小鼠顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)損傷對齒狀回神經(jīng)再生的影響

胡　明，朱　坤，張建水，劉建新

?

◇基礎(chǔ)研究◇

小鼠顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)損傷對齒狀回神經(jīng)再生的影響

胡明1,2，朱坤1，張建水2，劉建新1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院：1. 神經(jīng)生物學(xué)研究所；2. 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，陜西西安710061)

摘要：目的明確小鼠顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)細胞丟失是否影響齒狀回神經(jīng)元新生。方法Pilocarpine誘導(dǎo)制作小鼠顳葉癲癇模型，在慢性期(誘導(dǎo)2月后)采用BrdU標記齒狀回顆粒細胞下層(subgranular zone, SGZ)新生細胞，尼氏染色將標本分為CA3區(qū)細胞部分丟失(Ⅰ型)和嚴重丟失(Ⅱ型)組。BrdU+NeuN免疫熒光雙標染色觀察新生細胞向神經(jīng)元的分化，DCX和BrdU免疫熒光染色觀察兩組動物齒狀回細胞增殖和新生細胞的存活。結(jié)果與Ⅱ型組動物比較，Ⅰ型組動物齒狀回SGZ和顆粒細胞層(granule cell layer, GCL)BrdU+NeuN雙標細胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，但雙標細胞占BrdU免疫陽性細胞總量的比例在兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；Ⅰ型和Ⅱ型組動物齒狀回SGZ區(qū)DCX免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量無顯著性差異(P>0.05)；BrdU標記6周后，Ⅰ型組動物齒狀回存活的BrdU免疫陽性細胞數(shù)量較Ⅱ型組明顯增多(P<0.05)。結(jié)論小鼠顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)損傷通過影響新生細胞的存活而降低了海馬齒狀回神經(jīng)元新生。

關(guān)鍵詞：顳葉癲癇；海馬；齒狀回；神經(jīng)再生；神經(jīng)元；CA3區(qū)損傷

海馬神經(jīng)再生在顳葉癲癇后的改變已被視為該疾病的重要病理特點，其在海馬高興奮性病理性環(huán)路形成以及結(jié)構(gòu)修復(fù)中具有較大的潛在意義[1]。在顳葉癲癇慢性期，海馬神經(jīng)再生明顯下降[2-3]，但其機制尚未完全明了。已有研究表明癲癇慢性期齒狀回微環(huán)境的惡化，包括各種神經(jīng)因子表達的下調(diào)是造成海馬神經(jīng)再生下降的局部因素[4]。生理狀態(tài)下，海馬齒狀回新生神經(jīng)元向CA3區(qū)錐體細胞發(fā)出軸突投射，我們前期的研究已證實海馬CA3區(qū)損傷對齒狀回神經(jīng)再生具有負向影響[5]。海馬CA3區(qū)細胞丟失是顳葉癲癇的重要病理特點，因此我們推測顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)細胞丟失可能是造成海馬神經(jīng)再生下降的重要因素。本研究采用Pilocarpine誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE)，在疾病慢性期用BrdU標記齒狀回新生細胞并追蹤其向成熟神經(jīng)元的分化，應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法對上述推測進行驗證。

1材料與方法

1.1動物雌性昆明小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實驗動物中心，所有實驗經(jīng)過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。在滿足研究要求的條件下，盡量減輕動物痛苦和減少實驗動物數(shù)量。

1.2Pilocarpine誘導(dǎo)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)選用25～30 g雌性昆明小鼠共60只。誘導(dǎo)在安靜、較暗的動物實驗室進行。誘導(dǎo)前30 min皮下注射硝酸甲基東莨菪堿1 mg/kg(0.025 mg/mL)(Catalog No.S2250, Sigma, USA)以減輕Pilocarpine對周圍神經(jīng)的損害，然后腹腔注射Pilocarpine 300 mg/kg(75 mg/mL)(Catalog No.P6503, Sigma, USA)，5 min后給予聲音、提尾等輕微刺激，誘導(dǎo)動物進入癲癇持續(xù)狀態(tài)。

1.3視頻監(jiān)測自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作在鼠籠上架設(shè)高清存儲式攝像頭，實驗動物(3只/籠)在慢性期接受為期1周、每天24 h的視頻監(jiān)測。分析視頻資料，剔除無自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作的動物。

