應用光標測技術觀察INa-L和IKr對左、右心室間電異質性的影響

孫紅梅，李　麗，蔣永榮，楊　琳，薛小臨，孔　澍，楊　昭

(1. 延安大學附屬醫(yī)院心內科，陜西延安　716000；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內科，陜西西安　710061；3. 西安交通大學醫(yī)學部，陜西西安　710061)

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◇基礎研究◇

應用光標測技術觀察INa-L和IKr對左、右心室間電異質性的影響

孫紅梅1,2，李麗2，蔣永榮2，楊琳2，薛小臨2，孔澍3，楊昭3

(1. 延安大學附屬醫(yī)院心內科，陜西延安716000；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心內科，陜西西安710061；3. 西安交通大學醫(yī)學部，陜西西安710061)

摘要：目的應用高分辨率光標測技術，觀察INa-L、IKr對左、右心室間異質性及頻率依賴性的影響。方法構建兔離體心臟模型(12只)，將電壓敏感性染料通過Langendorff方法灌注兔離體心臟，使用波長為532 nm的LED光源，分別記錄心臟左、右心室動作電位時程(APD80和APD50)；分別使用多菲利特(30 nmol/L)、多菲利特+ATX-Ⅱ(1 nmol/L)、多菲利特+ATX-Ⅱ+美西律(10 μmol/L)進行灌注，加藥前為自身對照，每組分別給予刺激周長(BCL)為2 000、1 000、500、300 ms的刺激，觀察藥物干預前后左心室或右心室APD的變化。結果①在不同刺激條件下，對照組右心室的APD80、APD50均長于左心室，呈反向頻率依賴性；②加入多菲利特后，BCL=1 000 ms時，左、右心室的APD80、APD50分別較對照組相應心室明顯延長，但兩心室的ΔAPD80和ΔAPD50相比差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨頻率的減慢，兩心室的ΔAPD80較對照組增加明顯。③加入ATX-Ⅱ后，BCL=1 000 ms時，左、右心室的APD80、APD50較單用多菲利特及對照組顯著增加，兩心室的ΔAPD80和ΔAPD50相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且左心室的ΔAPD80和ΔAPD50大于右心室。隨刺激頻率的減慢，兩心室的ΔAPD80較對照組顯著增加。④加入美西律后，BCL=1 000 ms時，左、右心室的APD80、APD50較使用前明顯縮短，兩心室的ΔAPD80和ΔAPD50與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩心室的ΔAPD80與ATX-Ⅱ組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而ΔAPD50與ATX-Ⅱ組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨頻率的減慢，兩心室ΔAPD80增加的幅度減小。結論①多菲利特阻斷IKr未能增大心室間的異質性，左、右心室表現(xiàn)出反向頻率依賴性。②在阻斷IKr的基礎上使用INa-L開放劑ATX-Ⅱ，增加了左、右室間的異質性，并加強IKr的反向頻率依賴性；美西律阻斷INa-L減小心室間的異質性，并減輕其反向頻率依賴性。

關鍵詞：光標測；左右心室；復極異質性；INa-L；IKr

近年來大量基礎研究發(fā)現(xiàn)，整體心臟左、右心室以及心臟各層心肌細胞之間的電生理異質性增大，為折返激動和室性心律失常的發(fā)生提供基質。電壓敏感性光標測技術可通過多位點、同步和無創(chuàng)記錄心肌細胞群的膜電位變化，被用于研究整體心臟的電生理特征及心律失常的發(fā)生機制。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚、慢性心力衰竭及3型長QT綜合征(LQT3)等疾病發(fā)生TdP(Torsades de pointes)的主要原因是心室肌細胞晚鈉電流(INa-L)增大，使用阻斷hERG通道(IKr通道)的藥物時，發(fā)生TdP的風險性增高，使得原本安全的藥物變得不安全?？绫趶蜆O離散度(TDR)的增大是發(fā)生TdP的重要機制，但左、右心室間的復極異質性所發(fā)揮的作用尚不明確。

1材料與方法

1.1實驗對象與儀器選取成年雄性家兔12只，體質量2.4～2.7 kg，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。本實驗的光學標測系統(tǒng)主要包括Langendorff灌流系統(tǒng)、熒光信號檢測系統(tǒng)和ECG采集系統(tǒng)。

