納米膠束共同遞送DOX和Bcl-2 siRNA對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用

鎖愛莉，王何靜，錢軍民，劉茸茸，姚　煜

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安　710061；2. 金屬材料強度國家重點實驗室，陜西西安　710049)

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◇基礎(chǔ)研究◇

納米膠束共同遞送DOX和Bcl-2 siRNA對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用

鎖愛莉1，王何靜1，錢軍民2，劉茸茸2，姚煜1

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安710061；2. 金屬材料強度國家重點實驗室，陜西西安710049)

摘要：目的制備能同時裝載阿霉素(DOX)和Bcl-2 siRNA的納米膠束，利用MCF-7人乳腺癌細(xì)胞探討其細(xì)胞毒性和攝取效果。方法還原胺化法和碳二亞胺法合成共聚物聚乙二醇-聚乙烯亞胺-聚L-谷氨酸-γ-芐酯(PEG-PEI-PBLG)，核磁共振氫譜確認(rèn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)。透析法制備空白和載藥納米膠束，透射電子顯微鏡和動態(tài)光散射法表征其形貌和粒徑分布；凝膠電泳方法確定納米膠束壓縮Bcl-2 siRNA的能力；熒光光譜和透析法探討納米膠束釋藥行為；共聚焦激光掃描顯微鏡觀察納米膠束被細(xì)胞攝取情況；MTT比色法檢測細(xì)胞毒性。結(jié)果PEG-PEI-PBLG的臨界膠束質(zhì)量濃度約為4 mg/L，自組裝形成的空白和載藥納米膠束粒徑均小于200 nm；納米膠束包埋DOX的載藥效率和載藥量分別為88.7%和15.1%，載DOX納米膠束在N/P≥64時可有效壓縮Bcl-2 siRNA；載DOX和Bcl-2 siRNA的納米膠束的zeta電位為+30 mV；DOX和Bcl-2 siRNA釋放行為具有pH敏感性，其中Bcl-2 siRNA釋放pH敏感性更強；納米膠束可將DOX和Bcl-2 siRNA同時遞送進MCF-7細(xì)胞，其細(xì)胞毒性高于DOX(P<0.05)。結(jié)論PEG-PEI-PBLG納米膠束能同時裝載并遞送DOX和Bcl-2 siRNA進入MCF-7細(xì)胞，顯著增強了DOX的細(xì)胞毒性，提示該納米膠束是化療藥和基因物質(zhì)共同遞送的潛在優(yōu)良載體。

關(guān)鍵詞：納米膠束；化療；Bcl-2小干擾RNA；聯(lián)合治療；乳腺癌；MCF-7細(xì)胞；細(xì)胞攝取

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)世衛(wèi)組織國際癌癥研究中心估計，每年全球新發(fā)女性乳腺癌病例達(dá)115萬，占女性惡性腫瘤發(fā)病的22.7%。我國雖屬低發(fā)國家，但上升趨勢明顯，2014年我國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%。作為乳腺癌治療的重要手段的化療，存在腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性、化療藥物腫瘤選擇性差、毒副作用大等缺點[1]。近年來，小干擾RNA(siRNA)被視為潛在的腫瘤高效治療新技術(shù)，受到研究者的廣泛重視。將siRNA與化療聯(lián)合施用，通過沉默妨礙化療藥物發(fā)揮作用的特定基因/蛋白質(zhì)表達(dá)[2]，可有效降低化療的毒副作用和克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，從而提高化療效果[3]。然而，裸露的siRNA呈負(fù)電性，存在易被核酸酶降解、細(xì)胞膜穿透能力差、半衰期短、非特異性免疫刺激等不足，極大地限制了其臨床應(yīng)用。為此，開發(fā)能在體內(nèi)保護siRNA并實現(xiàn)其安全遞送的納米載體就成了納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。目前，納米藥物載體研究多集中于脂質(zhì)體、聚合物膠束、納米凝膠、功能性無機納米粒等形式，這些納米載體可經(jīng)腫瘤組織增強滲透滯留效應(yīng)(EPR)實現(xiàn)在腫瘤處的聚集，提高藥物的利用率[4]。其中，聚合物納米膠束因具有核殼結(jié)構(gòu)、合成方法靈活、功能多、載藥量大等優(yōu)點，成為研究的重點[5]。本研究制備一種新型聚合物納米膠束，用其作為載體將阿霉素(DOX)和Bcl-2 siRNA共同遞送至MCF-7乳腺癌細(xì)胞，評價Bcl-2 siRNA和DOX協(xié)同殺傷MCF-7細(xì)胞的能力。

