GnRH主動(dòng)免疫雌性大鼠調(diào)控機(jī)制研究

曹曉涵，韓興發(fā)，杜小剛，陳志渝，孟風(fēng)艷，儲(chǔ)明星，曾憲垠*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，雅安 625014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

?

GnRH主動(dòng)免疫雌性大鼠調(diào)控機(jī)制研究

曹曉涵1，韓興發(fā)1，杜小剛1，陳志渝1，孟風(fēng)艷1，儲(chǔ)明星2，曾憲垠1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，雅安 625014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

摘要：旨在探討GnRH主動(dòng)免疫雌性SD大鼠的調(diào)控機(jī)制。24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為免疫組、卵巢切除組和空白對(duì)照組(n=8)，免疫組于12周齡注射疫苗，4周后加免；卵巢切除組11周齡外科手術(shù)摘除卵巢；空白對(duì)照組不作任何處理。使用放射免疫分析法測(cè)定血清激素E2、P4、FSH和LH含量，熒光定量PCR分析各基因mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，主動(dòng)免疫顯著降低血清E2、P4、FSH和LH含量，至56周處死時(shí)，E2和LH含量有微弱上升，但4種激素含量均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，主動(dòng)免疫顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA，垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA的表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)果表明，GnRH主動(dòng)免疫能顯著抑制雌性SD大鼠性腺發(fā)育，降低血清性激素含量，通過(guò)下丘腦ER-αmRNA-GPR54/KiSS-1通路保持動(dòng)物較長(zhǎng)時(shí)間去勢(shì)；但GnRH主動(dòng)免疫造成的動(dòng)物去勢(shì)存在恢復(fù)的可能。

關(guān)鍵詞：GnRH；主動(dòng)免疫；調(diào)控；機(jī)制；雌性大鼠

由于存在發(fā)情行為，飼養(yǎng)雌性動(dòng)物不僅難于管理，更有可能因?yàn)闊o(wú)計(jì)劃懷孕帶來(lái)諸多問(wèn)題[1]；而對(duì)于雌性野生動(dòng)物，對(duì)其進(jìn)行避孕能更好的地控制動(dòng)物數(shù)量，方便管理，也能減輕過(guò)度的動(dòng)物數(shù)量給自然環(huán)境帶來(lái)的壓力[2]。研究表明，GnRH主動(dòng)免疫雌性SD大鼠有很好的去勢(shì)效果[3]：雌性SD大鼠接受GnRH主動(dòng)免疫后直至16wpv(Weekspostvaccine)，抗體滴度仍保持較高水平，且血清生殖激素維持極低水平。但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，接受GnRH主動(dòng)免疫的雌性SD大鼠血清生殖激素、下丘腦-垂體-性腺軸各個(gè)生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化規(guī)律還未見(jiàn)報(bào)道。本研究即對(duì)雌性大鼠主動(dòng)免疫GnRH去勢(shì)疫苗，考察初次免疫56周后其生殖激素和生殖相關(guān)基因的變化情況，探討雌性動(dòng)物GnRH主動(dòng)免疫的調(diào)控機(jī)制，為GnRH主動(dòng)免疫去勢(shì)疫苗更廣泛的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

GnRH并列二聚體卵清蛋白復(fù)合物(本實(shí)驗(yàn)室合成)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR染料SYBRPremixExTaqTMⅡ(PerfectRealTime)、RNAisoPlus(TaKaRa公司)；LH、FSH、E2、P4碘[125I]放射免疫分析藥盒(北京北方生物研究所人源性試劑盒)。