1.4BrdU標記SE后2月進行BrdU標記。一次性腹腔注射BrdU(Catalog No.B5002, Sigma, USA)，劑量為150 mg/kg。

1.5取材BrdU標記后2 h(分析細胞增殖)或6周(分析新生細胞存活和向神經(jīng)元的分化)后，20 g/L巴比妥鈉(Sigma)腹腔注射(0.2 mL/kg)麻醉后，分別用0.1 mol/L PBS緩沖液和40 g/L多聚甲醛(0.1 mol/L PBS緩沖液溶解)固定液灌注動物，取腦，后固定3 h后置300 g/L蔗糖溶液中4 ℃過夜。恒溫冰凍切片機(Slee Technik, Mainz, Germany)切取40 μm厚含全長背側(cè)海馬的冠狀腦片(前囟后2.80～4.52 mm)，每次連續(xù)切取5張，依次放入裝有0.1 mol/L PBS的10個板孔內(nèi)。反復(fù)上述操作，最終每個板孔內(nèi)包含6～8 片間隔200 μm的背側(cè)海馬腦片。

1.6甲苯胺藍尼氏染色每只動物取一個板孔內(nèi)的全部腦片，將腦片錨定在載破片上，室溫下干燥，浸入甲苯胺藍染色液1 min，用清水洗滌3次，干燥、封片。

1.7BrdU+NeuN免疫熒光雙標染色每只動物取出一個板孔內(nèi)的腦片，0.1 mol/L PBS洗滌3次，浸入2 mol/L HCl 在37 ℃水浴箱內(nèi)變性30 min；洗滌后用小鼠抗BrdU(1∶300，Catalog No. VP-B209, Vector, USA)和兔抗NeuN(1∶1 000，Catalog No.MABN140，Millipore, USA)混合一抗溶液(用加入3 mL/L的Triton和10 mL/L的山羊血清的0.1 mol/L PBS配制)孵育，4 ℃過夜；0.1 mol/L PBS洗滌3次，用Cy3標記的山羊抗小鼠IgG(1∶200，Catalog No.0311, ZSGB-Bio, China)和FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶200，Catalog No.0313, ZSGB-Bio, China)二抗混合液室溫孵育2 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，錨定、封片，激光共聚焦顯微鏡(TCS, Sp2, Leica, Germany)觀察。

1.8DCX免疫熒光染色每只動物取出一個板孔內(nèi)的腦片，0.1 mol/L PBS洗滌3次，20 mL/L山羊血清封閉2 h，洗滌后用兔抗DCX(1∶1 000, Catalog No.ab18723, Abcam, UK)一抗溶液孵育，4 ℃過夜；0.1 mol/L PBS洗滌3次，用FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶200, Catalog No.0313, ZSGB-Bio, China)二抗室溫孵育2 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，DAPI復(fù)染。錨定、封片，熒光顯微鏡觀察。

1.9BrdU免疫熒光染色每只動物取出一個板孔內(nèi)的腦片，0.1 mol/L PBS洗滌3次，浸入2 mol/L HCl在37 ℃水浴箱內(nèi)變性30 min；洗滌后用小鼠抗BrdU(1∶300，Catalog No.VP-B209, Vector, USA)一抗溶液孵育，4 ℃過夜；0.1 mol/L PBS洗滌3次，用FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶200，Catalog No.0311, ZSGB-Bio, China)二抗室溫孵育2 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，DAPI復(fù)染。錨定、封片，熒光顯微鏡觀察。

2結(jié)果

2.1Pilocarpine誘導(dǎo)SE的行為學(xué)表現(xiàn)Pilocarpine誘導(dǎo)的行為學(xué)變化包括起始的肌肉緊張，尾部翹起，發(fā)展到四肢肌肉痙攣，劇烈跳動，摔倒，最后維持在頭頸部肌肉抽動、持續(xù)快速點頭的狀態(tài)。動物出現(xiàn)連續(xù)無中斷的發(fā)作距離Pilocarpine腹腔注射時間為(17.82±10.84)min，持續(xù)時間為(7.23±1.59)h。腹腔注射生理鹽水對照組動物無異常行為學(xué)改變。本研究共誘導(dǎo)成功52只動物，8只動物因發(fā)作嚴重死亡。

2.2自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作情況52只成功誘導(dǎo)為SE的動物接受視頻監(jiān)測，其中48只動物出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作，發(fā)作頻率為(1.8±0.9)次/24 h，單次持續(xù)時間為(18±8.4)s。