1.2實驗分組12只家兔均為自身對照，根據藥物干預的不同分為4組，依次是對照組、多菲利特組、多菲利特+ATX-Ⅱ組、多菲利特+ATX-Ⅱ組+美西律組。加藥前為自身對照，依次給予3種藥物干預(如出現(xiàn)不可消除的自主節(jié)律干擾則停止實驗)。以上4組實驗的臺式液為循環(huán)灌注，且沒有藥物洗脫，對照組只含電壓敏感性染料Di-4-ANEPPS、肌松劑(+)-Blebbistatin(10 μmol/L)，之后依次加入多菲利特(30 nmol/L)、ATX-Ⅱ(1 nmol/L)和美西律(10 μmol/L)。所有實驗用藥均由DMSO配置。

1.3離體兔心室標本的制備①固定家兔，首先肌肉注射安定0.2 mL，后經耳緣靜脈先后注射肝素200 IU/kg和250 g/L烏拉坦5 mL/kg充分抗凝和麻醉。開胸后連同心包取出心臟，暴露主動脈弓，在主動脈弓起始部離斷，留有完整的升主動脈。②采用Langendorff方法主動脈逆行灌流心臟，應保證冠狀動脈的良好灌注。從取出心臟到成功插管應在2 min內完成。③灌流速度穩(wěn)定于15～20 mL/min之間。心臟持續(xù)穩(wěn)定灌流后，將正、負刺激電極扎入心尖部附近，心電信號通過放大器輸入計算機，給予不同基礎刺激周長(basic cycle length, BCL)2 000、1 000、500、300 ms的連續(xù)單刺激，電流約2～4 mA，設定刺激電流強度為閾值的2倍，脈寬為2 ms。標本平衡約40 min。整個實驗限定在1.5 h內完成。

1.4刺激方式①標本連接到心臟灌流裝置后，給予BCL=1 000 ms的連續(xù)單刺激平衡，加入肌松劑(+)-Blebbistatin(10 μmol/L)后(避免氣泡生成)，使得心臟無機械收縮(約20～40 min)。② 通過灌流裝置的三通管緩慢注射電壓敏感性染料Di-4-ANEPPS 0.2 mL(避免氣泡生成)，打開LED光源，用專用眼鏡可見心臟外膜為均勻的橘紅色(綠光激發(fā)紅光的原理)。如心室熒光亮度較暗或者熒光衰減，可隨時追加染料0.1 mL。③依次給予BCL=2 000、1 000、500、300 ms的刺激1 min，保存數(shù)據作為對照組。記錄時間為每一時間段結束之前的APD。④原臺式液中依次加入多菲利特30 nmol/L、ATX-Ⅱ 1 nmol/L、美西律10 μmol/L后，均灌流10 min后，依次給予BCL=1 000、500、300 ms的刺激1 min，并記錄。⑤ 在步驟3、4中，改變刺激周長之間以BCL=1 000 ms平衡1～2 min。⑥結束實驗，清洗灌流系統(tǒng)。

1.5左、右心室動作電位的采集和分析實驗選用電壓敏感性染料Di-4-ANEPPS(Invitrogen公司)，使用激發(fā)波長為532 nm、發(fā)射波長約620 nm的濾光鏡。通過2個裝有高速數(shù)字攝像頭的CCD攝像機(加拿大Dalsa公司，空間分辨率為128×128)和兩個LED光源(激發(fā)波長為532 nm，國產)分別對準心臟的左、右心室，由CCD攝像機捕捉心臟左、右心室的電信號變化。CCD捕獲的圖像以261幀/s的速度采集，每次保存圖像根據實驗需要設置為1 000幀或者2 000幀。標測左、右心室心外膜的面積各約1.5 cm×1.5 cm。通過Lab View平臺建立的圖像數(shù)據采集軟件進行左、右心室動作電位(APD)的同步采集。測量左、右心室APD80、APD50，用ΔAPD80和ΔAPD50表示藥物干預前后左心室或右心室APD80和APD50變化的差值。

2結果

2.1生理條件下左、右心室異質性的比較生理條件BCL分別為2 000 ms、1 000 ms、500 ms、300 ms時，觀察到同一心臟標本的左、右心室間APD的差異(圖1)。APD均分別于心臟左、右心室上某一固定像素點記錄獲得。紅色表示右心室，藍色表示左心室。BCL=300 ms時，兩心室的APD幾乎重疊，BCL=(2 000、1 000、500 ms)，右心室的APD長于左心室，且左右心室APD的差值呈反向頻率依賴。

圖1生理條件不同BCL下左、右心室動作電位的比較

Fig.1 Comparison of APD in the left and right ventricles of different BCL in physiological conditions

