共振光散射法研究硫酸粘桿菌素與牛血清白蛋白間的反應(yīng)機(jī)理

張秋菊，劉保生，李改霞，韓 榮，呂運(yùn)開(kāi)

河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002

共振光散射法研究硫酸粘桿菌素與牛血清白蛋白間的反應(yīng)機(jī)理

張秋菊，劉保生*，李改霞，韓 榮，呂運(yùn)開(kāi)

河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002

在pH 7.40緩沖溶液條件下，以牛血清白蛋白(BSA)為檢測(cè)對(duì)象，利用共振光散射法分別研究了298，310，318 K三個(gè)溫度下BSA和硫酸粘桿菌素(CS)之間的相互作用機(jī)理。結(jié)果證明：該體系在反應(yīng)過(guò)程中，主要的猝滅方式為生成新物質(zhì)的靜態(tài)猝滅；n值約為1，表明CS與BSA發(fā)生作用時(shí)只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；由熱力學(xué)參數(shù)得知該體系的反應(yīng)過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的，藥物與蛋白質(zhì)主要是通過(guò)靜電力結(jié)合；Hill系數(shù)約等于1，表現(xiàn)為零協(xié)同作用。將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與熒光猝滅法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，比較顯示：利用共振光散射法所計(jì)算的猝滅參數(shù)(Ksv，Kq，n，Ka)與熒光猝滅法所得猝滅參數(shù)數(shù)值相似，猝滅結(jié)論一致，驗(yàn)證了該方法的正確性，說(shuō)明共振光散射法用于研究蛋白質(zhì)與藥物的相互作用是可行的。共振光散射法與檢測(cè)物質(zhì)本身有無(wú)內(nèi)源熒光無(wú)關(guān)，因此也可以用于沒(méi)有內(nèi)源熒光物質(zhì)的研究，這使小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究方法得到拓寬。

牛血清白蛋白；硫酸粘桿菌素；共振光散射法；熒光猝滅法

引 言

相比于人血清蛋白，牛血清白蛋白與其有相同結(jié)構(gòu)和高達(dá)80%的序列同源性，所以常被當(dāng)作目標(biāo)蛋白來(lái)研究在體外其與藥物的作用[1]。研究上述相互作用常用的方法就是熒光法，通過(guò)檢測(cè)猝滅劑與蛋白的熒光基團(tuán)的作用情況，從而使人們了解蛋白與小分子的結(jié)合機(jī)制, 并判斷其結(jié)合特點(diǎn)[2]。當(dāng)散射粒子同入射光的頻率相接近時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種彈性散射光，這種現(xiàn)象被稱之為共振光散射(resonance light scattering，RLS)，由Pasternack等于1993年建立并提出[3]。RLS法具有簡(jiǎn)單，快速，靈敏的特點(diǎn)[4]，被廣泛用于DNA含量的測(cè)定[5-6]，藥物含量的測(cè)定[7]等方面，但用于研究藥物與蛋白質(zhì)作用機(jī)理的報(bào)道相對(duì)少見(jiàn)。

硫酸粘桿菌素(CS)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，是一種由多粘芽胞桿菌和其相關(guān)物種的菌株中分離出來(lái)的一種多肽抗生素，由多肽抗生素與硫酸鹽組成，對(duì)革蘭氏陰性菌抗菌效果顯著。由于CS具有非常穩(wěn)定的性質(zhì)，因此常被用于藥敏實(shí)驗(yàn)中[8]。本文以CS為例，采用RLS法對(duì)BSA-CS體系的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與熒光猝滅法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證RLS法的可行性。

圖1 硫酸粘桿菌素的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：牛血清白蛋白(BSA，純度≥99%，Sigma公司)，配成濃度2.0×10-5mol·L-1備用；硫酸粘桿菌素(CS，純度≥98.5%)配成濃度1.0×10-4mol·L-1；配制含0.15 mol·L-1NaCl的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.40)。

儀器：島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)和UV-265紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；SYC-15B型超級(jí)恒溫水浴(南京桑力電子設(shè)備廠)；pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.2 步驟

1.2.1 熒光猝滅法

將1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液，1.0 mL BSA(2.0×10-6mol·L-1)溶液及不同體積的CS溶液加入到10 mL比色管中定容，恒溫放置15 min，使體系作用完全。設(shè)置λex=280 nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫寬為5 nm，掃描各溶液在285～450 nm范圍的熒光光譜，記錄340 nm處的熒光值F。