2.3甲苯胺藍尼氏染色結(jié)果尼氏染色可見癲癇慢性期動物海馬CA3區(qū)細胞大量丟失，齒狀回顆粒細胞則無明顯丟失。出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作的24只動物在BrdU標記2 h后處死，根據(jù)染色結(jié)果從中選取12只動物的標本，其中Ⅰ型組(CA3區(qū)細胞部分丟失)(圖1A)和Ⅱ型組(CA3區(qū)細胞嚴重丟失)(圖1B)各6只。另外24只動物在BrdU標記6周后處死，根據(jù)染色結(jié)果從中選取12只動物的標本，其中Ⅰ型組(CA3區(qū)細胞部分丟失)和Ⅱ型組(CA3區(qū)細胞嚴重丟失)各6只。為排除CA1區(qū)細胞丟失對實驗結(jié)果的影響，選取的12只動物標本CA1區(qū)細胞丟失均不嚴重。

圖1尼氏染色顯示CA3區(qū)細胞部分(Ⅰ型)和嚴重(Ⅱ型)丟失Fig.1 Cell loss in the CA3 area in types Ⅰ and Ⅱ mice (×10)

A：Ⅰ型，CA3區(qū)細胞部分丟失；B：Ⅱ型，CA3區(qū)細胞嚴重丟失。B中標尺=200 μm。

2.4BrdU+NeuN免疫熒光雙標染色結(jié)果BrdU標記6周后，在海馬齒狀回SGZ和GCL可見核染的BrdU+NeuN雙標細胞(圖2B、C，箭頭所示)。Ⅰ型組動物(圖2B，B1～B3)SGZ-GCL雙標細胞數(shù)量(312±56)較Ⅱ型組(圖2C，C1～C3)(194±38)明顯增多(方差齊，F(xiàn)=2.298,t=4.119,P=0.0021)(圖2D)。但BrdU+NeuN雙標細胞所占BrdU免疫陽性細胞的比例在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(方差齊，F(xiàn)=1.490，t=0.854 7，P=0.412 7)(圖2E)。

圖2Ⅰ和Ⅱ型組動物齒狀回BrdU+NeuN免疫熒光雙標染色情況

Fig.2 Double labeling of BrdU+NeuN by immunofluorescence staining in the dentate gyrus of types Ⅰ and Ⅱ mice (×40)

A：實驗設(shè)計；B：Ⅰ型組動物BrdU+NeuN雙標染色，B1～B3為B圖中大箭頭所示區(qū)域的分色圖片；C：Ⅱ型組動物BrdU+NeuN雙標染色，C1～C3為C圖中大箭頭所示區(qū)域的分色圖片；D：雙標細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；E：雙標細胞比例統(tǒng)計圖。C中標尺=100 μm，也適用于B；C3中的標尺=50 μm，也適用于B1～B3和C1～C2。

2.5DCX染色TLE慢性期小鼠海馬齒狀回SGZ可見突起明顯的DCX免疫陽性細胞(圖3B、C)。但Ⅰ型組(1 284±209，圖3B)和Ⅱ型組動物(1 205±159，圖3C)SGZ區(qū)域DCX免疫陽性細胞數(shù)量沒有顯著性差異(方差齊，F(xiàn)=2.246，t=0.669 1，P=0.518 6)(圖3D)。

2.6BrdU染色BrdU標記2 h后，齒狀回SGZ的BrdU免疫陽性細胞數(shù)量在Ⅰ型組(1 136±119，圖4B)和Ⅱ型組(1 361±108，圖4C)之間無顯著性差異(方差齊，F(xiàn)=1.590，t=1.121，P=0.288 4)(圖4F)。但在BrdU標記后6周，Ⅰ型組SGZ-GCL存留的BrdU免疫陽性細胞數(shù)(712±118，圖4D)較Ⅱ型組(346±90，圖4E)明顯增多(方差齊，F(xiàn)=2.170，t=8.875，P=0.0007)(圖4G)。

圖3Ⅰ和Ⅱ型組動物齒狀回DCX免疫熒光染色

Fig.3 DCX immunofluorescence staining in the dentate gyrus of types Ⅰ and Ⅱ mice (×40)

A：實驗設(shè)計；B：Ⅰ型組動物DCX染色；C：Ⅱ型組動物DCX染色；D：DCX免疫陽性細胞數(shù)統(tǒng)計圖。C中標尺=100 μm。

圖4Ⅰ和Ⅱ型組動物齒狀回BrdU免疫熒光染色

Fig.4 BrdU immunofluorescence staining in the dentate gyrus of types Ⅰ and Ⅱ mice (×40)

A：實驗設(shè)計；B：Ⅰ型組動物BrdU染色(標記后2 h)；C：Ⅱ型組動物BrdU染色(標記后2 h)；D：Ⅰ型組動物BrdU染色(標記后6周)；E：Ⅱ型組動物BrdU染色(標記后6周)。F：BrdU免疫陽性細胞數(shù)(標記后2 h)統(tǒng)計圖；G：BrdU免疫陽性細胞數(shù)(標記后6周)統(tǒng)計圖。E中標尺=100 μm。

