低氧誘導(dǎo)因子在肝肺綜合征大鼠肺組織中的表達(dá)及其與糖調(diào)節(jié)蛋白78的關(guān)系

李旭炯，張慧英，田小霞，陳云霞，孟　莉，來(lái)麗娜，趙中夫，韓德五，Cheng Ji

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院：1. 生理學(xué)教研室；2. 病理生理學(xué)教研室；3. 微生物學(xué)教研室；4. 藥理學(xué)教研室；5. 肝病研究所，山西長(zhǎng)治　046000；6. 山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西太原　030001；7. 美國(guó)南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉機(jī)　90089)

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◇基礎(chǔ)研究◇

低氧誘導(dǎo)因子在肝肺綜合征大鼠肺組織中的表達(dá)及其與糖調(diào)節(jié)蛋白78的關(guān)系

李旭炯1，張慧英2，田小霞2，陳云霞3，孟莉3，來(lái)麗娜4，趙中夫5，韓德五6，Cheng Ji7

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院：1. 生理學(xué)教研室；2. 病理生理學(xué)教研室；3. 微生物學(xué)教研室；4. 藥理學(xué)教研室；5. 肝病研究所，山西長(zhǎng)治046000；6. 山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西太原030001；7. 美國(guó)南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉機(jī)90089)

摘要：目的探討低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在大鼠肝肺綜合征(HPS)發(fā)病中的作用及其與糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的關(guān)系。方法復(fù)合致病因素法制備HPS大鼠模型。Western blotting法檢測(cè)肺組織HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子164(VEGF164)及GRP78蛋白表達(dá)水平。免疫組化染色法觀(guān)察肺組織VEGF受體2(VEGFR-2)及CD105的表達(dá)。結(jié)果模型組動(dòng)物肺組織HIF-1α蛋白表達(dá)水平在第8周顯著高于同期正常對(duì)照組及4周、6周組；GRP78蛋白表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸升高，至第8周達(dá)到最高水平，各時(shí)間點(diǎn)之間以及與同期正常對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；VEGF164蛋白表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸增加，至6周達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于同期正常對(duì)照組，6周和8周表達(dá)水平顯著高于4周；VEGFR-2及CD105免疫組化染色強(qiáng)度和數(shù)量均隨HPS進(jìn)展逐漸增高；GRP78分別與VEGF164、VEGFR-2及CD105的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，HIF-1α與GRP78亦呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論HIF-1α可能在HPS發(fā)病中起一定作用，與GRP78共同促進(jìn)了肺微血管重構(gòu)。

關(guān)鍵詞：肝肺綜合征；低氧誘導(dǎo)因子-1α；糖調(diào)節(jié)蛋白78；肝硬化；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)是生物體內(nèi)維持氧穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子[1]。低氧情況下，HIF-1α靶向調(diào)節(jié)諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)等多種下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，在血管形成及通透性變化、炎癥反應(yīng)、凋亡等生理以及病理過(guò)程中起著重要的作用[2-3]。

低氧血癥是肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)的重要臨床特征。我們前期研究表明，在HPS發(fā)病過(guò)程中，由肝臟功能障礙形成的腸源性?xún)?nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia, IETM)，一方面使巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集于肺組織繼而活化，釋放大量炎性細(xì)胞因子及血管活性因子如NO、CO、內(nèi)皮素-1等，對(duì)肺組織造成嚴(yán)重?fù)p害，進(jìn)而促進(jìn)肺微血管的異常擴(kuò)張[4-5]；同時(shí)引起肺組織的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)GRP78-VEGF途徑促進(jìn)肺微血管的重構(gòu)[6]，從而導(dǎo)致低氧血癥的發(fā)生。由于缺氧也是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要應(yīng)激原，而活性氧和內(nèi)皮素等也可以激發(fā)HIF-1α的表達(dá)[1]，故而我們推測(cè)HIF-1可能在HPS的發(fā)病過(guò)程中起一定的作用。因此，本項(xiàng)研究仍然在以復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的大鼠HPS模型上，著重觀(guān)察HPS發(fā)病過(guò)程中HIF-1α的表達(dá)變化，以及與GRP78在促進(jìn)VEGF表達(dá)中的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示HPS的發(fā)病機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物的使用及所有進(jìn)行的操作均符合本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.2主要試劑多克隆兔抗大鼠GRF78、VEGF164、VEGF受體2(VEGFR-2)抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司；HIF-1α小鼠單克隆抗體、β-Tubulin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及SuperECL Plus超敏發(fā)光液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；CD105抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與模型建立雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control)和HPS模型組各18只。正常對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，模型組采用復(fù)合致病因素法[7]進(jìn)行制備。各組動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水。分別于實(shí)驗(yàn)4、6、8周末各組隨機(jī)選取6只動(dòng)物，禁食過(guò)夜，30 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉(0.1 mL/100 g體質(zhì)量)，無(wú)菌、無(wú)內(nèi)毒素條件下腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min，吸取血漿備用；摘取部分肺組織于100 mL/L中性甲醛溶液中固定，用于組織學(xué)研究。其余組織立即置于液氮中凍存。