1.2.2 RLS法

溶液配制與上述方法相同。設(shè)置熒光儀參數(shù)：光譜類型為同步熒光，Δλ=0 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫寬為5 nm，掃描各溶液在220～700 nm范圍的共振光散射光譜，記錄290 nm的RLS強(qiáng)度F。

1.2.3 紫外吸收法

將1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液，1.0 mL BSA(2.0×10-5mol·L-1)溶液及不同體積的CS溶液加入到10 mL比色管中定容，以相應(yīng)濃度的CS溶液作為參比液，掃描各溶液在190～400 nm范圍的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA-CS體系的熒光光譜分析

圖2所示為BSA-CS體系熒光圖。當(dāng)λex=280 nm時(shí)，BSA的內(nèi)源熒光主要來(lái)源色氨酸和酪氨酸。由圖2可見(jiàn)，BSA在340 nm處有很強(qiáng)的熒光峰，且CS濃度的逐漸增大，導(dǎo)致BSA在340 nm處的熒光值有降低的趨勢(shì)，熒光峰位置發(fā)生紅移(340～351 nm)，暗示BSA-CS體系發(fā)生了有新的結(jié)合物生成的相互作用[9]。同時(shí)說(shuō)明兩種氨基酸參與反應(yīng)，可判斷出CS與BSA的結(jié)合位置在BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA。

為推測(cè)藥物與蛋白質(zhì)的猝滅機(jī)理，將所測(cè)數(shù)值按Stern-Volmer方程[10]計(jì)算

圖2 BSA-CS體系的熒光光譜(T=298 K)

cBSA=2.0×10-7mol·L-1; 1—10cCS=(0, 0.2, 1.0, 5.0, 8.0, 10, 15, 20, 30, 40)×10-6mol·L-1

F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]

(1)

式(1)中，Kq是猝滅速率常數(shù)；KSV稱為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；τ0約為10-8s。利用式(1)，以F0/F～[D]作圖，由擬合方程的斜率得到KSV列于表1。由表1可知，體系的KSV值與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，從而可知該反應(yīng)由靜態(tài)猝滅主導(dǎo)[11]。各溫度下的Kq值均比最大擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)大兩個(gè)數(shù)量級(jí)[12]，再次證明BSA-CS體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。

對(duì)于該猝滅過(guò)程，結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可利用式(2)[13]來(lái)計(jì)算

(2)

以lg{(F0-F)/F}對(duì)lg{[Dt]-n(1-F/F0)[Pt]}作圖，由直線斜率和截距可得n和Ka，結(jié)果列于表1。由表1可得，n值約為1，說(shuō)明CS與BSA結(jié)合時(shí)有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)合常數(shù)Ka與溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明該過(guò)程為生成新結(jié)合物的靜態(tài)猝滅[14]。

表1 不同溫度下BSA-CS體系熒光猝滅法的猝滅反應(yīng)參數(shù)

注：r1為方程F0/F～[D]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為方程lg{(F0-F)/F}～lg{[Dt]-n(1-F/F0)[Pt]}的線性相關(guān)系數(shù)

Note:r1is the linear relative coefficient ofF0/F～[D];r2is the linear relative coefficient of lg{(F0-F)/F}～lg{[Dt]-n(1-F/F0)[Pt]}

2.2 BSA-CS體系的共振光散射光譜

BSA-CS體系的共振光散射光譜圖，見(jiàn)圖3。當(dāng)入射光與蛋白質(zhì)的吸收波長(zhǎng)相同時(shí)，共振光會(huì)增強(qiáng)，且出現(xiàn)新峰，而峰蛋白質(zhì)中主要的吸收峰為280 nm處，再結(jié)合共振光譜圖，因此選取290 nm處的共振光強(qiáng)度作為參考。圖3顯示，BSA在290 nm處的RLS強(qiáng)度隨CS濃度的變大呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并有顯著藍(lán)移；還可發(fā)現(xiàn)當(dāng)CS濃度達(dá)到2.0×10-7mol·L-1時(shí)，λ=370 nm處有新峰形成，這兩種現(xiàn)象顯示BSA-CS體系確實(shí)有反應(yīng)發(fā)生，也間接說(shuō)明色氨酸和酪氨酸參與反應(yīng)，推測(cè)的結(jié)合位置與2.1節(jié)一致。利用式(1)和式(2)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，列于表2。由表可得：KSV1，Ka1值均與溫度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明該體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅。RLS法所得猝滅機(jī)理和猝滅參數(shù)與熒光猝滅法相吻合，說(shuō)明RLS法在研究藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可行的。從表1和2可以看出，RLS法的結(jié)合常數(shù)略小于熒光猝滅法，這是由于兩種熒光的產(chǎn)生原理不同導(dǎo)致的。