A：2 000 ms；B：1 000 ms；C：500 ms；D：300 ms。

2.2多菲利特、ATX-Ⅱ及美西律對左、右心室APD的影響當BCL=1 000 ms，加入多菲利特，兩心室的APD80和APD50較對照組均明顯延長。在多菲利特的基礎上加用ATX-Ⅱ，兩心室的APD80和APD50較單用多菲利特延長更明顯。加入美西律后，兩心室的APD80和APD50較使用前均明顯縮短。實驗各組中右心室的APD80較左心室長。當BCL分別為500 ms和300 ms時，兩心室的APD80和APD50隨著刺激頻率的增快而縮短，但藥物干預后APD的變化趨勢同BCL=1 000 ms時的變化相似(圖2)。

圖2BCL=1 000 ms時不同藥物干預對左、右心室APD80、APD50(ms)的影響

A：對照組；B：多菲利特組；C：多菲利特+ATX-Ⅱ組；D：多菲利特+ATX-II+美西律組。每組取18個點的數(shù)據分析，RV：右心室；LV：左心室。

當BCL=1 000 ms時，對照組臺式液中依次加入多菲利特、ATX-Ⅱ、美西律，觀察到某一標本左、右心室APD的變化規(guī)律(圖3)。左、右心室的圖像用光標測分析的ratio圖表示，中間的兩列AP分別來自同一標本左、右心室的某一固定像素點，其中藍色為對照組，綠色為多菲利特組，紅色為多菲利特+ATX-Ⅱ組，紫紅色多菲利特+ATX-Ⅱ+美西律組。色標表示膜電壓(mV)，紅色代表去極化狀態(tài)，深藍色代表復極化狀態(tài)。

整治手法：修繕和更換結構破損嚴重的建筑構件，現(xiàn)狀瓷磚貼面予以保留，裸露的磚墻墻面以白色防水涂料進行粉刷，勒腳部分用深灰色防水涂料粉刷，進行建筑節(jié)能改造。

圖3BCL=1 000 ms時不同藥物干預后左、右心室APD變化的個例

Fig.3 Changes of APD in the left and right ventricles before and after intervention in one case when BCL was 1 000 ms

2.3多菲利特、ATX-Ⅱ及美西律對心室間異質性的影響B(tài)CL=1 000 ms，加入多菲利特，左、右心室的ΔAPD80較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在多菲利特基礎上加ATX-Ⅱ后，兩心室的ΔAPD80均增加明顯，較對照組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；最后加入美西律后，兩心室的ΔAPD80縮短，但較對照組仍有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

還發(fā)現(xiàn)加入ATX-Ⅱ后，兩心室的ΔAPD80較單用多菲利特有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，左心室的ΔAPD80比右心室增大顯著；加入美西律相比，左、右心室的APD80均縮短明顯，兩心室的ΔAPD80相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

當BCL=1 000 ms，加入多菲利特，兩心室的ΔAPD50相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；加ATX-Ⅱ后，兩心室的ΔAPD50明顯增大，兩心室相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；加入美西律后，兩心室的ΔAPD50縮短，較對照組仍有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。加入ATX-Ⅱ后，兩心室的ΔAPD50較單用多菲利特有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，左心室的ΔAPD50明顯增大；同使用美西律相比，左、右心室的APD50均縮短，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.4多菲利特、ATX-Ⅱ及美西律對左、右心室頻率依賴性的影響圖4、5、6表示不同BCL左、右心室用藥組分別與對照組差值(ΔAPD80)的比較。使用多菲利特后，左、右心室的ΔAPD80隨著刺激頻率的減慢逐漸增加，BCL=1 000 ms時ΔAPD80延長的幅度最大，BCL=500 ms，ΔAPD80延長的幅度減小，BCL=300 ms時最小。多菲利特與ATX-Ⅱ共同作用后，隨著刺激頻率的減慢，兩心室的ΔAPD80增加的更為明顯，即反向頻率依賴性加強。使用美西律后，這種反向頻率依賴性減輕。

圖4BCL=1 000 ms時藥物干預后的左、右心室ΔAPD80比較

Fig.4 Comparison of ΔAPD80in the left and right ventricles before and after intervention when BCL was 1 000 ms

A：B-A表示多菲利特組與對照組的差值組，C-A表示多菲利特+ATX-Ⅱ組與對照組的差值組，D-A表示多菲利特+ATX-Ⅱ+美西律組與對照組的差值組。B：左、右心室用藥組之間差值(ΔAPD80)的比較。C-B表示多菲利特+ATX-Ⅱ組與多菲利特組的差值組，C-D表示多菲利特+ATX-Ⅱ組與多菲利特+ATX-Ⅱ+美西律組的差值組。