1.2動(dòng)物選取、分組及處理

24只健康性成熟Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，10周齡，體重180～220g(購(gòu)自四川大學(xué)華西動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為3組，分別是組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ(n=8)。組Ⅰ為免疫組(FemaleImmuneGroup，fIG)。12周齡時(shí)腿部肌肉注射1mL疫苗，4周后加免，加免時(shí)注射劑量及方法同初次免疫。組Ⅱ?yàn)槁殉睬谐M(Ovariectomygroup，OVX)。11周齡時(shí)進(jìn)行手術(shù)。3%戊巴比妥鈉，按照30mg·kg-1體重腹腔注射麻醉。麻醉成功后趴臥，常規(guī)消毒，備皮。在大鼠腰部腎區(qū)偏下中間位置(距離脊柱約1cm位置)開(kāi)口，切除卵巢。術(shù)后前3d每天肌肉注射青霉素2萬(wàn)U，同時(shí)使用硫酸慶大霉素注射液沖洗傷口，觀察傷口愈合情況。組Ⅲ為空白對(duì)照組(Controlgroup，Con)，不作任何處理。試驗(yàn)期間所有動(dòng)物均按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水和采食。

1.3樣品采集及處理

初次免疫當(dāng)天記為0wpv。初免當(dāng)天起至8wpv每2周空腹尾尖采血1次，從第8wpv起每4周空腹尾尖采血1次，每次1.5mL，直至處死(56wpv)。所有血樣于4 ℃放置過(guò)夜，3 500r·min-1，4 ℃離心15min，分離血清，-20 ℃保存，用于測(cè)定血清激素含量。

各組大鼠于56wpv(初免后第14個(gè)月)斷頸處死，處死后迅速分離下丘腦、垂體，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取總RNA；fIG和Con分離雙側(cè)卵巢，去除脂肪組織，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取總RNA。

1.4血清激素含量測(cè)定

應(yīng)用RIA測(cè)定雌鼠血清中FSH、LH、E2和P4含量，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5基因表達(dá)測(cè)定

使用苯酚-氯仿法提取各組織總RNA，電泳檢測(cè)其完整性。完整RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板在特定引物下進(jìn)行定量檢測(cè)，內(nèi)參基因選擇β-actin。每個(gè)樣品3次重復(fù)。PCR程序：預(yù)變性95 ℃10s；變性95 ℃5s；退火延伸58～60 ℃25s；讀取熒光值，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析(58～60) ℃直至95 ℃，每0.5 ℃恒溫5s。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算，熒光定量PCR結(jié)果使用Bio-RadCFXManager2.1 分析軟件處理。引物序列見(jiàn)表1。1.6統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS20.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，采用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)間比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)”表示。P<0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

表1　引物序列

KiSS-1.KiSSpeptin編碼基因；GPR54.KiSSpeptin受體編碼基因；GnRH.促性腺激素釋放激素；GnRH-R.促性腺激素釋放激素受體；LH-β.促黃體生成素β亞基；FSH-β.促卵泡生成素β亞基；LH-R.促黃體生成素受體；FSH-R.促卵泡生成素受體；ER-α.雌激素α受體；β-actin.β-肌動(dòng)蛋白

KiSS-1.KiSSpeptinencodinggene；GPR54.KiSSpeptinreceptorencodinggene；GnRH.Gonadotropin-releasinghormone；GnRH-R.Gonadotropin-releasinghormonereceptor；LH-β.Luteinizinghormoneβsubunit；FSH-β.Folliclestimulatinghormoneβsubunit；LH-R.Luteinizinghormonereceptor；FSH-R.Folliclestimulatinghormonereceptor；ER-α.Estrogenαreceptor；β-actin.β-myosin

2結(jié)果

2.1RNA完整性

M.RNA marker;1～4.總RNA樣品M.RNA marker;1-4.Tatol RNA samples圖1　總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.1　Total RNA electrophoresis with agarose gel(1%) image

1%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1)，提取的總RNA樣品28S和18S條帶清晰，5S條帶基本可見(jiàn)，無(wú)DNA污染和降解，純度符合標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2.2血清激素含量