3討論

我們前期的研究表明，Pilocarpine誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)2月后，動物出現(xiàn)典型顳葉癲癇慢性期表現(xiàn)，包括特征性海馬病理變化(膠質(zhì)化、苔蘚纖維芽發(fā)和海馬膠質(zhì)化)和自發(fā)性反復(fù)性癲癇發(fā)作[6]。因此，本研究選擇癲癇持續(xù)狀態(tài)2月后作為研究的起始點。我們選擇BrdU標記6周以后觀察新生細胞的分化，是因為這些新生細胞需要4～6周的時間才能分化成為成熟的神經(jīng)元[7]。本研究選擇BrdU單次標記，避免了多次標記方案中標記期間新生細胞的存活和標記細胞處于不同年齡階段對研究結(jié)果的干擾。

新生細胞分化是神經(jīng)再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本研究著重觀察CA3區(qū)細胞丟失對SGZ新生細胞向成熟神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的影響。采用BrdU+NeuN免疫雙標染色發(fā)現(xiàn)，BrdU標記6周后，Ⅰ型組動物齒狀回雙標細胞數(shù)量雖然較Ⅱ型組動物明顯增多，但雙標細胞占各組BrdU免疫陽性細胞的比例卻較為一致。這一結(jié)果提示，雖然Ⅱ型組動物海馬新生成熟神經(jīng)元較少，但CA3區(qū)細胞丟失可能并不影響新生細胞向成熟神經(jīng)元的分化能力，而Ⅰ型組動物較多的BrdU+NeuN雙標細胞可能是由于SGZ細胞增殖和(或)新生細胞的存活能力增強所造成的。我們首先進行了DCX染色。DCX陽性細胞代表出生后10 d左右的未成熟神經(jīng)元[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ型組和Ⅱ型組動物SGZ區(qū)域DCX免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量沒有明顯差異。這一結(jié)果表明，存活障礙可能是Ⅱ型組動物海馬新生成熟神經(jīng)元減少的主要原因。我們又分別在BrdU標記2 h(觀察SGZ細胞增殖)和6周后(觀察新生細胞的存活能力)BrdU免疫染色進行進一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BrdU標記2 h后，SGZ的BrdU免疫陽性細胞數(shù)量在Ⅰ型和Ⅱ型組動物之間無顯著性差異。這一結(jié)果和DCX染色結(jié)果一致，表明CA3區(qū)細胞丟失程度對SGZ的細胞增殖并無明顯影響；而BrdU標記6周后，Ⅱ型組動物齒狀回存留的BrdU免疫陽性細胞數(shù)量明顯減少，證明CA3區(qū)細胞丟失程度對SGZ新生細胞的存活能力造成了損害。因此，本研究結(jié)果表明Pilocarpine誘導(dǎo)的顳葉癲癇慢性期造成的CA3區(qū)細胞丟失可能通過影響齒狀回新生細胞，包括新生未成熟神經(jīng)元的存活能力而降低神經(jīng)元的新生。

CA3錐體細胞是齒狀回顆粒細胞的投射區(qū)，嚙齒類動物齒狀回的新生細胞在數(shù)周時間就可以向CA3區(qū)形成軸突投射[9]。生理情況下，50%～70%的海馬新生細胞可以存活并分化成神經(jīng)元[10]，說明海馬新生細胞即使在正常環(huán)境中也存在投射競爭。我們新近的研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇慢性期CA3區(qū)細胞丟失并沒有改變齒狀回局部神經(jīng)再生環(huán)境[9]。因此，顳葉癲癇CA3區(qū)細胞丟失使得海馬新生細胞失去投射區(qū)可能是造成新生細胞存活能力下降的重要原因。但其中的分子機制仍需進一步研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇慢性期海馬新生神經(jīng)元絕大部分形成了正確的結(jié)構(gòu)整合[9]。很多研究者也認為促進顳葉癲癇慢性期海馬神經(jīng)再生對海馬神經(jīng)構(gòu)筑具有修復(fù)作用，并可能改善疾病的轉(zhuǎn)歸[11-12]。因此，本研究不僅證實了齒狀回以外的區(qū)域也參與癲癇慢性期海馬神經(jīng)再生的調(diào)控，也為建立促進顳葉癲癇慢性期海馬神經(jīng)再生策略提供線索。

參考文獻：

[1] BIELEFELD P, VAN VLIET EA, GORTER JA, et al. Different subsets of newborn granule cells: a possible role in epileptogenesis?[J]. Eur J Neurosci, 2014, 39(1):1-11.

