vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株MHC-1類分子抗原加工提呈“操縱子”表達(dá)的影響

任艷鑫，楊　潔，孫瑞梅，趙留芳，李　磊，張世文，費(fèi)繼敏，尚藝泰，李舟蕾，李曉江

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，云南昆明　650118)

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◇基礎(chǔ)研究◇

vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株MHC-1類分子抗原加工提呈“操縱子”表達(dá)的影響

任艷鑫，楊潔，孫瑞梅，趙留芳，李磊，張世文，費(fèi)繼敏，尚藝泰，李舟蕾，李曉江

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，云南昆明650118)

摘要：目的研究病毒白介素-10(vIL-10)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株MHC-1類分子抗原加工提呈“操縱子”表達(dá)的影響。方法收集不同時(shí)間段vIL-10處理的鼻咽癌細(xì)胞(CNE-1和CNE-2)，采用RT-PCR、Western blot方法檢測(cè)vIL-10處理的鼻咽癌細(xì)胞中MHC-1類分子抗原加工提呈“操縱子”(TAP-1、2，LMP-2、7及HLA-I)表達(dá)的變化。結(jié)果①mRNA水平：CNE-1和CNE-2的TAP-1水平在不同時(shí)間點(diǎn)均未表現(xiàn)出顯著差異；vIL-10作用1、4、6、12 h時(shí)，CNE-1和CNE-2的TAP-2、LMP-2均未出現(xiàn)變化，24 h時(shí)，兩者均出現(xiàn)顯著下降甚至消失；CNE-1在vIL-10作用后4 h即出現(xiàn)LMP-7下降，而CNE-2在vIL-10作用后6 h出現(xiàn)下降；在vIL-10作用24 h時(shí)CNE-1和CNE-2的HLA-I出現(xiàn)顯著下降。②蛋白水平：vIL-10作用后24 h時(shí)，兩種細(xì)胞的TAP-1均出現(xiàn)顯著下降，TAP-2則在vIL-10作用后1、6、12、24 h出現(xiàn)逐漸下降；CNE-2的LMP-2、LMP-7在vIL-10作用后隨時(shí)間逐漸下降，而CNE-1的兩種蛋白僅在作用后12 h出現(xiàn)顯著下降；HLA-I在vIL-10作用后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在CNE-1中各時(shí)間段變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CNE-2在24 h 顯著下降。結(jié)論vIL-10可明顯抑制鼻咽癌MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”的表達(dá)，并且呈一定的時(shí)間依賴性。

關(guān)鍵詞：鼻咽腫瘤；病毒白介素-10；抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(TAP)；低分子量多肽復(fù)合物(LMP)；人類白細(xì)胞抗原-I(HLA-I)

抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(transporter associated with antigen processing, TAP)主要功能是與低分子量多肽復(fù)合物-2、7(1ow molecular mass polypeptide, LMP-2、7)一起加工、轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性抗原肽(其中包括腫瘤抗原)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)(主要是HLA-I)結(jié)合抗原肽后將其呈遞至細(xì)胞表面供CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)識(shí)別，從而啟動(dòng)細(xì)胞免疫。由于MHC-I類基因、TAP基因、LMP-2及LMP-7基因位置靠近，轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)受干擾素的誘導(dǎo)，能夠協(xié)調(diào)三者基因產(chǎn)物的量，有效提呈抗原，故三者構(gòu)成的系統(tǒng)被比喻成真核生物MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”，其主要作用是將外源性抗原提呈并激活CD8+CTL，啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫。在一系列抗原呈遞過程中，無論哪個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都會(huì)影響腫瘤抗原的提呈，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫殺傷。其中人們比較關(guān)注的是TAP基因表達(dá)的調(diào)控。TAP-1啟動(dòng)子是593 bp的雙向啟動(dòng)子，包含IFN-r反應(yīng)元件、P53反應(yīng)元件和NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。其中任何異常調(diào)節(jié)反應(yīng)元件及影響NF-κB的因素都可以引起TAP基因的表達(dá)異常，從而影響抗原加工和提呈的“操縱子”，最終引起腫瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)異常[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、頭頸惡性腫瘤及腦惡性腫瘤中都有TAP-1、LMP-2、LMP-7及HLA-I的缺失或下調(diào)，轉(zhuǎn)染TAP-1后可誘導(dǎo)LMP-2、LMP-7及HLA-I表達(dá)的增加[2-5]。TAP的表達(dá)可以被某些細(xì)胞因子[如干擾素(interferon, IFN)-γ、IFN-α和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α]和脂多糖等誘導(dǎo)，TAP表達(dá)上調(diào)與MHC-I類分子遞呈和CTL殺傷功能的增強(qiáng)密切相關(guān)，IFN-γ作用12 h后TAP-1和TAP-2的mRNA可上調(diào)10～20倍，IL-10會(huì)導(dǎo)致TAP轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的下調(diào)，從而引起MHC-I類分子表達(dá)下調(diào)[6]。同時(shí)，SCHOTTELIUS等[7]發(fā)現(xiàn)IL-10通過抑制FN-κB通路中IκBa的活性從而抑制NF-κB的激活，限制其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7及HLA-I存在表達(dá)下調(diào)或缺失[8]。在鼻咽癌新鮮組織中檢測(cè)到高表達(dá)的病毒白介素-10(vIL-10)，并且認(rèn)為vIL-10可以導(dǎo)致鼻咽癌患者免疫細(xì)胞出現(xiàn)偏移，表現(xiàn)為免疫抑制[9]。為驗(yàn)證vIL-10是否通過抑制MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”的功能來實(shí)現(xiàn)其免疫抑制作用，本文通過RT-PCR、Western bolt檢測(cè)vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株MHC-I類分子抗原加工和提呈的“操縱子”表達(dá)的影響，探討vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞免疫抑制的影響及可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株及vIL-10人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2由云南省腫瘤研究所饋贈(zèng)，CNE-1細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心饋贈(zèng)。Recombinant Viral HCMV IL-10購自美國R&D Systems 。

1.2主要試劑組織蛋白裂解液(RIPA)、PMSF、300 g/L丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液、1 mol/L Tris-HCl緩沖液、100 g/L過硫酸銨、Tween 20、Tris(相對(duì)分子質(zhì)量121.14)、甘氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量75.07)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、麗春紅均購自北京Solarbio公司，TEMED(FW：116.2)購自美國Sigma公司，ECL顯色液購自美國Millipore公司，蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)購自北京普利萊。

1.3鼻咽癌細(xì)胞株的培養(yǎng)CNE-1、CNE-2培養(yǎng)于含100 mL/L FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞均置于37 ℃、含50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4vIL-10配制取0.02 g BSA加入20 mL PBS中，使其終濃度為1 g/L。取250 μL 1 g/L BSA液，加入25 μg vIL-10，使vIL-10的濃度為100 μg/mL。將制備的vIL-10分裝，-20 ℃保存。

1.5RT-PCR檢測(cè)TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7和HLA-I mRNA的表達(dá)收獲細(xì)胞按照試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)下測(cè)A260 nm及A280 nm處的吸光度(A值)。計(jì)算A260/A280的比值，留取比值在1.8～2.0的樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RNA定量：RNA濃度(μg/mL)=A260×40×100。逆轉(zhuǎn)錄具體步驟參考文獻(xiàn)[10]，各個(gè)基因引物序列見表1。

1.6免疫印跡法檢測(cè)TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7和HLA-I蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞并裂解，按照試劑盒提供的方法提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白(25 μg)樣品進(jìn)行100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，濕法電轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶室溫封閉1 h，加入一抗室溫孵育0.5 h后4 ℃過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，顯影、定影。

表1各個(gè)基因引物序列

Tab.1The primers for individual genes

基因引物序列GAPDH上游:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'下游:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'TAP-1上游:5'-ACCCTACCGCCTTCGTTGT-3'下游:5-TGAGCCATCTTGTAGAATCCAGTC-3'TAP-2上游:5'-CTGCGAAGATGATAAGGTGATG-3'下游:5'-GCCAGACGTTGTTTCTGTCC-3'LMP-2上游:5'-TTGTGATGGGTTCTGATTCCCG-3'下游:5'-CAGAGCAATAGCGTCTGTGG-3'LMP-7上游:5'-TCGCCTTCAAGTTCCAGCATGG-3'下游:5'-CCAACCATCTTCCTTCATGTGG-3'HLA-I上游:5'-CCTACGACGGCAAGGATTACA-3'下游:5'-ACATCACGGCAGCGACCA-3'

