某國產NAT試劑盒應用于血液篩查的評價與應用

陳志忠　李結敏　廖揚勛　梁劍鋒　余文潮　譚曉穎　梁麗婷　黃鉅明　陸倩文　陳尚良

?

某國產NAT試劑盒應用于血液篩查的評價與應用

陳志忠李結敏廖揚勛梁劍鋒余文潮譚曉穎梁麗婷黃鉅明陸倩文陳尚良★

［摘要］目的評估、驗證某國產血液NAT試劑盒用于血液篩查的技術性能指標。方法對某國產血液NAT試劑盒進行了靈敏度、特異性、重復性、抗干擾能力和抗污染能力測試，并將其初步用于血液篩查。結果乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）RNA三者檢測靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL；特異性、重復性、抗污染能力能滿足血站血液核酸檢測需求；混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會導致HIV RNA的漏檢，溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。結論某國產NAT檢測分析系統(tǒng)的靈敏度、特異性、重復性、抗污染能力等指標均達《血站核酸檢測質量控制指南》要求，脂肪血、溶血樣本能明顯干擾HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的檢出能力。

［關鍵詞］血液篩查；核酸檢測；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

★通訊作者：陳尚良，E-mail：fimmu2000@163.com

為避免經輸血傳播疾病，各國采供血機構都對獻血者進行了嚴格的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）病毒抗原或抗體檢測。但血清學檢測技術存在“窗口期”、病毒變異、免疫沉默等造成的漏檢，血液的病毒安全性問題是全球關注的焦點問題［1］。為保障輸血安全，世界各國不斷開發(fā)和引進新的血液篩查技術［2-5］。為了進一步保障血液安全，我們國家提出了“十二五”期末實現血液核酸檢測全覆蓋的目標。然而，進口核酸檢測（nucleic acid test，NAT）試劑成本較高，綜合考慮國家政策導向和自身實際情況，我們對國產產品—達安基因血液NAT試劑盒進行了評估，并應用于血液核酸檢測，現把研究報告如下。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

ChemagicSTAR核酸提取儀（HAMILTON，瑞士），ABI7500實時熒光定量PCR儀（Life Technologies，美國），核酸分離試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司），核酸檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司），外部質控品（中山大學達安基因股份有限公司）。

1.2靈敏度試驗

按照廠家說明書要求，將外部質控品分別稀釋至2倍檢測極限（limit of detection，LOD）、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/ mL、50 IU/mL，單采用檢模式進行3次檢測。檢測標準：1倍LOD處濃度應100%檢出。

1.3特異性試驗

將8份陰性質控品混合至一個pool檢測；將8份陽性質控品混合至一個pool檢測，然后再進行拆分檢測。檢測標準：陰性、陽性樣品應該全部檢出。

1.4重復性試驗

將陽性質控品每次隨機進行混樣檢測，共檢測8次；將陰性質控品采用單檢模式進行8管檢測。檢測標準：陰性、陽性樣品應該全部檢出。

1.5抗污染能力試驗

將8份陰性血漿樣本和8份陽性質控品，按照一陰一陽交叉排列，進行檢測（單檢模式）。檢測標準：陰性、陽性樣品應該全部檢出。

1.6抗干擾能力試驗

將陽性質控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認為陰性），制備為含相應干擾物的陽性樣本，再進行檢測（單檢模式）。檢測標準：陰性、陽性樣品應該全部檢出。

1.7血液樣本NAT檢測

全血樣本進行4項目［乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、HCV抗體（Anti-HCV）、HIV抗體（Anti-HIV）、梅毒抗體］2遍酶聯免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），全項陰性的樣本進行NAT混樣檢測，呈反應性的檢測pool再進行拆分確認試驗，檢測流程參見圖1。