圖3 BSA-CS體系的共振光散射光譜(T=298 K)

cBSA=2.0×10-7mol·L-1; 1—10cCS=(0, 0.2, 1.0, 5.0, 8.0, 10, 15, 20, 30, 40)×10-6mol·L-1

2.3 BSA-CS體系的紫外吸收分析

圖4為BSA-CS紫外吸收光譜圖。從圖4可以看出：CS濃度增大導(dǎo)致BSA溶液的紫外吸收強(qiáng)度降低，且BSA的最大吸收波長(zhǎng)有顯著紅移(由208移至215 nm)，這說(shuō)明有新的結(jié)合物生成，再次證明靜態(tài)猝滅為BSA-CS體系的作用機(jī)理[15]。BSA的紫外吸收主要來(lái)源于色氨酸和酪氨酸，推測(cè)的結(jié)合位置也同2.1節(jié)一致。

圖4 BSA-CS體系的紫外吸收光譜(T=298 K)

cBSA=2.0×10-6mol·L-1; 1—7cCS=(0, 4.0, 10, 20, 30, 40, 50)×10-6mol·L-1

2.4 BSA-CS體系作用力的研究

為初步判斷該體系的主要作用力類型，可通過(guò)計(jì)算相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)得知[16]。如果溫度對(duì)其影響不大，焓變?chǔ)可看作定值。根據(jù)下列式(3)和式(4)[17]得出

RlnK=ΔS-ΔH/T

(3)

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS

(4)

熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，BSA與CS相互作用中ΔG<0，表明BSA與CS兩者的結(jié)合為自發(fā)過(guò)程；另外ΔS>0，ΔH<0，可判斷BSA-CS體系的結(jié)合力類型主要為靜電作用力[18]。RLS法所得ΔG，ΔH與熒光猝滅法相近，與所推測(cè)的作用力一致，再次驗(yàn)證RLS法是可行的。RLS法所得ΔS小于熒光猝滅法所得數(shù)值，這種差異可能是由于兩種方法檢測(cè)的光類型不同造成的。

表2 不同溫度下BSA-CS體系共振光散射法的猝滅反應(yīng)參數(shù)

注：r3為方程F0/F～[D]的線性相關(guān)系數(shù)；r4為方程lg{(F0-F)/F}～lg{[Dt]-n(1-F/F0)[Pt]}的線性相關(guān)系數(shù)

Note:r3is the linear relative coefficient ofF0/F～[D]；r4is the linear relative coefficient of lg{(F0-F)/F}～lg{[Dt]-n(1-F/F0)[Pt]}

表3 BSA-CS體系的熱力學(xué)參數(shù)

2.5 BSA-CS體系Hill系數(shù)的計(jì)算

協(xié)同作用，是指具有多重配體結(jié)合部位的大分子與配體結(jié)合時(shí)，各結(jié)合部位之間可能對(duì)彼此的結(jié)合能力會(huì)產(chǎn)生影響的現(xiàn)象。這種影響可以利用Hill方程式(5)計(jì)算[19-20]

(5)

表4 在不同溫度下BSA-CS體系的Hill系數(shù)

注：r5為方程lg(Y/1-Y)～lg[D]的相關(guān)系數(shù)

Note:r5is the linear relative coefficient of lg(Y/1-Y)～lg[D]

(6)

式(6)中，Q為(F0-F)/F0，Qm為以1/Q對(duì)1/D作圖的截距的倒數(shù)，之后以lg(Y/1-Y)對(duì)lg[D]作圖，從而得到Hill系數(shù)nH，結(jié)果列于表4。由表4可以看出，RLS法所得Hill系數(shù)約為1，這一數(shù)據(jù)表明BSA-CS體系的結(jié)合，對(duì)之后的配體再與BSA結(jié)合不會(huì)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為零協(xié)同作用。同時(shí)證明RLS法可以用來(lái)計(jì)算nH值，從而說(shuō)明RLS法是合理的。