1材料與方法

1.1材料與試劑聚乙二醇單甲醚(mPEG，2 ku)、聚乙烯亞胺(PEI，1.8 ku)、NaBH3CN和N,N’-羰基二咪唑購自Sigma-Aldrich公司；阿霉素鹽酸鹽(DOX·HCl)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；Bcl-2 siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，正義鏈：5′-GUACAUCCAUUAUAAGCUGdTdT-3′，反義鏈：5′-CAGCUUAUAAUGGAUGUAC-dTdT-3′；高糖DMEM培養(yǎng)基購自北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司；胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術(shù)有限公司；人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2方法

1.2.1PEG-PEI-PBLG共聚物的合成首先根據(jù)文獻[6-7]合成出醛基化聚乙二醇和端氨基聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)(PBLG-NH2，Mn=6 ku)；接著，將1 g PEI和3 g醛基化聚乙二醇溶于25 mL水中，用鹽酸將pH值調(diào)至6～7.5，隨后加入186 mg NaBH3CN進行還原胺化反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)透析(截留分子質(zhì)量為3.5 ku，以下相同)和冷凍干燥后得到淡黃色固體PEG-PEI；另外，將3.2 g經(jīng)N,N’-羰基二咪唑活化的PBLG-NH2溶于30 mL DMF中，將該溶液與含1.6 g PEG-PEI的15 mL DMF溶液混合，室溫反應(yīng)12 h后進行透析和冷凍干燥，得到PEG-PEI-PBLG共聚物，收率為87.5%。共聚物化學(xué)結(jié)構(gòu)用1H NMR譜(Bruker 400 MHz，瑞士BRUKER公司)表征。

1.2.2PEG-PEI-PBLG納米膠束的制備采用透析法制備納米膠束，即將質(zhì)量濃度為2 mg/mL的PEG-PEI-PBLG共聚物的DMSO溶液裝于透析袋中，對蒸餾水透析并定時換水，得到納米膠束溶液。納米膠束粒徑分布/zeta電位和形貌分別用動態(tài)光散射法(DLS，Nano-ZS90納米粒度儀，英國馬爾文公司)和透射電子顯微鏡(TEM，JEM-200CX，日本JEOL公司)表征。為評估共聚物形成納米膠束的能力，采用芘熒光探針法(LS55型熒光分光光度計，美國Perkin Elmer公司)檢測臨界膠束濃度。共聚物質(zhì)子緩沖能力測試在0.15 mol/L的氯化鈉溶液中進行，以吸收鹽酸量來評價。

1.2.3DOX和Bcl-2 siRNA在納米膠束中的裝載和釋放行為采用透析法，通過共聚物和DOX共同自組裝過程，將DOX包埋于納米膠束內(nèi)核中[8]，即將30 mg共聚物和10 mg脫除HCl的DOX溶于DMSO中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，凍干后得到載DOX的納米膠束。納米膠束裝載DOX的能力用載藥效率(包埋進納米膠束的DOX占初始添加DOX的百分比)和載藥量(納米膠束中DOX含量百分比)表征[9]，其中DOX量根據(jù)DOX濃度-熒光強度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定(y=154.48x-1.622，R2=0.998 6，線性范圍為0.01～2 μg/mL)。利用瓊脂糖凝膠電泳實驗評價納米膠束經(jīng)靜電作用復(fù)合Bcl-2 siRNA的能力。主要過程為：在一系列特定濃度的納米膠束溶液(DMSO/DEPC水混合溶劑，體積比1/9)中分別加入Bcl-2 siRNA溶液(1 μL)，混合均勻后靜置40 min；接著，在每個樣品溶液中加入2.5 μL上樣緩沖液，混合均勻后各取10 μL進行電泳實驗(80 mV，35 min)，用溴化乙錠進行熒光染色；最后，用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)對凝膠板進行觀察并拍照。載DOX和siRNA后的納米膠束用納米粒度儀和TEM表征。