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，mRNA及蛋白條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得出數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鼻咽癌細(xì)胞株TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7和HLA- ImRNA表達(dá)的變化實(shí)驗(yàn)中CNE-1、2細(xì)胞株生長(zhǎng)良好，加入vIL-10并未影響各組細(xì)胞的形態(tài)、貼壁時(shí)間及傳代周期。前期實(shí)驗(yàn)我們分別將不同濃度vIL-10(10、20、50、100 ng/mL)加入細(xì)胞株中觀察，發(fā)現(xiàn)濃度為50 ng/mL的vIL-10對(duì)TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7及HLA-I的mRNA水平發(fā)生顯著影響。因此，本實(shí)驗(yàn)中用50 ng/mL的vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株進(jìn)行處理，并分別在vIL-10作用1、4、6、12、24 h，采用RT-PCR方法檢測(cè)TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7及HLA-I的mRNA水平。結(jié)果顯示：①CNE-1和CNE-2的TAP-1 mRNA水平在不同時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異；②vIL-10作用1、4、6、12 h時(shí)，CNE-1和CNE-2的TAP-2 mRNA沒有明顯變化，但在24 h時(shí)TAP-2顯著下降甚至消失(P<0.05)；③與TAP-2相似，LMP-2 mRNA在前4個(gè)時(shí)間段均未顯示變化，在24 h時(shí)CNE-1的LMP-2 mRNA下降(P<0.05)，CNE-2的LMP-2 mRNA甚至消失(P<0.05)；④CNE-1細(xì)胞在vIL-10作用后4 h即出現(xiàn)LMP-7 mRNA下降，12、24 h時(shí)升高，而CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用6 h后出現(xiàn)下降，12、24 h維持在該水平未出現(xiàn)進(jìn)行性下降；⑤HLA-I mRNA變化與TAP-2相似，在12 h以前均沒有明顯變化，24 h時(shí)CNE-1和CNE-2的HLA-I水平出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)(圖1)。

圖1 vIL-10(50ng/mL)在不同時(shí)間段對(duì)鼻咽癌“操縱子”mRNA水平的影響Fig.1InfluenceofvIL-10on“theoperon”mRNAlevelinnasopharyngealcarcinomacelllinesatvarioustimepointsA:RT-PCR分析。1:鼻咽癌細(xì)胞CNE-1;2:CNE-2。B:RT-PCR結(jié)果灰度分析。與1、4、6、12h比較,*P<0.05;與1h比較,#P<0.05。

2.2鼻咽癌細(xì)胞株TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7及HLA-I蛋白表達(dá)的變化分別用50 ng/mL vIL-10作用CNE-1和CNE-2 1、6、12、24 h，采用Western Blot方法檢測(cè)TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7及HLA-I的蛋白表達(dá)。 結(jié)果顯示：①CNE-1在vIL-10作用后6 h時(shí)，TAP-1蛋白水平出現(xiàn)略微下降，12 h時(shí)有所上升，24 h時(shí)再次出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后6、12 h時(shí)，TAP-1水平比1 h增高，在24 h時(shí)顯著下降(P<0.05)。②CNE-1和CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后1、6、12、24 h，TAP-2蛋白水平逐漸下降(P<0.05)。③vIL-10作用CNE-1細(xì)胞后，LMP-2蛋白水平在12 h時(shí)出現(xiàn)顯著下降，24 h又升高，而在CNE-2細(xì)胞中則表現(xiàn)為逐漸下降趨勢(shì)(P<0.05)。④LMP-7蛋白在vIL-10作用CNE-1細(xì)胞后的變化與LMP-2相似，在12 h時(shí)顯著下降，24 h又升高；CNE-2細(xì)胞中LMP-7蛋白水平變化與LMP-2一致，均表現(xiàn)為逐漸下降(P值均<0.05)。⑤CNE-1和CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后，HLA-I出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在CNE-1細(xì)胞中各時(shí)間段變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，CNE-2細(xì)胞在24 h顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余時(shí)間段變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 vIL-10(50ng/mL)在不同時(shí)間段對(duì)鼻咽癌“操縱子”蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2InfluenceofvIL-10on“theoperon”proteinlevelinnasopharyngealcarci-nomacelllinesatvarioustimepointsA:Westernblot分析。1:鼻咽癌細(xì)胞CNE-1;2:CNE-2。B:Westernblot結(jié)果灰度分析。