2.2.1雌鼠血清E2含量雌鼠血清E2含量如圖2A所示，箭頭表示免疫時(shí)間。fIG血清E2濃度在初次免疫后便急劇下降，6wpv時(shí)即處于檢測(cè)限附近，顯著低于Con(20.6～29.9pg·mL-1)(P<0.05)，并一直維持與OVX相同水平至48wpv，從52wpv時(shí)，E2含量出現(xiàn)微弱上升，至試驗(yàn)結(jié)束(56wpv)時(shí)，仍然顯著低于Con(P<0.05)。OVX血清E2含量在0wpv時(shí)，即已處于極低水平，從2wpv開(kāi)始低至不可測(cè)水平，顯著低于Con(P<0.05)。

2.2.2雌鼠血清P4含量雌鼠血清P4含量如圖2B所示，箭頭表示免疫時(shí)間。Con血清P4含量整個(gè)試驗(yàn)期間保持較穩(wěn)定狀態(tài)，波動(dòng)為15.97～21.91ng·mL-1。初次主動(dòng)免疫后，fIG血清P4含量下降，加強(qiáng)免疫繼續(xù)快速下降，至28wpv時(shí)低至不可測(cè)水平，顯著低于Con(P<0.05)。與血清E2含量變化情況類似，OVX血清P4含量在0wpv時(shí)即已處于極低水平，從6wpv開(kāi)始低至不可測(cè)水平，顯著低于Con(P<0.05)。

2.2.3血清FSH含量雌性大鼠血清FSH含量見(jiàn)圖2C，箭頭表示免疫時(shí)間。在整個(gè)試驗(yàn)期間Con血清FSH含量維持平穩(wěn)，波動(dòng)為3.19～4.28mIU·mL-1。主動(dòng)免疫引起雌性大鼠血清FSH含量下降，初次免疫后，第2周開(kāi)始便顯著低于Con(P<0.05)，從8wpv直至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的56wpv，血清FSH含量一直保持在不可測(cè)的低水平。OVX血清FSH濃度從手術(shù)后開(kāi)始升高，顯著高于Con(P<0.05)。

2.2.4血清LH含量雌性大鼠血清LH含量見(jiàn)圖2D，在整個(gè)試驗(yàn)期間Con血清LH含量維持較平穩(wěn)狀態(tài)，在3.68～4.44mIU·mL-1波動(dòng)。主動(dòng)免疫引起雌性大鼠血清LH含量下降，初次免疫后，第2周開(kāi)始便顯著低于Con(P<0.05)，從8～40wpv，血清LH含量一直保持在不可測(cè)的低水平。從44wpv開(kāi)始，血清LH含量緩慢上升，但是至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的56wpv，仍顯著低于Con(P<0.05)。OVX血清LH濃度從手術(shù)后開(kāi)始升高，顯著高于Con(P<0.05)。

圖2　雌鼠血清E2(pg·mL-1)、P4(ng·mL-1)、FSH(mIU·mL-1)和LH(mIU·mL-1)含量變化Fig.2　Serum E2，P4，F(xiàn)SH and LH levels of female rats

綜上表明，主動(dòng)免疫能顯著降低雌性大鼠血清E2、P4、FSH和LH含量，并能保持長(zhǎng)達(dá)56wpv。

2.3下丘腦-垂體-性腺軸生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化

2.3.1下丘腦生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)變化情況如圖3a，試驗(yàn)56wpv時(shí)，觀察到GnRH主動(dòng)免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA表達(dá)(P<0.05)；外科去勢(shì)手術(shù)也同樣顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA的表達(dá)(P<0.05)。

2.3.2垂體生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化垂體生殖相關(guān)基因表達(dá)變化情況如圖3b，試驗(yàn)56wpv時(shí)，觀察到與Con相比，GnRH主動(dòng)免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠垂體GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表達(dá)(P<0.05)；而外科去勢(shì)手術(shù)顯著上調(diào)雌性SD大鼠垂體GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表達(dá)(P<0.05)。

2.3.3卵巢生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化卵巢生殖相關(guān)基因表達(dá)情況如圖3c所示，試驗(yàn)56wpv時(shí)，觀察到GnRH主動(dòng)免疫顯著下調(diào)雌性SD大鼠卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表達(dá)情況(P<0.05)。