2　結果

2.1靈敏度試驗

按照廠家說明書要求，將外部質控品分別稀釋至2倍LOD、1倍LOD、0.5倍LOD，即濃度分別200 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL，進行3次檢測（單檢模式），HBV DNA與HCV RNA在0.5倍LOD處均全部檢出，HIV RNA在1倍LOD處全部檢出，即HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者檢測靈敏度分別為50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/ mL，符合試劑說明書所描述的性能，滿足檢測要求，結果見表1。

2.2特異性試驗

將8份陰性質控品混合至一個pool檢測，結果顯示為陰性；將8份陽性質控品混合至一個pool檢測，結果顯示為陽性，然后再進行拆分檢測，8管全部為陽性。

2.3重復性試驗

將陽性質控品每次隨機進行混樣檢測，共檢測8次，均為陽性；將陰性質控品采用單檢模式進行8管檢測，結果均為陰性。

表1　NAT檢測分析系統(tǒng)靈敏度試驗評價Table 1　The evaluation of sensitivity for NAT Kit

2.4抗污染能力試驗

將8份陰性血漿樣本和8份陽性質控品按照一陰一陽交叉排列，進行檢測（單檢模式），陰性和陽性樣本全部通過，交叉污染率為0。

2.5抗干擾能力試驗

將陽性質控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血樣本（已確認為陰性），制備為含相應干擾物的陽性樣本，再進行檢測（單檢模式）。結果顯示脂肪血對混檢模式下HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出均無影響，但在單檢模式下會導致HIV RNA的漏檢；溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾，結果見表2。

表2　干擾能力試驗Table 2　Interference ability test

2.6檢測拆分率與拆分陽性率評估

試運行至今，共檢測樣本462份，20批次檢測，其中pool陽性2份，拆分陽性2份，均為HBV DNA陽性，拆分率和拆分陽性率分別為10%和100%，經過全項血液篩查（ELISA法）后，HBV DNA檢出率為2/462（約4‰），結果見表3。

表3　血液NAT檢測試運行結果Table 3　Results of Blood NAT screen at first stage

3　討論

血液及血液制劑的病毒安全性一直是輸血安全的熱點問題［1，6］。至上世紀90年代，對輸血傳播疾病的篩查完全依賴于血清學試驗，甚至今天，血清學篩查技術依然是血液篩查的重要手段。1998年德國紅十字獻血服務中心，將自己創(chuàng)建的NAT方法應用于血液篩查，開啟了血液NAT新紀元。分子技術應用于血液篩查，可將HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分別由56天、70天、22天縮短為41天、12天和11天，使輸血傳播相關病毒的風險降到最低，更大程度地保障血液安全［7］。國外對血液NAT檢測的研究較早，積累了較多經驗，技術也較成熟，但由于試劑成本較高等原因，一直難以在國內全面推廣應用［8-11］。為了貫徹實施國家衛(wèi)計委關于“十二五”實現血液核酸檢測全覆蓋的目標以及響應國家關于大型醫(yī)療裝備優(yōu)先采購國產產品的號召，我們對某國產品牌的血液NAT試劑盒進行技術評價，并將其初步用于我站的血液篩查。

該國產品牌血液NAT試劑盒，采用混合8人份樣本進行核酸提取，然后分別進行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項擴增，最后通過實時讀取數據判斷是否具有反應性；反應性的pools再進行拆分確認試驗。為了驗證試劑盒的檢出靈敏度，我們采用外部質控品對試劑盒進行靈敏度進行評價，結果顯示HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測靈敏度分別為不高于50 IU/mL、50 IU/mL與100 IU/mL，均能達到國家相關要求。然而，與國際知名品牌相比，國產的試劑盒的靈敏度尚存在改進空間。例如Roche的MPX檢測系統(tǒng)、Novarits的Tigris Ultrio Plus系統(tǒng)其HIV最低檢測限能達到不高于50 IU/mL，HBV、HCV的最低檢出限更是達到了不高于10 IU/mL的高靈敏度。