利用透析法研究納米膠束中DOX和Bcl-2 siRNA的釋放行為，其中Bcl-2 siRNA用羧基熒光素(FAM)進行標(biāo)記，記作FAM-siRNA。主要過程為：將載DOX的納米膠束分散于DEPC水中，得到6 mL、質(zhì)量濃度為1 mg/mL的納米膠束懸浮液，再按N/P=64復(fù)合FAM-siRNA；隨后，將懸浮液分成2等份，分別在pH 7.4和5.0、溫度37 ℃、濃度2 mmol/L的60 mL PBS中透析，搖床轉(zhuǎn)動速度為100 r/min；在透析期間預(yù)定時間點，吸取透析液3 mL(取后補充相應(yīng)體積PBS，以維持透析液體積不變)，用熒光分光光度計檢測其中DOX和FAM-siRNA的熒光強度，與各自標(biāo)準(zhǔn)曲線對照獲得對應(yīng)濃度數(shù)值。FAM-siRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.455 3x+0.218 7(R2=0.999，線性范圍為1～200 nmol/L)。DOX激發(fā)光波長為480 nm，發(fā)射光波長為590 nm；FAM-siRNA激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光波長為520 nm。

1.2.4載DOX/siRNA納米膠束的細(xì)胞攝取和細(xì)胞毒性在用共聚焦激光顯微鏡(CLSM)觀察納米膠束細(xì)胞攝入時，將處于對數(shù)生長期的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，以5×104個/孔的細(xì)胞密度種于激光共聚焦玻底培養(yǎng)皿中，經(jīng)過夜培養(yǎng)、細(xì)胞貼壁生長后，利用新鮮培養(yǎng)液或含納米膠束的培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液，再培育4 h或24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次以除去未被細(xì)胞攝入的納米膠束。清洗后的細(xì)胞依次經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min、PBS洗滌3次、DAPI染色液染色5 min、PBS洗滌3次，得到待觀察樣品。將這些樣品放置于共聚焦激光掃描顯微鏡(FV-1000，日本Olympus公司)下用油鏡觀察。其中，藍(lán)色為DAPI染色細(xì)胞核的熒光，紅色為DOX的熒光，綠色為FAM-siRNA的熒光。

用MTT比色法測試空白和載藥納米膠束的細(xì)胞毒性，具體實驗過程如下：將單細(xì)胞懸液以3×103個/孔的密度種植于96孔板中，在含100 mL/L胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用含不同納米膠束的新鮮培養(yǎng)液置換培養(yǎng)板孔中原培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h或48 h后向培養(yǎng)孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去除培養(yǎng)液并加入150 μL DMSO，以溶解甲臜晶體，搖床震蕩10 min后用酶標(biāo)儀測量每孔的吸光度值，以未加納米膠束的孔為對照組計算細(xì)胞成活率。

2結(jié)果

2.1共聚物PEG-PEI-PBLG的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其納米膠束表征為驗證合成共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，用1H NMR對PEG-PEI和PEG-PEI-PBLG進行了表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEG-PEI-PBLG的1H NMR譜中，除PEG和PEI的質(zhì)子化學(xué)位移峰外(圖1A)，還在化學(xué)位移為7.24、5.09和4.0處觀察到PBLG中不同基團中質(zhì)子的信號(圖1B)，這些信息確認(rèn)了PEG-PEI-PBLG的成功合成。PEG-EPI-PBLG具有在水相中自組裝形成納米膠束的能力，其臨界膠束濃度約為4 mg/L。PEG-PEI-PBLG納米膠束粒徑分布較窄，集中于20～100 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為55 nm，zeta電位+47.8 mV，形狀為近球形(圖1C、1D)。TEM照片中粒徑比DLS法測得的要小一些，這是由親水性成分(PEG和PEI)在TEM樣品制備中干燥收縮造成的。

2.2PEG-PEI-PBLG納米膠束裝載DOX和Bcl-2 siRNA的性能納米膠束裝載DOX的載藥量和載藥效率分別為15.1%和88.7%，裝載DOX后納米膠束粒徑增大，平均粒徑約為114 nm，形貌維持不變(圖2A、2B)。凝膠電泳實驗結(jié)果表明，空白和載DOX納米膠束壓縮Bcl-2 siRNA的能力均隨N/P比增加而增強，完全阻滯時的N/P比分別為32和64(圖2C)。裝載DOX后，納米膠束壓縮siRNA的能力略有下降。與對照NaCl溶液相比，PEG-PEI-PBLG溶液具有很強的質(zhì)子緩沖能力，表明其PEI組分保持了PEI優(yōu)異的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”(圖2D)。按N/P比為64裝載siRNA后，近球形的納米膠束平均粒徑降至93 nm(圖2E、2F)，zeta電位降至+30 mV。