*.與空白組相比差異顯著Compared to intact controls，* donates a significant difference圖3　GnRH主動(dòng)免疫對(duì)下丘腦、垂體和卵巢生殖相關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3　Effects of active immunization against GnRH on the mRNA expression levels of hypothalamic GnRH and ER-α

綜上所述，GnRH主動(dòng)免疫對(duì)雌鼠生殖相關(guān)基因mRNA的表達(dá)調(diào)控有顯著的長(zhǎng)期的影響：明顯下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA、垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表達(dá)水平。而外科去勢(shì)對(duì)雌鼠生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)調(diào)控有不同影響：顯著下調(diào)下丘腦GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA；顯著上調(diào)垂體GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA表達(dá)水平。

3討論

有研究結(jié)果表明，接受GnRH主動(dòng)免疫的動(dòng)物其血清促性腺激素及性激素濃度[4-6]均有降低。本研究也得到相似結(jié)果。P4和E2是由卵巢分泌的重要孕激素和雌激素，本研究中免疫雌鼠血清P4和E2含量均顯著低于空白組，顯示達(dá)到了很好的免疫去勢(shì)效果，這與GnRH主動(dòng)免疫動(dòng)物的研究結(jié)果一致[5，7]。并且，fIG和OVX血清P4和E2含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明在進(jìn)行GnRH主動(dòng)免疫56wpv后，fIG保持與去卵巢大鼠一樣的去勢(shì)效果。GnRH主動(dòng)免疫雌鼠后，血清FSH、LH、P4及E2含量與空白對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)，這與GnRH主動(dòng)免疫動(dòng)物的研究結(jié)果一致。

Kisspeptin-GPR54信號(hào)系統(tǒng)通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)GnRH來(lái)控制排卵周期，位于下丘腦前腹側(cè)室周核(AVPV)的kisspeptin神經(jīng)細(xì)胞引發(fā)產(chǎn)生GnRH分泌峰，繼而調(diào)控雌激素對(duì)GnRH的正反饋調(diào)節(jié)[8]；其余位于下丘腦ARC的kisspeptin神經(jīng)細(xì)胞則參與GnRH的產(chǎn)生和雌激素對(duì)GnRH分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[9]。有報(bào)道研究E2對(duì)小鼠前腦KiSS-1系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。位于弓狀核的KiSS-1基因，在卵巢切除的小鼠中表達(dá)升高，在卵巢切除后，雌激素替代治療的小鼠中表達(dá)降低：而位于前腹面室旁核的KiSS-1基因的表達(dá)正好與此相反。由此得出結(jié)論：位于弓狀核的KiSS-1神經(jīng)元可能在GnRH分泌的負(fù)反饋中起到一定作用，而位于AVPV的KiSS-l可能參與了GnRH分泌的正反饋調(diào)節(jié)，并且通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)E2對(duì)KiSS-1的效應(yīng)主要是通過(guò)ER-α介導(dǎo)的[10]。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦GnRH信號(hào)的上調(diào)可促進(jìn)垂體FSH和LH合成和分泌，提高血液P4、E2濃度，從而改善母鵝繁殖性能[11]。反之，GnRH信號(hào)的下調(diào)則抑制垂體FSH和LH的合成和分泌，與本研究結(jié)果一致。垂體FSH和LH的合成與分泌受下丘腦直接調(diào)控，GnRH主動(dòng)免疫降低下丘腦GnRH含量[12-13]，繼而導(dǎo)致FSH和LH分泌減少。

去勢(shì)的雄性恒河猴模型，青春期組KiSS-1mRNA表達(dá)明顯高于少年組，但GPR54mRNA水平無(wú)差別；雌性恒河猴模型青春期組KiSS-1mRNA和GPR54mRNA水平都顯著高于少年組，表明KiSS-1受體和配體共同參與中樞神經(jīng)生殖內(nèi)分泌調(diào)控[14]。本研究也得到一致結(jié)論：GnRH主動(dòng)免疫后，下丘腦GPR54和KiSS-1mRNA表達(dá)水平均顯著下降。