1.2.2Western blotting法檢測(cè)肺組織中GRP78、HIF-1α及VEGF164蛋白表達(dá)將肺組織樣本通過(guò)液氮研磨破碎后溶解在PBS中，4 ℃離心除去沉淀取上清，加入至終濃度為1 mmol/L的苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)；測(cè)定蛋白濃度(BradfordProtein Assay Kit，上海生物工程有限公司)，將不同樣本相同的蛋白量(20 μg)均調(diào)整到20 μL上樣，跑60 g/L SDS-PAGE膠。LAS-4000型熒光/化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Fiji film)顯影?？贵w濃度：β-Tubulin(1∶1 000)，HIF-1α(1∶500)，GRP78(1∶300)，VEGF164(1∶500)。以β-Tubulin為內(nèi)參照。采用Image-Pro Plus7.0圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.3免疫組化法檢測(cè)肺組織VEGFR-2和CD105的表達(dá)制備4 μm肺組織切片，常規(guī)脫蠟至水，30 mL/L H2O2室溫下15 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，并行抗原修復(fù)。PBS沖洗，50 mL/L胎牛血清(BSA)封閉20 min，分別滴加一抗(1∶500)，4 ℃過(guò)夜。依次操作順序加入二抗及SABC，室溫DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后鏡檢。棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性顆粒。每張切片選取10個(gè)高倍視野(×400)，采用Image-Pro Plus7.0圖像分析軟件半定量分析，分別計(jì)算平均吸光度值，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1肺組織HIF-1α、GRP78及VEGF164蛋白表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示：在HPS發(fā)病過(guò)程中，HIF-1α蛋白水平在4周和6周未見(jiàn)明顯變化，至第8周顯著高于同期正常對(duì)照組與4周及6周組；GRP78蛋白表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸持續(xù)升高，至第8周達(dá)到最高水平，各時(shí)間點(diǎn)之間以及與同期正常對(duì)照組之間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；VEGF164蛋白表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸增加，至6周達(dá)到高峰，各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于同期正常對(duì)照組，6周和8周時(shí)表達(dá)水平顯著高于4周(圖1)。

圖1各組大鼠肺組織VEGF164、GRP78和HIF-1α蛋白的表達(dá)水平

Fig.1 The protein expression levels of VEGF164, GRP78 and HIF-1α in control and HPS groups

1：4周正常對(duì)照組；2：4周HPS組；3：6周正常對(duì)照組；4：6周HPS組；5：8周正常對(duì)照組；6：8周HPS組。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與4周HPS組比較，△P<0.05；與6周組比較，#P<0.05。

2.2肺組織中VEGFR-2和CD105的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，VEGFR-2和CD105陽(yáng)性表達(dá)呈淺棕黃色染色或深棕黃色，定位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)。在模型組染色強(qiáng)度和數(shù)量均隨病程進(jìn)展逐漸升高(圖2、圖3)，各組染色吸光度值檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。模型組VEGFR-2從第4周開(kāi)始顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并且8周組顯著高于4周組。模型組CD105從第6周開(kāi)始顯著高于對(duì)照組，并且與4周相比具有顯著差異，同時(shí)8周組CD105亦顯著高于6周組。

2.3相關(guān)性分析模型組動(dòng)物肺組織GRP78分別與VEGF164(r=0.826，P<0.05)、VEGFR-2(r=0.885，P<0.05)及CD105(r=0.934，P<0.01)呈顯著正相關(guān)；HIF-1α與GRP78亦呈顯著正相關(guān)(r=0.893，P<0.05)。

表1大鼠肺組織VEGFR-2和CD105平均吸光度值的變化

Tab.1Changes of the average optic density of VEGFR-2 and CD105 in rat lung tissues

±s, n=6)