圖1共聚物PEG-PEI-PBLG及其納米膠束表征

Fig.1 Characterizations of PEG-PEI-PBLG copolymer and its self-assembled nanomicelles

A：PEG-PEI的1H NMR譜；B：PEG-PEI-PBLG的1H NMR譜；C：納米膠束粒徑分布；D：納米膠束TEM照片。

圖2PEG-PEI-PBLG納米膠束裝載DOX和Bcl-2 siRNA的能力

Fig.2 Loading capacity of DOX and Bcl-2 siRNA by the PEG-PEI-PBLG nanomicelles

A：載DOX納米膠束的粒徑分布；B：載DOX納米膠束的TEM照片；C：空白膠束(上)和載DOX膠束(下)復(fù)合siRNA后的凝膠電泳結(jié)果；D：PEG-PEI-PBLG質(zhì)子緩沖能力；E：載DOX/siRNA納米膠束的粒徑分布；F：載DOX/siRNA納米膠束的TEM照片。

2.3載DOX/siRNA納米膠束的體外藥物釋放行為為探究載DOX/siRNA納米膠束的藥物釋放動力學(xué)，測試了正常生理pH值(7.4)和模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸性pH值(5.0)時的釋放速度(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOX和Bcl-2 siRNA的釋放行為均具有pH敏感性，即pH 5.0時的釋放速度均大于pH 7.4時的，其中Bcl-2 siRNA釋放速度對pH值的敏感性更大。

2.4載DOX/siRNA納米膠束被MCF-7乳腺癌細(xì)胞攝取情況為探究載DOX/Bcl-2 siRNA納米膠束被MCF-7細(xì)胞攝取情況，MCF-7細(xì)胞經(jīng)載DOX/Bcl-2 siRNA的納米膠束處理4 h和24 h后用CLSM觀察(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞處理4 h后就能在細(xì)胞核及其周圍觀察到DOX的紅色熒光和FAM-siRNA的綠色熒光，說明納米膠束能被細(xì)胞有效攝取；處理24 h后，紅色熒光和綠色熒光明顯增強并已分開，細(xì)胞核上聚集的DOX增多，表明DOX和Bcl-2 siRNA已從納米膠束中釋放出來。

2.5載DOX/Bcl-2 siRNA納米膠束的細(xì)胞毒性為評價DOX和Bcl-2 siRNA的協(xié)同抗癌作用，用MTT比色法比較了空白、載DOX和載DOX/Bcl-2 siRNA三種納米膠束對MCF-7細(xì)胞的毒性(圖5)。主要結(jié)果為空白、載DOX和載DOX/Bcl-2 siRNA三種納米膠束處理24 h后細(xì)胞存活率分別為(99.4±2.5)%、(82.3±3.1)%和(56.7±2.8)%，而處理48 h后細(xì)胞存活率分別為(101.6±3.2)%、(62.2±4.3)%和(38.6±2.2)%。通過對相同處理時間(24 h 或48 h)不同納米膠束組細(xì)胞存活率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，載DOX納米膠束組細(xì)胞存活率小于空白納米膠束組(P<0.05)，而載DOX/Bcl-2 siRNA納米膠束組細(xì)胞存活率小于空白和載DOX納米膠束組(P<0.05)。通過比較空白納米膠束組24 h和48 h時的細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，二者沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明空白膠束沒有明顯的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明Bcl-2 siRNA和DOX共同遞送可以增強DOX的細(xì)胞毒性。

圖3載DOX/Bcl-2 siRNA納米膠束在pH7.4和5.0時的藥物釋放曲線

Fig.3 Release profiles of DOX and Bcl-2 siRNA from DOX/siRNA-loaded nanomicelles

A：DOX釋放行為；B：Bcl-2 siRNA釋放行為。

圖4MCF-7乳腺癌細(xì)胞被載DOX/siRNA納米膠束處理4 h和24 h后的CLSM圖

Fig.4 CLSM images of MCF-7 cells treated with DOX/siRNA-loaded nanomicelles for 4 h and 24 h