3討論

腫瘤抗原肽是腫瘤免疫治療的一大熱點(diǎn)[11-13]，腫瘤表面的抗原肽是腫瘤抗原經(jīng)過內(nèi)源性或外源性加工處理并呈遞至細(xì)胞膜與MHC分子結(jié)合的短肽，是機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。HLA-I類分子表達(dá)下調(diào)是腫瘤細(xì)胞逃逸細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷作用的主要機(jī)制之一。鼻咽癌患者EB病毒感染可以使細(xì)胞免疫功能明顯受到抑制，其重要原因是腫瘤細(xì)胞的MHC分子結(jié)合的抗原低表達(dá)或者不表達(dá)[14]。腫瘤細(xì)胞中一個(gè)或者多個(gè)抗原提呈分子如TAP-1、TAP-2、LMP-2及LMP-7等下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞膜表面的HLA-I類分子復(fù)合物表達(dá)下調(diào)，從而逃避T淋巴細(xì)胞殺傷作用。

3.1vIL-10對(duì)TAPs在鼻咽癌中表達(dá)的作用TAP廣泛分布于原核與真核細(xì)胞中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)離子、小分子物質(zhì)、多肽及蛋白質(zhì)等物質(zhì)以非分泌途徑通過細(xì)胞膜。TAP主要基因產(chǎn)物有TAP-1和TAP-2，TAP-1和TAP-2形成異二聚體定位并穿透內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，形成一個(gè)通道幫助抗原肽從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以便HLA-I類分子和抗原肽形成復(fù)合物并表達(dá)于細(xì)胞表面供CTL識(shí)別，同時(shí)TAP還協(xié)助HLA-I類分子的表達(dá)。在有一些缺乏TAP的突變細(xì)胞系，HLA-I類分子對(duì)抗原肽的捕獲能力大大下降，從而使細(xì)胞表面的HLA-I類分子表達(dá)降低，盡管一些HLA-I類分子能夠離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞表面，但它們大多數(shù)是空載的，而且很快降解。許多腫瘤常通過TAP表達(dá)的降低或缺失，使MCH-I類分子限制的抗原遞呈途徑受損或缺失，這成為腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞逃避監(jiān)視的重要機(jī)制。YANG等[15]發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞SK-MEL-19細(xì)胞株存在TAP-1和HLA-I表達(dá)缺失，SK-MEL-19細(xì)胞的TAP-1基因1 489位點(diǎn)(也正是外顯子7所在位置)缺失導(dǎo)致其表達(dá)異常，即使IFN-γ可誘導(dǎo)激活TAP-1基因，但是TAP-1 mRNA也無法表達(dá)，也不可能促進(jìn)HLA-I的表達(dá)上調(diào)。ZEIDLER等[6]把B淋巴細(xì)胞與未處理的B95.8細(xì)胞(絨猴EB病毒轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞株)上清液一起培養(yǎng)，TAP-1基因表達(dá)出現(xiàn)下降，而與EB病毒陰性的伯基特淋巴瘤細(xì)胞上清一起培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞的TAP-1基因表達(dá)無明顯下降，因此推測(cè)可能是EB病毒基因BCRF-1編碼的vIL-10引起TAP-1表達(dá)下降。本研究中CNE-1和CNE-2均在vIL-10作用24 h時(shí)TAP-1蛋白出現(xiàn)顯著下降，與ZEIDLER等[6]實(shí)驗(yàn)中描述的時(shí)間存在差異，這可能是本研究用商品化vIL-10，純度比較高，作用直接、顯著，而ZEIDLER是利用攜帶hIL-10或vIL-10基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos7 cells，收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清液得到的，濃度及純度無法保證。而且兩組實(shí)驗(yàn)作用目的細(xì)胞不一樣，細(xì)胞表面IL-10受體分布存在差異，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2vIL-10對(duì)LMPs在鼻咽癌中表達(dá)的作用LMP-2和LMP-7參與非溶酶體蛋白水解途徑，具有各自的水解活性，可將內(nèi)源性抗原降解為5～15個(gè)氨基酸的短肽，在熱休克蛋白的協(xié)助下與抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體TAP-1和TAP-2組成的異二聚體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行氨基端的修飾后與MHC-I類分子結(jié)合，經(jīng)高爾基體在細(xì)胞表面共同被CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。

