 MAPK抗體(Tyr182)(Santa Cruz，美國)；兔抗大鼠NF-κB抗體、兔抗大鼠磷酸化NF-κB抗體(Ser536)(Cell Signaling Technology, 美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的小鼠抗兔二抗、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(博士德，中國武漢)；PVDF膜、化學(xué)發(fā)光液(Millipore，美國)；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(R&D，美國)。

1.2大鼠牙周炎模型的建立健康清潔型雄性SD大鼠共35只，體質(zhì)量(220±10)g，動物進行編號并隨機抽取分為假手術(shù)組(sham group，n=10)和模型組(25只)。牙周炎模型建立方法如下(8周)：100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g，ip.)麻醉大鼠，1號非吸收外科縫合絲線結(jié)扎于大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙頸部，并于齦溝底注射牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)菌液20 μL，于結(jié)扎后的第3、5、7天分別注射菌液1次，結(jié)扎后8周去除結(jié)扎線，隨機分為2組灌胃：①牙周炎組(periodontitis group)：等體積生理鹽水灌胃；②鹽酸小檗堿組(periodontitis+berberine)：[150 mg/(kg·d)]鹽酸小檗堿灌胃4周；假手術(shù)組大鼠上頜第一磨牙穿線不結(jié)扎并注射菌液等體積(20 μL)的滅菌生理鹽水。實驗結(jié)束后處死大鼠并收集上頜第一磨牙周圍牙齦組織，―80 ℃保存，40 g/L多聚甲醛固定上頜備后續(xù)實驗使用。

1.3顯微X射線計算機斷層掃描40 g/L多聚甲醛固定大鼠上頜磨牙及牙槽骨48 h后，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，德國YXLON微米X射線三維成像系統(tǒng)行顯微X射線計算機斷層掃描(micro X-ray computed tomography, μ-CT)，并重建上頜磨牙及牙槽骨三維結(jié)構(gòu)，觀察大鼠牙槽骨吸收情況。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色40 g/L多聚甲醛固定大鼠上頜48 h，100 g/L EDTANa脫鈣4周，脫水石蠟包埋，行近遠(yuǎn)方向切片，厚度8 μm。HE染色，并行組織學(xué)觀察。

1.5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定牙齦組織TNF-α和IL-1β的含量20 mg牙齦組織加入200 μL PBS，剪碎、冰上勻漿，組織懸液于低溫離心機4 ℃離心4 000 r/min×5 min。取上清按照ELISA說明書檢測組織TNF-α、IL-1β含量。

1.6Western blot檢測MMP-2、MMP-9、TIMP-2、P38 MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)10 mg牙齦組織加入100 μL RIPA和1 μL 100 mmol/L PMSF，剪碎、冰上電動勻漿。組織懸液于低溫離心機4 ℃離心14 000 r/min×10 min。上清中的組織蛋白濃度用BCA蛋白定量試劑盒檢測。變性后蛋白樣品(20 μg)經(jīng)100 g/L SDS-多聚酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟化物膜(PVDF)；PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉或BSA(TBST：25 mmmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mL/L Tween-20)室溫封閉1 h后，加入一抗(MMP-2、MMP-9、TIMP-2、P38 MAPK和NF-κB)，工作液稀釋比分別為1∶1 000(NF-κB)，其余為1∶200，4 ℃過夜；TBST漂洗5 min×5次；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育60 min；TBST漂洗5 min×5次；化學(xué)發(fā)光液(ECL)按說明書1∶1混合A、B兩液滴加到PVDF膜，X線片曝光顯影。Gel-Pro Analyzer 4.0 software(Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析條帶。

2結(jié)果

2.1鹽酸小檗堿對大鼠牙周炎具有治療作用假手術(shù)組大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙齦組織無紅腫、無牙周袋，觸之無出血。牙周炎組大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙牙齦組織糜爛、萎縮，齦緣有大量食物殘渣，牙齦觸之出血或有自發(fā)性出血現(xiàn)象，牙周袋形成、附著喪失及松動，給予鹽酸小檗堿治療后，牙周情況得到改善，牙齦紅腫顯著減輕，牙周袋消失或變淺，出血指數(shù)明顯降低。

2.2鹽酸小檗堿減輕大鼠牙周炎牙槽骨吸收顯微X射線計算機斷層掃描(micro X-ray computed tomography, μ-CT)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，牙周炎組大鼠上頜牙槽骨吸收顯著增加；給予150 mg/(kg·d)鹽酸小檗堿治療后，牙槽骨吸收較牙周炎組減輕(圖1)。這提示鹽酸小檗堿治療可減輕牙槽骨的吸收。