3討論

乳腺癌是危害女性健康的主要致命性疾病之一，化療在其治療中占據(jù)重要地位?；熓峭ㄟ^具有抗癌作用的化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞達(dá)到治療目的的，然而絕大多數(shù)化療藥物存在難溶于水、缺乏腫瘤選擇性、體內(nèi)半衰期短等問題，造成毒副作用大，難以直接通過大幅提高劑量增強治療效果?；煹牧硪粋€重要問題是，腫瘤細(xì)胞在化療過程中易產(chǎn)生多重耐藥性，極大限制了化療效果。為克服上述缺點，開發(fā)納米藥物載體被視為很有前景的技術(shù)手段，這些納米載體以物理或化學(xué)方式高效裝載藥物，在提高化療藥水溶性、延長體內(nèi)循環(huán)時間、改善體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)和增強腫瘤組織靶向性等方面具有重要作用。另一方面，人們現(xiàn)已認(rèn)識到癌癥屬于基因病，針對癌細(xì)胞的基因治療已成為新的研究熱點，它有望從源頭上克服腫瘤多藥耐藥性，被認(rèn)為是攻克癌癥最有效的途徑之一。siRNA作為一種高效基因沉默技術(shù)，已成為癌癥治療研究中的熱點之一。然而，制約siRNA臨床應(yīng)用的最大障礙是體內(nèi)半衰期極短(僅為幾分鐘)和無法穿透細(xì)胞膜。盡管目前已建立起電穿孔法、超聲微泡法和注射法等，但療效并不理想。siRNA治療成功的關(guān)鍵是開發(fā)適用于siRNA的輸送體系，不僅能在體內(nèi)血液循環(huán)中保護siRNA，還要能被癌細(xì)胞有效內(nèi)化并實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。陽離子型脂質(zhì)體和聚合物為其提供了可能，與轉(zhuǎn)染效率較高的病毒類載體相比，它們在裝載能力和安全性方面優(yōu)勢突出，已成為基因物質(zhì)遞送的主要研究方向。最經(jīng)典的非病毒類基因遞送載體是PEI和脂質(zhì)體2000，其中PEI穩(wěn)定性更好。由于它們固有的陽離子表面性質(zhì)使其不能直接用于體內(nèi)，需要對其表面進行修飾如PEG化，以屏蔽表面電荷和增強穩(wěn)定性[10]。一些研究表明，將化療藥和siRNA同時裝載于納米載體中，可有效克服腫瘤耐藥性和提高化療療效[11]。然而，開發(fā)此類納米載體富有挑戰(zhàn)性，其中制備陽離子型納米膠束是一個重要方向。

圖5用空白、載DOX和載DOX/siRNA 3種納米膠束處理MCF-7細(xì)胞24 h和48 h后的MTT結(jié)果

Fig.5 Cell viability of MCF-7 cells cultured with blank, DOX-loaded and DOX/siRNA-loaded nanomicelles for 24 and 48 h measured by MTT assayDOX等量濃度為2 μg/mL，N/P比為64；與空白納米膠束組比較，*P<0.05；與空白納米膠束組和載DOX組比較，**P<0.05。