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與同組4周時(shí)比較，△P<0.05。

圖2各組大鼠肺組織VEGFR-2蛋白的表達(dá)

Fig.2 The expression of VEGFR-2 in rat lung tissues detected by immunohistochemistry (×400)

A：4周正常對(duì)照組；B：4周HPS組；C：6周正常對(duì)照組；D：6周HPS組；E：8周正常對(duì)照組；F：8周HPS組。

圖3各組大鼠肺組織CD105蛋白的表達(dá)

Fig.3 The protein expression of CD105 in rat lung tissues detected by immunohistochemistry (×400)

A：4周正常對(duì)照組；B：4周HPS組；C：6周正常對(duì)照組；D：6周HPS組；E：8周正常對(duì)照組；F：8周HPS組。

3討論

在不同原因引起氧穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，HIFs發(fā)揮不同的作用。在冠狀動(dòng)脈疾病所致的心肌缺血、器官移植時(shí)的慢性排異、壓力負(fù)荷性心力衰竭、外周動(dòng)脈疾病所致肢體缺血以及傷口愈合等疾病情況下，HIFs起保護(hù)作用；而在肺動(dòng)脈高壓、睡眠呼吸綜合征所致的高血壓、視網(wǎng)膜新生血管化以及癌癥等疾病過(guò)程中，HIFs參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[1]。肺微血管重構(gòu)是導(dǎo)致HPS發(fā)生低氧血癥的重要機(jī)制，VEGF是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因子，HIF-1是促進(jìn)VEGF生成的重要核轉(zhuǎn)錄因子。低氧情況下，HIF-1α蛋白明顯增加，與HIF-1β二聚化后轉(zhuǎn)位入核，繼而與低氧反應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)VEGF等特定基因的轉(zhuǎn)錄[8]。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，隨著HPS病程進(jìn)展，在實(shí)驗(yàn)第8周末，肺組織中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加，提示HIF-1參與了HPS的發(fā)病過(guò)程。

HIF-1α蛋白表達(dá)增加是促進(jìn)VEGF產(chǎn)生的重要機(jī)制，VEGF是HIF-1α最為重要的靶基因。HIF-1α蛋白和VEGF蛋白共存于新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞中[8]；HIF-1α可以直接啟動(dòng)VEGF的基因轉(zhuǎn)錄，并且能夠增強(qiáng)VEGF mRNA的穩(wěn)定性，從而提高VEGF的表達(dá)水平[9-11]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)是VEGF家族中的重要成員，同時(shí)也是VEGF家族中促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)。VEGFR-2高度表達(dá)于參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞當(dāng)中，可以轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活和遷移的信號(hào)，在新血管生成的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[12-13]。本項(xiàng)研究中，隨HPS病程進(jìn)展，肺組織中VEGF164(即VEGFA)、VEGFR-2蛋白表達(dá)均增加，并表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。CD105是目前認(rèn)為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，而在成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞中弱表達(dá)或不表達(dá)，因而被認(rèn)為是比CD31、CD34、FⅧ相關(guān)抗原更具特異性的新生血管標(biāo)志物[[14-16]。在許多與血管重構(gòu)有關(guān)的病理過(guò)程中可見(jiàn)HIF-1α、VEGFA、VEGFR-2及CD105的高度一致的表達(dá)[17-19]。本項(xiàng)研究中，也發(fā)現(xiàn)HPS發(fā)病過(guò)程中肺組織VEGF164、VEGFR-2與CD105的相關(guān)性表達(dá)，說(shuō)明VEGF/VEGFR-2途徑在HPS肺微血管重構(gòu)過(guò)程中起作用；而HIF-1α蛋白表達(dá)僅在8周時(shí)與VEGF164、VEGFR-2及CD105有相似性變化，提示HIF-1α主要參與了HPS后期的發(fā)病過(guò)程，在HPS發(fā)病前期，可能存在其他激動(dòng)VEGF/VEGFR-2途徑的因素。