圖1鹽酸小檗堿抑制大鼠牙槽骨吸收

Fig.1 Berberine inhibited alveolar bone loss in rat periodontitis (μ-CT)

A：假手術(shù)組(Sham)；B：牙周炎模型組(Periodontitis)；C：鹽酸小檗堿治療組(Periodontitis+Berberine)。

2.3鹽酸小檗堿改善大鼠牙周組織情況HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠牙齦上皮完整，皮下結(jié)締組織排列整齊無炎細(xì)胞浸潤，牙槽骨骨質(zhì)致密，無骨吸收陷窩；牙周炎組牙齦上皮受損，皮下結(jié)締組織紊亂，炎性細(xì)胞浸潤增多，牙槽骨疏松，骨吸收陷窩較多；鹽酸小檗堿治療組牙齦形態(tài)明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤減少，牙槽骨骨質(zhì)有所增加。這提示鹽酸小檗堿治療后可顯著改善大鼠牙周組織學(xué)情況(圖2)。

2.4牙齦組織TNF-α和IL-1β含量的變化ELISA檢測結(jié)果顯示，牙周炎模型組的牙齦組織TNF-α和IL-1β含量較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)；鹽酸小檗堿治療后與牙周炎組比較，TNF-α和IL-1β顯著降低(P<0.05，圖3)。

圖2鹽酸小檗堿減輕牙周炎牙齦組織的退縮

Fig.2 Berberine improved the periodontal tissue destruction in rat periodontitis (HE, ×100)

A：假手術(shù)組(Sham)；B：牙周炎模型組(Periodontitis)；C：鹽酸小檗堿治療組(Periodontitis+Berberine)。

圖3鹽酸小檗堿降低大鼠牙齦組織TNF-α和IL-1β含量

Fig.3 Berberine decreased the levels of TNF-α and IL-1β in gingival tissue與假手術(shù)組(Sham)比較，**P<0.01；與牙周炎組(PD)比較，△P<0.05；△△P<0.01。PD：牙周炎模型組；B：鹽酸小檗堿治療。2.5牙齦組織MMP/TIMP蛋白表達(dá)水平Western blot檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，牙周炎組牙齦組織表達(dá)MMP-2、MMP-9顯著增加(P<0.01)，而TIMP-2無明顯變化；給予鹽酸小檗堿治療后，牙齦組織MMP-2、MMP-9明顯低于牙周炎組(P<0.01)，TIMP-2較假手術(shù)組和牙周炎組顯著升高(P均<0.05，圖4)。這表明鹽酸小檗堿可抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，而相應(yīng)提高TIMP-2的表達(dá)，減輕牙周組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

圖4鹽酸小檗堿對牙齦組織MMP-2、MMP-9和TIMP-2表達(dá)的影響

Fig.4 The effects of berberine on the expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in periodontitis

與假手術(shù)組(Sham)比較，*P<0.05，**P<0.01；與牙周炎組(PD)比較，△P<0.05，△△P<0.01。PD：牙周炎模型組；B：鹽酸小檗堿治療。

2.6牙齦組織P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平的變化Western blot檢測結(jié)果顯示，牙周炎組牙齦組織P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；給予鹽酸小檗堿治療后，P38 MAPK和NF-κB磷酸化水平較牙周炎組均降低(P<0.01，圖5)。這提示鹽酸小檗堿對大鼠實驗性牙周炎的炎癥信號通路P38 MAPK/NF-κB具有明顯的抑制作用。

圖5鹽酸小檗堿抑制牙周炎牙齦組織P38 MAPK/NF-κB的活化

Fig.5 Berberine reduced the activity of P38 MAPK/NF-κB in periodontitis

與假手術(shù)組(Sham)比較，**P<0.01；與牙周炎組(PD)比較，△△P<0.01。PD：牙周炎模型組；B：鹽酸小檗堿治療。

3討論

牙周炎主要是革蘭氏陰性厭養(yǎng)菌(如牙齦卟啉單胞菌等)對牙周組織所致慢性病理損害的結(jié)果，表現(xiàn)為病原菌與宿主相互作用所導(dǎo)致的免疫-炎癥穩(wěn)態(tài)的異常[12]。宿主toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)可識別牙周病原微生物，引起下游信號的活化，主要表現(xiàn)為TLR-2和TLR-4激活后，活化MyD-88依賴和非MyD-88依賴兩條信號通路，引起P38 MAPK磷酸化增加，繼而引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化后入核啟動靶基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致致炎因子產(chǎn)生增多，引起局部劇烈的炎癥反應(yīng)[13]。這種劇烈的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致牙槽骨的吸收和局部病灶的遷延不愈，其中局部感染和劇烈的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的MMPs/TIMPs比例失調(diào)——MMPs過度活化和TIMPs相對不足導(dǎo)致牙周組織的崩解，表現(xiàn)為牙槽骨吸收、牙齦退縮、牙周袋形成。