LMP-2、LMP-7基因的某些變化會(huì)改變肽段羧基端氨基酸的性質(zhì)，進(jìn)而對(duì)抗原處理和提呈過程起到限制性作用。在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)LMP基因存在堿基缺失或表達(dá)下調(diào)，不能產(chǎn)生適合與MHC-I類分子結(jié)合的短肽，導(dǎo)致MHC-I類分子在腫瘤細(xì)胞表面的數(shù)量下降，降低細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，從而逃避免疫監(jiān)視。大多數(shù)研究者認(rèn)為L(zhǎng)MP表達(dá)下調(diào)預(yù)示著患者的不良預(yù)后[16]。

LMPs基因表達(dá)受到各種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，正向性刺激作用的因子包括TNF-a、IFN-γ、粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-4，負(fù)向細(xì)胞因子為IL-10[17]。本研究發(fā)現(xiàn)vIL-10對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的LMPs表達(dá)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，LMP-7 mRNA在CNE-1與CNE-2細(xì)胞株下調(diào)時(shí)間有差異，而且LMP-2、LMP-7蛋白表達(dá)在CNE-1與CNE-2間表達(dá)也不同步，我們認(rèn)為可能與兩種細(xì)胞株特性存在差異相關(guān)。CNE-1來源于高分化鱗狀細(xì)胞癌，而CNE-2來源于低或未分化鱗狀細(xì)胞癌，兩者生物學(xué)特性存在差異。SELIGER[17]認(rèn)為L(zhǎng)MPs基因表達(dá)任何時(shí)段都可能受到影響，這些因素包括基因結(jié)構(gòu)的改變，外在因素導(dǎo)致表達(dá)失調(diào)，轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。作者在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和惡性黑色素瘤中檢測(cè)到LMPs表達(dá)下調(diào)，這些基因既有點(diǎn)突變也有堿基缺失。MEISSNER等[18]研究發(fā)現(xiàn)頭頸部惡性腫瘤中抗原提呈體(antigen processing machinery, APM)分子表達(dá)異常主要原因是外在因素引起的異常調(diào)節(jié)而不是基因結(jié)構(gòu)改變引起的。本文中vIL-10可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)LMPs的表達(dá)，并未改變其基因結(jié)構(gòu)。

3.3vIL-10對(duì)HLA-I在鼻咽癌中表達(dá)的作用HLA即人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen)，其編碼基因稱為HLA復(fù)合體，HLA-I類分子由重鏈(a鏈)和β2微球蛋白(β2m)輕鏈組成，分布在幾乎所有的有核細(xì)胞表面。CD8+CTL是機(jī)體抗腫瘤的主要效應(yīng)細(xì)胞，它的激活是通過TCR識(shí)別HLA-I類分子及其遞呈的內(nèi)源性腫瘤特異抗原肽來實(shí)現(xiàn)的。HLA-I正常表達(dá)有助于CD8+CTL識(shí)別特定抗原肽而殺傷腫瘤細(xì)胞。目前的研究顯示多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞表面HLA-I類分子低表達(dá)或表達(dá)缺失，而且其發(fā)生頻率隨腫瘤細(xì)胞來源不同而不同(16%～50%)[19]。因此，HLA-I類分子低表達(dá)或不表達(dá)不能有效激活特異性CD8+CTL而造成腫瘤免疫逃逸。