在垂體水平，本研究發(fā)現(xiàn)GnRG主動(dòng)免疫56wpv后，GnRH-RmRNA和LH-βmRNA仍處于顯著低于Con的水平，而FSH-βmRNA表達(dá)開(kāi)始上升，接近Con，二者表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。下丘腦正中隆起分泌的GnRH通過(guò)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)垂體前葉與GnRH-R結(jié)合產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，刺激FSH和LH的合成和釋放。有研究表明，對(duì)大鼠使用GnRH拮抗劑會(huì)下調(diào)垂體GnRH-RmRNA的數(shù)量[15]；另外，M.Lopot[16]等學(xué)者給母羊第三腦室灌注GnRH，觀察到腺垂體中GnRH-RmRNA含量升高。這些結(jié)果說(shuō)明垂體GnRH-RmRNA的數(shù)目的穩(wěn)定維持需要GnRH激素參與，原因是GnRH的存在能夠刺激GnRH-RmRNA的表達(dá)或增加GnRH-RmRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。垂體GnRH-RmRNA的數(shù)目的穩(wěn)定維持需要GnRH激素參與，結(jié)合本研究結(jié)果可推測(cè)，主動(dòng)免疫后，雌鼠下丘腦GnRH激素的分泌受到影響，至56wpv時(shí)，GnRH的分泌可能還未恢復(fù)至正常水平。

此外，GnRH主動(dòng)免疫還顯著下調(diào)了卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA的表達(dá)(P<0.05)，與前人研究成果一致[17]。由此可推斷GnRH主動(dòng)免疫通過(guò)下調(diào)卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA基因表達(dá)，降低卵巢FSH-R和LH-R數(shù)量，在性腺水平減弱甚至阻止FSH和LH對(duì)性腺自身發(fā)育的作用，達(dá)到去勢(shì)效果。本研究還表明，卵巢ER-αmRNA表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，同樣是因?yàn)橥庵艿秃康腅2影響其受體mRNA的表達(dá)[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，在進(jìn)行主動(dòng)免疫后的56wpv，雌性大鼠仍然保持很好的去勢(shì)狀態(tài)，這為將GnRH免疫去勢(shì)疫苗推廣到控制野生動(dòng)物數(shù)量提供了較好的理論依據(jù)。由于野生動(dòng)物在野外活動(dòng)的不確定性[21]，為定時(shí)定點(diǎn)免疫造成了一定障礙。而本研究對(duì)雌性動(dòng)物進(jìn)行間隔僅一個(gè)月的兩次免疫即可造成長(zhǎng)達(dá)一年的去勢(shì)狀態(tài)。若能在動(dòng)物的發(fā)情期之前有針對(duì)地對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，可以保證動(dòng)物順利度過(guò)發(fā)情期而不會(huì)導(dǎo)致懷孕。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]THOMPSONDL.ImmunizationagainstGnRHinmalespecies(comparativeaspects)[J].Anim Reprod Sci，2000，60-61:459-469.

[2]POWERSJG，BAKERDL，DAVISTL，etal.Effectsofgonadotropin-releasinghormoneimmunizationonreproductivefunctionandbehaviorincaptivefemalerockymountainelk(Cervuselaphusnelsoni)[J].Biol Reprod，2011，85(6):1152-1160.

[3]曹曉涵，韓興發(fā)，陳志渝，等.GnRH主動(dòng)免疫對(duì)雌鼠下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，28(2):335-342.

CAOXH，HANXF，CHENZY，etal.EffectsofactiveimmunizationagainstGnRHonregulationofthehypothalamic-pituitary-ovarianaxisinfemalerats[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2014，28(2):335-342.(inChinese)

[4]王霜，曾憲銀，徐賢坤，等.新蛋白構(gòu)型GnRH多肽疫苗對(duì)公兔生殖性能的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，22(4):529-532.