[2] HATTIANGADY B, RAO MS, SHETTY AK. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus[J]. Neurobiol Dis, 2004, 17(3):473-490.

[3] ZHANG X, LIU T, ZHOU Z, et al. Enriched environment altered aberrant hippocampal neurogenesis and improved long-term consequences after temporal lobe epilepsy in adult rats[J]. J Mol Neurosci, 2015, 56(2):409-421.

[4] SHETTY AK, ZAMAN V, SHETTY GA. Hippocampal neurotrophin levels in a kainate model of temporal lobe epilepsy: a lack of correlation between brain-derived neurotrophic factor content and progression of aberrant dentate mossy fiber sprouting[J]. J Neurochem, 2003, 87(1):147-159.

[5] LIU JX, PIONOCK SB, HERBERT J. Novel control by the CA3 region of the hippocampus on neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat[J]. PLoS One, 2011, 6(3):e17562.

[6] LIU JX, HU M, CHEN XL, et al. Reduced expression of phospholipase C beta in hippocampal interneuron during pilocarpine induced status epilepticus in mice[J]. Neurochem Int, 2014, 68:10-17.

[7] KEE N, TEIXEIRA CM, WANF AH, et al. Preferential incorporation of adult-generated granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus[J]. Nat Neurosci, 2007, 10(3):355-362.

[8] KARA N, NARAYANAN S, BELMAKER RH, et al. Chronic lithium treatment enhances the number of quiescent neural progenitors but not the number of DCX-positive immature neurons[J]. Int J Neuropsychopharmacol, 2015, 18(7):pyv003.

[9] HU M, ZHU K, CHEN XL, et al. Newly generated neurons at 2 months post-status epilepticus are functionally integrated into neuronal circuitry in mouse hippocampus[J]. Exp Neurol, 2015, 273(2015):273-287.

[10] PRICKAERTS J, KOOPMANS G, BLOKLAND A, et al. Learning and adult neurogenesis: survival with or without proliferation?[J]. Neurobiol Learn Mem, 2004, 81(1):1-11.

[11] PARADISO B, MARCONI P, ZUCCHINI S, et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(17):7191-7196.

[12] KURUBA R, HATTIANGADY B, SHETTY AK. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy[J]. Epilepsy Behav, 2009, 14(Suppl 1):65-73.

(編輯邱芬)

收稿日期：2016-03-03修回日期：2016-03-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目資助(No.81171232, 81371427)

通訊作者：劉建新. E-mail: liujianxin@mail.xjtu.edu.cn

中圖分類號：R322.8

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604002

Effect of cell loss in the CA3 area on hippocampal neurogenesis in chronically epileptic mice

HU Ming1,2, ZHU Kun1, ZHANG Jian-shui2, LIU Jian-xin1

(1. Institute of Neurobiology, 2. Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the influence of cell loss in the CA3 area on hippocampal neurogenesis in mice with temporal lobe epilepsy. MethodsNewly born cells in the subgranular zone (SGZ) of dentate gyrus were labeled by the proliferation marker bromodeoxyuridine (BrdU) at 2 months after pilocarpine-induced status epilepticus. Double labeling of BrdU+NeuN was carried out to compare neuronal differentiation between type Ⅰ and Ⅱ mice, which represented partial cell loss and almost complete cell loss in the CA3 area, respectively. DCX and BrdU single staining were made to analyze the proliferation of progenitor cells in SGZ and the survival of the newly born cells. ResultsWhen compared with that of the type Ⅱ mice, the number of double labeled cells of BrdU+NeuN in the subgranular zone-granule cell layer (SGZ-GCL) in the type Ⅰ mice increased significantly (P<0.05). However, the percentages of double labeled cells in all the BrdU+ cells were found to be similar between the two groups (P>0.05). No significant difference in the number of DCX+ cells in SGZ was found between the type Ⅰ and Ⅱ mice (P>0.05). At 6 weeks after BrdU labeling, more remaining BrdU+ cells were found in the SGZ-GCL in the type Ⅰ mice when compared with their counterparts in the type Ⅱ mice (P<0.05). ConclusionThe cell loss in the CA3 area of pilocarpine-induced epileptic mice contributes to the declined hippocampal neurogenesis by exerting negative effects on the survival of newly born cells.

KEY WORDS:temporal lobe epilepsy; hippocampus; dentate gyrus; neurogenesis; neuron

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81171232 and 81371427)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0857.004.html(2016-06-08)