3討論

近20年來，高分辨率光標測技術(optical mapping)是一種新的功能成像技術，用整體心臟標本建立病理生理狀態(tài)的動物模型，將心臟電活動形象、直觀地展現(xiàn)出來，對疾病的發(fā)生機制及其臨床治療可提供一個可靠的基礎，也為藥物的安全性使用提供依據。

3.1生理條件下左、右心室的異質性特點本實驗條件中恒定的溫度、酸堿度、灌注壓及足夠的氧供等使離體心臟接近正常生理狀態(tài)，這能夠很好地反映整體心臟心肌細胞本身的電生理特性。發(fā)現(xiàn)生理條件下心室間也存在異質性，右心室的APD比左心室長，

圖5BCL=500 ms時藥物干預后的左、右心室ΔAPD80比較

Fig.5 Comparison of ΔAPD80in the left and right ventricles before and after intervention when BCL was 500 ms

圖6BCL=300 ms時藥物干預后的左、右心室ΔAPD80比較

Fig.6 Comparison of ΔAPD80in the left and right ventricles before and after intervention when BCL was 300 ms

特別是在慢頻率條件下。其他物種的研究也有相似的結果[1-2]。JUSTUS等研究心室肌內膜的特殊傳導系統(tǒng)浦肯野氏纖維，結果是右心室浦氏纖維的APD90大于左心室，APD50反而小于左心室。VOLDERS等[3]用單細胞膜片鉗技術表明右室M細胞APD長于左室。在心室肌細胞，Ito電流在AP復極中起著重要作用[4]，右心室的Ito通常大于左心室，這是兔右心室APD長于左心室的基礎。

3.2 IKr、INa-L對左、右心室間異質性的影響由于實驗過程中，BCL=2 000 ms標本總是出現(xiàn)不可消除的自主節(jié)律，BCL=1 000 ms則沒有，認為是刺激頻率過于緩慢造成心臟自身的心電活動不穩(wěn)定，故藥物干預后只有BCL=1 000 ms、500 ms、300 ms 3種刺激頻率。本實驗側重于藥物作用后左、右心室間異質性的變化，由于實驗分組較多，組間比較會加大誤差，因此對同一藥物作用后分別對兩心室的ΔAPD80和ΔAPD50進行配對比較，僅對藥物作用后兩心室APD的變化趨勢進行觀察。

研究發(fā)現(xiàn)，多菲利特阻斷編碼IKr通道的HERG基因，增大TDR而發(fā)揮致心律失常作用。本實驗觀察到，多菲利特沒有增加左、右心室間的異質性，僅延長左、右心室的APD，表明該濃度的多菲利特產生TdP的原因主要是TDR增大。

還發(fā)現(xiàn)多菲利特與ATX-Ⅱ共同作用后，明顯增大左、右心室間的異質性，引起心電活動的不穩(wěn)定，為TdP的發(fā)生提供可能基質。由于M細胞本身INa-L電流分布密度較大，ATX-Ⅱ使得INa-L增大，其APD延長更明顯。使用美西律能明顯縮短左、右心室的APD80，減小左、右心室間異質性，降低TdP風險性。在阻斷IKr的基礎上增大INa-L增強左、右心室間異質性，參與心律失?；|的形成[5]，這是臨床INa-L增大相關疾病使用IKr阻斷藥物發(fā)生TdP的可能機制。

但美西律沒有完全減小左、右心室的異質性，表示該濃度的美西律不足以完全阻斷平臺期的INa-L電流。但我們在臨床中發(fā)現(xiàn)，美西律可以縮短8型LQT患者的QT間期及QTc(服藥前的600 ms縮小為495 ms)，消除2∶1房室傳導阻滯及T波電交替，顯著減小QT-RR關系圖的斜率(P<0.01)，降低發(fā)生TdP的風險性[6]。對于先天性LQTS，治療有效的藥物較少，美西律是單純的Na通道阻斷劑，小劑量阻斷INa-L，對縮短QT間期及減小頻率適應性表現(xiàn)出很好的臨床治療前景[7-8]。

3.3 IKr、INa-L對左、右心室頻率依賴性的影響藥物的反向使用依賴性是促發(fā)TdP的一個主要因素。實驗發(fā)現(xiàn)，多菲利特在整體心臟仍表現(xiàn)出反向頻率依賴性，從而增加了心動過緩患者因QT間期過度延長發(fā)生惡性心律失常的危險性。ATX-Ⅱ是INa-L開放劑，與IKr阻斷劑有相同的反向頻率依賴性，二者聯(lián)合，心肌的反向頻率依賴性加強，為QT間期延長致TdP發(fā)生提供了基質。有研究表明，IKr阻斷劑(克拉霉素)可以產生EAD，合用ATX-Ⅱ后發(fā)生TdP[9]，但INa-L阻斷劑雷諾嗪可以消除ATX-Ⅱ誘發(fā)的心律失常。JIA等[10]認為，心動過緩時增大TDR可能是APD頻率依賴異質性的結果，至少部分歸為心室壁晚鈉的分布異質性。