WANGS，ZENGXY，XUXK，etal.EffectsofactiveimmunizationwithnewGnRH-likedvaccineonreproductionperformanceofrabbit[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2008，22(4):529-532.(inChinese)

[5]ZENGXY，TURKSTRAJA，TSIGOSA，etal.EffectsofactiveimmunizationagainstGnRHonserumLH，inhibinA，sexualdevelopmentandgrowthrateinChinesefemalepigs[J].Theriogenology，2002，58(7):1315-1326.

[6]WEIS，GONGZ，WEIM.StudiesofGnRH-AactiveimmunizationeffectsonLHandFSHsecretionandhistostructureoftheovaryanduterusinrabbits[J]. Agr Sci China，2011，10(10)：1630-1637.

[7]BISHOPDK，WETTEMANNRP，YELICHJV，etal.Ovarianresponseaftergonadotropintreatmentofheifersimmunizedagainstgonadotropin-releasinghormone[J].J Anim Sci，1996，74(5):1092-1097.

[8]KAUFFMANAS.SexualdifferentiationandtheKiss1system：hormonalanddevelopmentalconsiderations[J].Peptides，2009，30(1)：83-93.

[9]MCCUEJM，QUIRKCC，NELSONSE，etal.Expressionofamurinegonadotropin-releasinghormonereceptor-luciferasefusiongeneintransgenicmiceisdiminishedbyimmunoneutralizationofgonadotropin-releasinghormone[J].Endocrinology，1997，138(8)：3154-3160.

[10]SMITHJT，DUNGANHM，STOLLEA，etal.DifferentialregulationofKiSS-1mRNAexpressionbysexsteroidsinthebrainofthemalemouse[J].Endocrinology，2005，146(7)：2976-2984.

[11]趙鑫，邵濤，王亞琴，等.維生素、礦物質(zhì)與能量蛋白質(zhì)水平對(duì)浙東白鵝母鵝繁殖性能、血液生殖激素濃度及生殖軸相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24(6):1110-1118.

ZHAOX，SHAOT，WANGYQ，etal.Effectsofvitamin，mineral，andenergyandproteinlevelsonreproductiveperformance，bloodreproductivehormoneconcentrationsandrelatedgenemRNArelativeexpressioninreproductiveaxisoffemaleZhedongWhitegeese[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2012，24(6):1110-1118.(inChinese)

[12]FANGF，LIH，LIUY，etal.ActiveimmunizationwithrecombinantGnRHfusionproteininboarsreducesbothtesticulardevelopmentandmRNAexpressionlevelsofGnRHreceptorinpituitary[J]. Anim Reprod Sci，2010，119(3-4):275-281.

[13]CLARKEIJ，BROWNBW，TRANVV，etal.Neonatalimmunizationagainstgonadotropin-releasinghormone(GnRH)resultsindiminishedGnRHsecretioninadulthood[J].Endocrinology，1998，139(4):2007-2014.

[14]SHAHABM，MASTRONARDIC，SEMINARASB，etal.IncreasedhypothalamicGPR54signaling：apotentialmechanismforinitiationofpubertyinprimates[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(6):2129-2134.

[15]CASAEM，RAGAF，BONILLA-MUSOLESF，etal.Humanoviductalgonadotropin-releasinghormone：possibleimplicationsinfertilization，earlyembryonicdevelopment，andimplantation[J].J Clin Endocrinol Metab，2000，85(4):1377-1381.

[16]LOPOTM，CIECHANOWSKAM，MALEWSKIT，etal.ChangesintheGnRHmRNAandGnRHreceptor(GnRH-R)mRNAlevelsinthehypothalamic-anteriorpituitaryunitofanestrousewesafterinfusionofGnRHintothethirdcerebralventricle[J].Reprod Biol，2008，8(2):149-161.

[17]AWONIYICA，SANTULLIR，CHANDRASHEKARV，etal.Quantitativerestorationofadvancedspermatogeniccellsinadultmaleratsmadeazoospermicbyactiveimmunizationagainstluteinizinghormoneorgonadotropin-releasinghormone[J].Endocrinology，1989，125(3):1303-1309.