本研究CNE-1和CNE-2細(xì)胞在vIL-10作用后，在mRNA水平上，CNE-1和CNE-2的HLA-I水平在1、6、12 h時(shí)間段均無明顯變化，24 h時(shí)出現(xiàn)顯著下降。在蛋白水平上，只有CNE-2細(xì)胞在24 h出現(xiàn)顯著下降，說明vIL-10對(duì)CNE-2細(xì)胞HLA-I的表達(dá)具有抑制作用，但是較其他APM分子(TAP-1、TAP-2、LMP-2、LMP-7)變化時(shí)間較晚。目前尚無vIL-10對(duì)HLA-I表達(dá)影響的相關(guān)報(bào)道。RODRGUEZ等[20]用免疫組化檢測(cè)63例宮頸癌和Ⅲ度宮頸上皮內(nèi)瘤變組織標(biāo)本中HLA-I和IL-10的變化，發(fā)現(xiàn)50/59例HLA-I表達(dá)缺失或降低，IL-10陽性率達(dá)46.6%，并且IL-10表達(dá)與HLA-I下調(diào)呈正相關(guān)(P=0.028)，作者認(rèn)為在宮頸癌中IL-10可以通過下調(diào)HLA-I的表達(dá)抑制機(jī)體免疫應(yīng)答。YUE等[21]原代培養(yǎng)14株來自原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細(xì)胞，其中12株細(xì)胞表達(dá)IL-10受體，黑色素瘤細(xì)胞可以自分泌IL-10并通過其受體抑制細(xì)胞表面HLA-I、HLA-Ⅱ及細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)，抑制率達(dá)10%～60%，進(jìn)而促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。vIL-10與IL-10具有83%的同源性，可發(fā)揮IL-10的免疫抑制作用。因此，我們認(rèn)為vIL-10可以抑制腫瘤細(xì)胞表面HLA-I的表達(dá)，但是可能不具有直接抑制作用，而是通過抑制APM分子表達(dá)發(fā)揮其作用。

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(編輯邱芬)

收稿日期：2015-10-19修回日期：2015-12-21

基金項(xiàng)目：2013年國家自然科學(xué)基金(No.81260312)；2014年云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)(No.2014FZ037)；2012年云南省衛(wèi)生科技內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)項(xiàng)目資助(No.2012WS0035)；2014年昆明市西山區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.西科字50號(hào))

通訊作者：李曉江. E-mail: wingman11@163.com

中圖分類號(hào)：R739.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604011

Effects of vIL-10 on MHC-I antigen processing “the operon” in nasopharyngeal carcinoma cell lines

REN Yan-xin, YANG Jie, SUN Rui-mei, ZHAO Liu-fang, LI Lei, ZHANG Shi-wen,FEI Ji-min, SHANG Yi-tai, LI Zhou-lei, LI Xiao-jiang

(Department of Head and Neck, the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University;Tumor Research Center of Yunnan Province, Kunming 650118, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effects of virus interleukin-10(vIL-10) on different expressions of MHC-I antigen processing “the operon”. MethodsWe collected nasopharyngeal carcinoma cells (CNE-1 and CNE-2) treated by vIL-10 at different time points, and detected the changes of MHC-I antigen processing “the operons” (TAP-1, TAP-2，LMP-2, LMP-7 and HLA-I) by RT-PCR and Western blot. Results① mRNA level: There was no difference in the expression of TAP-1 in CNE-1 and CNE-2 cells at various time points. The expressions of TAP-2 and LMP-2 in CNE-1 and CNE-2 did not change at 1, 4, 6, 12 h, but downregulated and even disappeared at 24 h. The expression of LMP-7 in CNE-1 decreased 4 h after vIL-10 was added, and that in CNE-2 decreased at 6 h. The expression of HLA-I in CNE-1 and CNE-2 showed significant decrease at 24 h. ② Protein expression: The expression of TAP-1 in CNE-1 and CNE-2 showed significant decrease at 24 h. The expression of TAP-2 in CNE-1 and CNE-2 was gradually downregulated at different time points. The expressions of LMP-2 and LMP-7 in CNE-2 were gradually downregulated at different periods, while that in CNE-1 was only decreased at 12 h. The expression of HLA-I in CNE-1 and CNE-2 was gradually downregulated, but there was no significant difference at each period in CNE-1, while the expression of HLA-I in CNE-2 at 24 h was significantly downregulated. ConclusionvIL-10 can inhibit the expression of MHC-I antigen processing “the operon” in NPC in the time-dependent manner.

KEY WORDS:nasopharyngeal carcinoma (NPC); virus interleukin-10; transporter associated with antigen processing (TAP); low molecular mass polypeptide (LMP); human leukocyte antigen I (HLA-I)

Supported bythe National Natural Science Foundation of China (No.81260312), Joint Project of Basic Application Research of Science and Technology Department of Yunnan Province and Kunming Medical University (No.2014FZ037), Science and Health Research Institutes Foundation of Yunnan Province (No.2012WS0035), and Key Medical Project of Xishan District of Kunming City Science and Technology Bureau

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0934.012.html(2016-06-08)