任何原因致QT間期延長均會增大INa-L，美西律減少INa-L，減輕了兩心室的反向頻率依賴性。因此，阻斷INa-L可縮短QT間期及減輕頻率依賴性，對預防和治療LQTS致TdP提供了可靠的實驗研究基礎。LIU等[11]發(fā)現(xiàn)阻斷INa-L減小TDR可以支持上述理解。

本實驗選用的藥物為選擇性的離子通道阻斷劑或開放劑，是離子電流的改變導致心臟的異質性變化。但光標測技術標測的僅僅是兩心室外膜細胞，通過細胞間偶聯(lián)觀察兩心室的異質性變化，沒有楔形組織塊標本測量三層細胞APD及TDR反映致心律失常風險高；但是研究整體心臟異質性更貼近臨床疾病的發(fā)生，為指導臨床治療提供可靠依據。

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(編輯卓選鵬)

收稿日期：2015-07-14修回日期：2016-03-13

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.30870659/30971221)

通訊作者：薛小臨. E-mail: xxiaolin358@sina.com

中圖分類號：R331.3

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604007

Voltage sensitive optical mapping used to observe effects of late Na and rapidly activating delayed rectifier K currents on the right and left ventricular electrophysiological heterogeneity

SUN Hong-mei1,2, LI Li2, JIANG Yong-rong2, YANG Lin2,XUE Xiao-lin2, KONG Shu3, YANG Zhao3

(1. Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Yan’an University,Yan’an 716000; 2. Department o f Cardiology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061; 3. Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effects of late Na current (INa-L) and rapidly activating delayed rectifier K current (IKr) on ventricular heterogeneity and frequency dependency by using high resolution voltage sensitive optical mapping technology. MethodsThe model of 12 isolated hearts was constructed in rabbits. Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS were perfused into the isolated hearts by Langendorff method. LED source with the wave length of 532 nm was used to record APD80 and APD50 of the left and right ventricles. Experimental groups were divided into 3 groups by perfusion drugs dofetillide (30 nmol/L), dofetillide+ATX-Ⅱ(1 nmol/L), and dofetillide +ATX-Ⅱ+mexiletine (10 μmol/L). The subjects were intervened by the above drugs in order, and they were self-compared before dosing. After each drug administration, the hearts were stimulated respectively with the BCL of 2 000 ms, 1 000 ms, 500 ms, and 300 ms. Then we observed the changes of APD80 and APD50 in the left and right ventricles before and after the interventions. Results① In the control group, APD80and APD50of the right ventricle were longer than those of the left ventricle in response to different stimulation, and the differences increased with the decrease of stimulating frequency. ② When BCL was 1000 ms, APD80and APD50of the left and right ventricles were prolonged respectively after administration of dofetillide, but the differences in APD80and APD50were insignificant between the left and right ventricles (P>0.05). ΔAPD80of the two ventricles increased significantly with the decrease of stimulating frequency. ③ After administration of ATX-Ⅱ, when BCL was 1000 ms, APD80and APD50of the left and right ventricles increased significantly compared with those in the control group and dofetillide intervention group (P<0.05). And the increase of APD in the left ventricle was greater than that of the right ventricle. ΔAPD80of the two ventricles increased significantly with the decrease of stimulating frequency. ④ After administration of mexiletine, when BCL was 1000 ms, APD80and APD50of the left and right ventricles reduced significantly compared with those of the primary state (P<0.05). APD80and APD50of the left and right ventricles reduced significantly compared with those of the control group (P<0.05) and ATX-Ⅱ group (P>0.05). The increase of ΔAPD80of the two ventricles became milder when the stimulating frequency decreased. Conclusion① IKrblocked by dofetillide did not affect the heterogeneity between the two ventricles, which showed reverse-frequency dependence. ② In the context of blocking IKr, ATX-Ⅱ increased the heterogeneity between the left and right ventricles and enhanced the reverse-frequency dependence. In contrast, mexiletine, the blocker of INa-L, decreased the heterogeneity between the two ventricles and reverse-frequency dependence.

KEY WORDS:optical mapping; left and right ventricles; repolarization heterogeneity; INa-L; IKr

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30870659 and 30971221)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.0854.006.html(2016-06-15)