[18]楊利平，吳耀松，劉輝，等.雌激素受體α在小鼠海馬中的表達(dá)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2012，21(4):322-326.

YANGLP，WUYS，LIUH，etal.Investigationonexpressionofestrogenreceptoralphainmousehippocampus[J].Acta Laser Biology Sinica，2012，21(4):322-326.(inChinese)

[19]樊官偉，何俊，王虹，等.雌激素及其受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2007，12(3):266-269.

FANGW，HEJ，WANGH，etal.Advancesinstudyofestrogenanditsreceptorssignaltransductionpathway[J].Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics，2007，12(3):266-269.(inChinese)

[20]陳秀霞，鄧益鋒，周振雷，等.雌激素和雄激素對(duì)雞成骨細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及其受體mRNA轉(zhuǎn)錄的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(5):116-120.

CHENXX，DENGYF，ZHOUZL，etal.Effectsofestradiolandtestosteroneonproliferation，apoptosis，cellcycle，andmRNAtranscriptionofestrogenreceptorandandrogenreceptorinchickenosteoblasts[J].Journal of Nanjing Agricultural University，2010，33(5):116-120.(inChinese)

[21]LOWELLAM.Deliveryofimmunocontraceptivevaccinesforwildlifemanagement[J].Contracept Wildlife Manag，1993，10:49-58.

(編輯程金華)

RegulatoryMechanismsofActiveImmunizationagainstGnRHinFemaleRatsandItsMechanism

CAOXiao-han1，HANXing-fa1，DUXiao-gang1，CHENZhi-yu1，MENGFeng-yan1，CHUMing-xing2，ZENGXian-yin1*

(1.College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China)

Abstract:ToexploretheregulatorymechanismsofactiveimmunizationagainstGnRHinfemaleSDrats.24adultfemaleSDratswereallocatedto3groupsof8animalseachrandomly.8ratswereimmunizedagainstGnRHat12weekofage，4weekslateranequaldoseboosterwasadministered.8ratsweresurgicallyovarictomyat11weekofagewhile8intactratswithoutanytreatments.Bloodsampleswerecollectedatday0(0wpv)untiljustbeforesacrificedat56wpv.SerumlevelsofFSH，LH，E2andP4weredeterminedusingRIA.Aftersacrificed，hypothalamusandpituitarywereremoved，themRNAexpressionsofreproduction-relatedgenesweredeterminedbyreal-timefluorescencequantitativePCR(RT-PCR)；Ovarieswereexcised，adiposetissueswereremoved，thenthemRNAexpressionsforreproduction-relatedgenesweredeterminedbyRT-PCR.AfterimmunizationtwiceagainstGnRH，theconcentrationsofE2，P4，F(xiàn)SHandLHinimmunizedratsshowedasignificantlylowerthanthatinControlgroup(P<0.05).Moreover，activeimmunizationagainstGnRHsignificantlydown-regulatedthemRNAlevelsofGnRH，GPR54，KiSS1andER-αinthehypothalamus，GnRH-R，F(xiàn)SH-β and LH-βinthepituitary(P<0.05)，aswellasFSHR，LHRandER-αinovaries(P<0.05).ThisstudyindicatedGnRHhadexcellentimmunogenicandwasagoodalternativeofsurgicalcastration.ActiveimmunizationagainstGnRHcauseanimalsinalong-terminfertilityorsterilitybythefeedbackloopofER-α- GPR54/KiSS-1，andthefertilityofimmunocastratedratsshowatendancytorecover.

Keywords:GnRH；activeimmunization；regulatory；mechanisms；femalerat

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.011

收稿日期：2015-05-27

基金項(xiàng)目：四川省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2012HH0013)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃(00770107)

作者簡(jiǎn)介：曹曉涵(1984-)，女，四川成都人，講師，博士，主要從事生殖免疫調(diào)控研究，E-mail：caoxiaohan2007@hotmail.com *通信作者：曾憲垠，研究員，主要從事動(dòng)物生殖免疫調(diào)控研究，E-mail：xyzeng1966@163.com

中圖分類號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0502-07