我們前期研究已經(jīng)證明GRP78是與HPS發(fā)病中血管重構(gòu)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)[6]。本項(xiàng)研究中，肺組織中GRP78蛋白表達(dá)隨HPS病程進(jìn)展逐漸持續(xù)增高，與VEGF164和VEGFR-2蛋白表達(dá)表現(xiàn)出基本一致的變化，并分別與VEGF164、VEGFR-2以及CD105呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明GRP78通過(guò)VEGFA/VEGFR-2途徑促進(jìn)了肺微血管重構(gòu)。KUO等[20]在對(duì)人類(lèi)結(jié)腸腺癌HT29和DLD-1細(xì)胞使用siRNA沉默GRP78以后，可減少VEGFA及VEGFR-2表達(dá)、抑制血管形成，體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降和體內(nèi)腫瘤體積減小。該結(jié)果是HPS發(fā)病中GRP78通過(guò)VEGFA/VEGFR-2途徑促進(jìn)肺微血管重構(gòu)的重要佐證。

HIF-1α和GRP78蛋白表達(dá)在HPS發(fā)病中呈現(xiàn)出不同的時(shí)相性變化，以及它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)發(fā)揮作用，應(yīng)當(dāng)是我們關(guān)注的重要問(wèn)題之一。腸源性?xún)?nèi)毒素是激活肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致GRP78增加的重要原因[6]；內(nèi)毒素也可以直接調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HIF-1α的mRNA水平、促進(jìn)蛋白翻譯及抑制其降解來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)HIF-1α[21-22]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以增強(qiáng)HIF-1α活性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的感受分子ATF4和HIF-1均可與VEGFA的啟動(dòng)子結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄[23]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以促進(jìn)HIF-1α的磷酸化，并可能由此增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性[24]；沉默GRP78可使HIF-1α/VEGFA/VEGFR-2表達(dá)均減少[20]。在HPS發(fā)病過(guò)程中，GRP78持續(xù)明顯升高，而HIF-1α至8周時(shí)才明顯升高，很可能GRP78是主要的致血管生成因素，并且可能作為HIF-1信號(hào)通路的上游分子發(fā)揮調(diào)控作用，確切的機(jī)制及意義有待深入探討。

綜上所述，HIF-1α可能也是HPS發(fā)病中的重要因子，與GRP78共同促進(jìn)了肺微血管重構(gòu)。

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(編輯邱芬)

收稿日期：2015-11-12修回日期：2015-12-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81070339)；山西省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010081068)；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.211-091)；山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金資助項(xiàng)目(No.2010-09)

通訊作者：張慧英. E-mail: zhanghy2001@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R363.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604009

Pulmonary expression of HIF-1α and its relationship with GRP78 in the pathogenesis of hepatopulmonary syndrome in rats

LI Xu-jiong1, ZHANG Hui-ying2, TIAN Xiao-xia2, CHENG Yun-xia3,MENG Li3, LAI Li-na4, ZHAO Zhong-fu5, HAN De-wu6, CHENG Ji7

(1. Physiology Department, 2. Pathophysiology Department, 3. Microbiology Department,4. Pharmacology Department, 5. Liver Disease Institute, Changzhi 046000, China;6. Institute of Hepatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;7. Liver Disease Research Center, Keck Medical School of University of Southern California, Los Angeles, CA 90033, USA)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the role of HIF-1α in the pathogenesis of hepatopulmonary syndrome(HPS) and its relationship with GRP78. MethodsThe HPS model in rats was induced by multiple pathogenic factor. The samples were assessed by using Western blotting analysis for HIF-lα, GRP78 and VEGF164. The expressions of VEGFR-2 and CD105 were observed by using immunohistochemical staining. ResultsThe protein level of HIF-1α was significantly increased in HPS group at week 8 compared with that at week 4 and 6 groups and corresponding normal control groups. With the development of HPS, protein level of GRP78 was gradually increased at each time point significantly and reached the highest level at week 8; protein level of VEGF164 showed a similar change with GRP78, but the peak was at week 6. Immunohistochemical results showed that the protein expressions of VEGFR-2 and CD105 were gradually increased in lung tissue as HPS progressed. The protein level of GRP78 was positively correlated with HIF-1α, VEGF164, VEGFR-2 and CD105, respectively (P<0.05). ConclusionHIF-1α is most likely together with GRP78 to play a critical role in promoting pulmonary microvascular remodeling in the pathogenesis of HPS in rats.

KEY WORDS:hepatopulmonary syndrome; hypoxia-inducible factor-1α; 78kD glucose-regulated protein; liver cirrhosis; vascular endothelial growth factor

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81070339 ), the International Science and Technology Cooperation Project of Shanxi Province (No.2010081068), Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No.211-091), the fund from Key Laboratory of Cellular Physiology co-established by Shanxi Province and Ministry of Education in Shanxi Medical University(No.2010-09).

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.1138.022.html(2016-06-15)