本文旨在利用陽離子型聚合物(PEG-PEI-PBLG)納米膠束同時裝載化療藥DOX和Bcl-2 siRNA并將其遞送至MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，實現(xiàn)協(xié)同抗癌作用。1H NMR譜證實了合成共聚物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，主要化學(xué)位移與文獻值一致[12-13]。在該納米膠束中，疏水段PBLG與DOX經(jīng)疏水作用自組裝形成內(nèi)核，陽離子成分PEI與Bcl-2 siRNA經(jīng)靜電作用形成復(fù)合層覆蓋于內(nèi)核上，而PEG段起到穩(wěn)定膠束和屏蔽電荷作用。判斷聚合物形成納米膠束能力及膠束穩(wěn)定性的一個重要指標(biāo)是臨界膠束濃度，其值越小意味著聚合物形成納米膠束的能力越強，在水相中的穩(wěn)定性越好。本文合成聚合物的臨界膠束濃度約為4 mg/L，說明其形成的納米膠束在濃度很低時仍能穩(wěn)定存在，在實際用作藥物載體時不會因注射時稀釋而釋放藥物。聚合物納米膠束的理化性質(zhì)如粒徑、表面電荷、化學(xué)結(jié)構(gòu)等，對藥物裝載效果、藥物釋放行為、細(xì)胞攝取行為等均有重要影響。本研究結(jié)果表明，聚合物納米膠束裝載DOX的載藥量和裝載效率分別為15.1%和88.7%，如此高的載藥效果是因為聚合物疏水成分PBLG和DOX均含有芳環(huán)，增強了自組裝過程中PBLG和DOX之間的相互作用；在N/P≥64時，納米膠束即可有效壓縮siRNA，說明納米膠束中PEI組分保持了原始PEI優(yōu)異的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[14]，這也從聚合物具有良好的質(zhì)子緩沖能力得到印證。該質(zhì)子緩沖能力主要源自PEI含有高密度的伯胺、仲胺和叔胺三種陽離子基團，這種性質(zhì)有助于納米膠束從內(nèi)涵體/溶酶體逃逸進入細(xì)胞質(zhì)，提高藥物療效和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率[15]。納米膠束裝載DOX和siRNA后呈近球形形貌，最大粒徑小于150 nm，粒徑分布范圍很窄，zeta電位為+30 mV。此時，zeta電位小于空白膠束的zeta電位，這是因為殼層中陽離子PEI復(fù)合Bcl-2 siRNA后，會降低殼層電荷暴露程度[16]。有研究證實，粒徑為20～150 nm的納米藥物載體，可在大部分實體瘤中經(jīng)EPR效應(yīng)實現(xiàn)被動靶向效果[17]，而正表面電位的納米載體更容易被細(xì)胞攝取?？梢姡疚闹械年栯x子納米膠束將具有這樣的優(yōu)點。

納米藥物載體到達(dá)靶點后釋放藥物的速度影響其療效。理想情況下，藥物釋放越快越好，這樣可以短時間內(nèi)提高靶細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度，充分發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。相對于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境中旺盛的糖酵解代謝作用，致使腫瘤細(xì)胞內(nèi)和腫瘤微環(huán)境呈酸性，它與腫瘤生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。目前，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間pH值的差異已被用以控制納米載體中藥物的釋放[19]。在本研究中，探討了納米膠束在正常生理環(huán)境(pH 7.4)和模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)酸性環(huán)境(pH 5.0)中的藥物釋放行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOX和Bcl-2 siRNA的釋放行為均具有pH敏感性，即酸性環(huán)境中的釋放速度大于正常生理環(huán)境中的；與DOX相比，Bcl-2 siRNA釋放對酸性更加敏感。分析認(rèn)為，DOX和Bcl-2 siRNA釋放的pH敏感性分別源自疏水內(nèi)核中PBLG酸降解和殼層中PEI質(zhì)子化過程。這一結(jié)果也表明，納米膠束一旦進入腫瘤細(xì)胞，將可快速釋放DOX和Bcl-2 siRNA，提高抗腫瘤效果。

為了探究納米膠束共同遞送DOX和Bcl-2 siRNA的效果，我們利用CLSM和MTT比色法分別研究了納米膠束被MCF-7乳腺癌細(xì)胞攝取情況和細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)納米膠束可被MCF-7細(xì)胞有效內(nèi)化，在用納米膠束處理4 h的細(xì)胞中就能明顯看到DOX和FAM-siRNA的熒光信號；延長處理時間，熒光信號顯著增強，且紅色熒光和綠色熒光分離明顯，紅色熒光主要集中于細(xì)胞核上。這說明，本研究的納米膠束不僅可將DOX和Bcl-2 siRNA同時遞送至MCF-7細(xì)胞內(nèi)，而且能將它們釋放出來，利于DOX到達(dá)作用靶點細(xì)胞核。近年來，siRNA和化療聯(lián)合已成為一種新的腫瘤治療方式[20]。它主要是將能下調(diào)或沉默藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白如P-糖蛋白和抗凋亡蛋白如抗Bcl-2的siRNA與化療藥聯(lián)合施用，以增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物積累或恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性，從而克服腫瘤耐藥性和提高治療效果[21-22]。本研究MTT結(jié)果提示，空白納米膠束具有良好的細(xì)胞相容性，Bcl-2 siRNA與DOX共同遞送顯著增強了DOX的細(xì)胞毒性(P<0.05)，二者之間具有協(xié)同抗癌作用。