MMP是一類結(jié)構(gòu)相似、功能不同的蛋白水解酶家族，可以消化細(xì)胞外所有的大分子物質(zhì)，是主要調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶。MMP-2和MMP-9屬于明膠酶，MMP-2主要由牙齦的表皮細(xì)胞和牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)，以無活性的酶原(分子質(zhì)量72 ku)，經(jīng)剪切后形成活化型(62 ku)發(fā)揮作用[2]；MMP-9主要由浸潤到牙周組織的炎性細(xì)胞產(chǎn)生，炎性細(xì)胞因子可增加對MMP-9的合成和分泌，前MMP-9(92 ku)經(jīng)活化后形成活體形式(82 ku)，是牙周炎的重要生物學(xué)標(biāo)志物[14]。MMP-2、MMP-9的過量表達(dá)與牙齦纖維基質(zhì)瓦解程度密切相關(guān)。另外，TIMPs也是調(diào)控MMPs活化的重要因素，TIMPs可通過滅活活化的MMPs來減少細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解[15]。因此，調(diào)節(jié)MMPs/TIMP是目前治療牙周炎的新策略。

鹽酸小檗堿具有抗菌、抗氧化、抗炎等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療。本研究應(yīng)用鹽酸小檗堿可改善牙周炎模型大鼠的牙周組織情況、減少了牙槽骨吸收，降低MMP-2、MMP-9的過度表達(dá)，提高了TIMP-2水平；進一步檢測發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿抑制了促炎信號通路P38 MAPK/NF-κB的活化，減少了炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的生成。這提示鹽酸小檗堿可能通過降低宿主的炎癥反應(yīng)及MMP的過度活化。這一發(fā)現(xiàn)為臨床應(yīng)用鹽酸小檗堿治療牙周炎提供了新的理論依據(jù)。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-11-17修回日期：2016-01-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目(No.81202729)；陜西省自然科學(xué)基金基礎(chǔ)研究項目(No.2012JM74012)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(No.xjj2012060)

通訊作者：李冬玲. E-mail: lidl@mail.xjtu.edu.cn

中圖分類號：R781.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604016

Berberine regulates MMPs/TIMP via inhibition of P38 MAPK/NF-κB phosphorylation and anti-inflammation in rat experimental periodontitis

SUN Jun-yi1, ZHU Chun-hui1, LIU Jin1, LI Ang1, DONG Yan2, LI Dong-ling3

(1. Department of Periodontology, Stomatology Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004; 2. Editorial Office of the Chinese Journal of Dermatovenereology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University; Xi’an 710004;3. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences,Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effects of berberine on matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (MMPs/TIMPs) in rat periodontitis. MethodsAdult male Sprague-Dawley rats were subjected to thread ligation and porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) inoculation resulting in periodontitis. Berberine [150 mg/(kg·d)] or vehicle was administered by oral gavage for 4 weeks. Alveolar bone loss and soft-tissue destruction were determined by micro-computed tomography (μ-CT) and HE staining. The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) of gingival tissue were examined by ELISA. The expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 as well as the phosphorylation of P38 MAPK and NF-κB were determined by Western blot. ResultsSignificant increases were observed in alveolar bone loss and periodontal soft-tissue destruction with higher levels of TNF-α, IL-1β and MMP-2/9 expressions and the activities of P38 MAPK and NF-κB in the experiment periodontitis group. Berberine of [150 mg/(kg·d)] not only improved the periodontal tissue and decreased alveolar bone loss, but also reduced the contents of TNF-α, IL-1β and MMP-2/9 and increased TIMP-2. In addition, berberine inhibited the phosphorylation of P38 MAPK/NF-κB. ConclusionBerberine protects against periodontal tissue damage via decreasing MMP-2 and MMP-9 expressions but increasing TIMP-2 expression, which may be induced by inhibition of P38 MAPK/NF-κB and the anti-inflammatory effect on rat periodontitis.

KEY WORDS:periodontitis; berberine; inflammation; matrix metalloproteinase (MMP)/ tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP); TNF-α; IL-1β; P38 MAPK/NF-κB

Supported by the Youth Project of National Natural Science Foundation of China (No.81202729), the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2012JM74012), and Fundamental Research Funds for the Central Universities (No.xjj2012060)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160618.2057.008.html(2016-06-18)