為了評估該國產品牌血液NAT檢測系統(tǒng)的抗污染能力，我們模擬日常工作，將強陽性質控品與陰性質控品按照一陰一陽交叉排列，采用單檢模式進行核酸提取和擴展檢測試驗，結果顯示本檢測系統(tǒng)的抗污染能力滿足要求，只要操作規(guī)范，陽性樣本不會造成交叉污染導致樣品間或者實驗室污染。同時為了考察檢測系統(tǒng)的特異性，我們按前述樣本的排序，分別采用混檢和單檢模式進行核酸提取和擴展檢測試驗，其實驗結果也與預期相符合，顯示了較好的特異性。

樣本的質量是檢測結果的關鍵保證。在臨床檢測中，可以通過對患者下醫(yī)囑等措施，實施樣本采集前的質量控制，而且不合符質量控制要求的樣本，可以重新進行樣本采集。相比之下，無償獻血行為大多為自發(fā)性行為，樣本采集難以做到很好的采集前質量控制；同時考慮到血液制劑樣本朔源性等問題，對于脂肪血顆粒較多等不符合NAT檢測要求的樣本，也不可能仿效臨床檢測進行重新采樣。因此，我們對血液篩查樣本中最常見的脂肪顆粒、輕度溶血等不合符要求的樣本進行抗干擾試驗。我們的測試結果顯示：混檢模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的檢出基本不受脂肪血顆粒的影響，但在單檢模式下會導致HIV RNA的漏檢；溶血對HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的檢出均有明顯干擾。基于上述結果以及血液檢測工作的特點，提示我們在實際工作中，應該盡量避免溶血樣本，對于難以避免的脂肪血樣本，應該評估脂肪顆粒的嚴重程度，謹慎對待其核酸檢測陰性結果。

通過前述的技術指標評估，我們認為該國產品牌血液NAT試劑盒能滿足我們對血液篩查的技術要求，因此試將其用于我站的血液篩查。參考兄弟單位的做法以及廠家的推薦意見，我們初步擬定按照圖1的流程進行篩查。試運行期間，共檢測樣本462份，20批次檢測，其中pool陽性2份，拆分陽性2份，拆分率和拆分陽性率分別為10%和 100%。2份陽性樣本均為HBV DNA陽性，為了進一步確認獻血者感染狀況，我們追蹤獻血者重新采樣進行檢測，但由于各種原因，僅成功召回1號獻血者，采用HBV DNA定量檢測系統(tǒng)，能檢測到其體內存在低拷貝HBV DNA，同時其e抗原也為陽性，定義為隱匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）感染。以已經確認的數據來計算，經過ELISA過篩后，我們的HBV DNA檢出率為1/462；如果以2例陽性來計算，HBV DNA檢出率為2/462，與國內報道大體相近［12-16］，但遠高于國外的參與風險［17］。當然，我們試運行期間所取得的數據為小樣本，更多的檢測效能驗證有待后續(xù)開展，但毫無置疑的是，應用該國產品牌NAT試劑于血液篩查，將進一步提升血液安全特別是HBV病毒性安全。

參考文獻

［1］Baylis SA，Chudy M，Nübling CM.Standardization of NAT for blood-borne pathogens［J］.Transfus Med Hemother，2015，42（4）：211-218.

［2］陳尚良，鄭欣，曾月婷，等.第四代HIV抗原抗體檢測試劑在血液篩查中的應用［J］.分子診斷與治療雜志，2014，6（1）：30-32.

［3］Engelfriet CP，Reesink HW，Hernandez JM，et al.Implementation of donors screening for infectious agents transmitted by blood by nuclic acid technology［J］. Vox Sang，2002，8（2）：87-111.

［4］Kumar R，Gupta S，Kaur A，et al.Individual donornucleic acid testing for human immunodeficiency virus-1，hepatitis C virus and hepatitis B virus and its role in blood safety［J］.Asian J Transfus Sci，2015，9（2）：199-202.

［5］Jain R，Aggarwal P，Gupta GN.Need for nucleic acid testing in countries with high prevalence of transfusiontransmitted infections［J］.ISRN Hematol，2012，2012：718671.