綜上所述，本研究制備的聚合物納米膠束可同時裝載化療藥DOX和Bcl-2 siRNA，其藥物釋放行為具有pH敏感性；載藥納米膠束呈近球形形貌，粒徑小于150 nm，具有正的表面電位，可被MCF-7乳腺癌細(xì)胞有效內(nèi)化；納米膠束本身無細(xì)胞毒性，而其遞送的DOX和Bcl-2 siRNA具有協(xié)同抗癌作用，細(xì)胞毒性高于DOX?？梢姡摼酆衔锛{米膠束有望成為共同遞送化療藥和基因物質(zhì)的優(yōu)良載體。

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(編輯卓選鵬)

收稿日期：2015-08-24修回日期：2016-03-07

基金項目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(No.2013K09-27, 2011K13-01-09)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費學(xué)科綜合交叉項目(No.XJJ2013130)

通訊作者：鎖愛莉. E-mail: ailisuo@mail.xjtu.edu.cn

中圖分類號：R737.9

文獻標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604013

In vitro killing effect of doxorubicin and Bcl-2 siRNA co-delivered by polymeric nanomicelles on MCF-7 human breast cancer cells

SUO Ai-li1, WANG He-jing1, QIAN Jun-min2, LIU Rong-rong2, YAO Yu1

(1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061; 2. State Key Laboratory for Mechanical Behavior of Materials, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo prepare polymeric nanomicelles capable of simultaneously loading doxorubicin (DOX) and Bcl-2 small interfering RNA (Bcl-2 siRNA), and to explore their in vitro cytotoxicity and cellular uptake in MCF-7 human breast cancer cells. MethodsCopolymer poly(ethylene glycol)-g-polyethylenimine-g-poly(γ-benzyl-L-glutamate) was synthesized by the combination of reductive amination and carbodiimide methods, and its chemical structure was verified by1H NMR. Empty and drug-loaded copolymeric nanomicelles were prepared by dialysis method and characterized by transmission electron microscope and dynamic light scattering. The ability of the nanomicelles to compress Bcl-2 siRNA was measured by by agarose gel electrophoresis method. The release profiles of DOX and Bcl-2 siRNA from the nanomicelles were explored by means of fluorescence spectrometry and dialysis method. The in vitro cytotoxicity and cellular uptake of DOX and Bcl-2 siRNA co-loaded nanomicelles in MCF-7 human breast cancer cells were characterized by MTT assay and confocal laser scanning microscopy, respectively. ResultsThe critical micelle concentration of the copolymer was about 4 mg/L, and the sizes of self-

assembled empty and drug-loaded nanomicelles were smaller than 200 nm. The drug-loading efficiency and drug-loading content of DOX in the nanomicelles were 88.7% and 15.1%, respectively. The DOX-loaded nanomicelles could efficiently compress Bcl-2 siRNA when an N/P ratio was ≥64. The zeta potential of DOX and Bcl-2 siRNA co-loaded nanomicelles was +30 mV. The release behavior of the cargoes from the nanomicells was pH-sensitive, and the release of Bcl-2 siRNA was more sensitive to acidic pH than that of DOX. The nanomicelles could simultaneously deliver DOX and Bcl-2 siRNA into MCF-7 cells, and the co-delivered DOX and Bcl-2 siRNA significantly increased the cytotoxicity of DOX (P<0.05). ConclusionThe polymeric nanomicelles can co-load DOX and Bcl-2 siRNA and deliver them into MCF-7 cells, and DOX in combination with Bcl-2 siRNA can synergistically inhibit the growth of MCF-7 cells and promote cell apoptosis, suggesting that the nanomicells may be a promising carrier for the co-delivery for chemotherapeutics and genes.

KEY WORDS:nanomicelle; chemotherapy; Bcl-2 siRNA; combination therapy; breast cancer; MCF-7 cell; cellular uptake

Supported by the Scientific and Technological Research and Development Project of Shaanxi Province (No.2013K09-27, 2011K13-01-09) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No.XJJ2013130)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.0849.004.html(2016-06-15)