［6］Chen SL，Zhang X，Chen ZZ，et al.Mutual blood donation is safer at small blood collection stations in China［J］.Transfusion and Apheresis Science，2015，53 （3）：31-39.

［7］Moiz B，Moatter T，Shaikh U，et al.Estimating window period blood donations for human immunodeficiency virus type 1，hepatitis C virus，and hepatitis B virus by nucleic acid amplification testing in Southern Pakistan［J］.Transfusion，2014，54（6）：1652-1659.

［8］Mohamud HS，Mohamed DH，Alqahtani FH，et al. Two years’experience of implementing molecular screening of hepatitis B virus，hepatitis C virus and human immunodeficiency virus 1，2 in Riyadh blood donors［J］.Transfusion and Apheresis Science，2015. Epub ahead of print.

［9］Cable R，Lelie N，Bird A.Reduction of the risk of transfusion-transmitted viral infection by nucleic acid amplification testing in the Western Cape of South Africa：A 5-year review［J］.Vox Sang，2013，10（4）：93-99.

［10］Jain R，Perkins J，Johnson ST，et al.A prospective study for prevalence and/or development of transfusiontransmitted infections in multiply transfused thalassemia major patients［J］.Asian J Transfus Sci，2012，6 （2）：151-154.

［11］葉賢林，曾昭鑒，楊寶成，等.國產核酸擴增（PCR）試劑在獻血者血液HBV DNA篩查中的應用研究［J］.2007，6（5）：301-306.

［12］任芙蓉，王憬惺，趙海燕，等.我國5城市合格獻血者血液HIV及HCV殘余風險研究［J］.中國輸血雜志，2007，20（6）：469-475.

［13］吳丹霄，吳亞玲，呂杭軍.核酸檢測在獻血篩查中的應用［J］.浙江預防醫(yī)學，2015，27（5）：501-503.

［14］曹曉，曹慶寶，李杰，等.核酸檢測技術在唐山地區(qū)獻血者血液篩查中的應用［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2014，11（5）：634-637.

［15］謝敬文，藍文莉，黎淑貞，等.番禺地區(qū)無償獻血者酶免陰性樣本的核酸檢測結果分析［J］.2014，16 （4）：355-327.

［16］Ren FR，Wang JX，Huang Y，et al.Hepatitis B virus nucleic acid testing in Chinese blood donors with normal and elevated alanine aminotransferase［J］.Transfusion，2011，5（1）：2588-2595.

［17］Carson JL，Grossman BJ，Kleinman S，et al.Red Blood Cell Transfusion：A Clinical Practice Guideline from the AABB［S］.Ann Intern Med，2012，15（7）：49-58.

·綜述·

Evaluation and application of a domestic NAT kit used for blood screening

CHEN Zhizhong，LI Jiemin，LIAO Yangxun，LIANG Jianfeng，YU Wenchao，TANG Xiaoying，LIANG Liting，HUANG Juming，LU Qianwen，CHEN Shangliang★
（Zhaoqing Blood Center，Zhaoqing，Guangdong，China，526020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the capability of a domestic blood screening NAT kit. MethodsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability，and anti-pollution ability of the kit were analyzed.ResultsThe sensitivity of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA detection were not more than 50 IU/mL，50 IU/mL and 100 IU/mL respectively，and specificity，repeatability，anti-pollution ability met the demands for blood nucleic acid test.There was no interference due to fat particles in the analyses of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA in mini pool of 8 samples model，but HIV RNA was not detected in ID-NAT model due to fat particles.The detection of those 3 marks was interfered with by hemolysis. ConclusionsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability and anti-pollution ability of the kit could meet the demands for blood screen，but the interference from fat particles or hemolysis is a concern for the detection capability for HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA.

［KEY WORDS］Blood screening；Nucleic acid test；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目（A2015238）；肇慶市科技創(chuàng)新計劃（2014E1814）

作者單位：肇慶市中心血站，廣東，肇慶526020