3 結(jié) 論

利用RLS法對(duì)BSA-CS體系的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，并將結(jié)論與熒光猝滅法加以比較驗(yàn)證。熒光猝滅數(shù)據(jù)一般會(huì)通過(guò)計(jì)算結(jié)合常數(shù)，結(jié)合位點(diǎn)個(gè)數(shù)，熱力學(xué)參數(shù)，Hill系數(shù)等參數(shù)，進(jìn)一步推測(cè)結(jié)合機(jī)理。將RLS法所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算上述參數(shù)，所得的結(jié)果與熒光猝滅法所得機(jī)理、結(jié)論都一致，且所有線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，說(shuō)明RLS法是正確可行的。由于兩種方法原理不同和掃描參數(shù)設(shè)置不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)值存在微小差異。儀器參數(shù)設(shè)定之后，RLS強(qiáng)度與散射粒子的濃度，形狀，大小有關(guān)，這為沒(méi)有內(nèi)源熒光的物質(zhì)的熒光研究提供了方便，這也是RLS法的優(yōu)越之處。

[1] Vignesh G, Manojkumar Y, Sugumar K, et al.J.Lumin., 2015, 157: 297.

[2] Guo X J, Li X Z, Jiang Y C, et al.J.Lumin., 2014, 149: 353.

[3] Feng D Q, Liu G L, Wang W.J.Mater.Chem.B, 2015, 3(10): 2083.

[4] Chen Z G, Wang Z, Chen J H, et al.Eur.J.Med.Chem., 2013, 66: 380.

[5] HUANG Xin-hua, SHU Wei-qun, LI Yuan-fang, et al(黃新華，舒為群，李原芳，等).Chinese J.Anal.Chem.(分析化學(xué)), 2001, 29(3): 271.

[6] Chen X, Liu G L, Liang S W, et al.Anal.Methods-UK, 2012, 4(6): 1546.

[7] Luo H Q, Liu S P, Li N B, et al.Anal.Chim.Acta, 2002, 468(2): 275.

[8] Yin F B, Wang D L, Li Z F, et al.Bioresource Technol., 2015, 177: 188.

[9] Toprak M, Ark M.Luminescence, 2014, 29(7): 805.

[10] Chen D D, Xie J H, Wu Q, et al.J.Lumin., 2015, 160: 245.

[11] Chen Y, Wang R J, Wang S S, et al.B.Korean Chem.Soc., 2011, 32(9): 3261.

[12] Shu Y, Xue W W, Xu X Y, et al.Food Chem., 2015, 173: 31.

[13] Wang Y Q, Zhang H M, Zhang G C, et al.J.Lumin., 2007, 126(1): 211.

[14] CHONG Bao-hong, LIU Bao-sheng, LI Zhi-yun, et al(種寶紅，劉保生，李志云，等).Chin.J.Lumin.(發(fā)光學(xué)報(bào)), 2013, 34(10): 1380.

[15] Yan X N, Liu B S, Chong B H, et al.J.Lumin., 2013, 142: 155.

[16] Yu X Y, Yao Q, Li W, et al.J.Solution Chem., 2012, 41(10): 1747.

[17] Xu H L, Yao N N, Li G Y, et al.Spectrosc.Lett., 2014, 47(2): 119.

[18] Yu X Y, Liao Z X, Jiang B F, et al.Spectrochim.Acta A, 2015, 137: 129.

[19] LIU Bao-sheng, WANG Jing, XUE Chun-li, et al(劉保生，王 晶，薛春麗，等).Chin.J.Lumin.(發(fā)光學(xué)報(bào)), 2011, 32(6): 628.

[20] ZHANG Hong-ying, CHEN Ning-sheng, ZHANG Wen-long, et al(張紅穎，陳寧生，張文龍，等).Chemical Research and Application(化學(xué)研究與應(yīng)用), 2014, 26(9): 1386.

(Received Jun.9, 2015; accepted Oct.25, 2015)

*Corresponding author

The Investigation on the Interaction of Colistin Sulfate with Bovine Serum Albumin with Resonance Light Scattering Spectroscopy

ZHANG Qiu-ju, LIU Bao-sheng*, LI Gai-xia, HAN Rong, Lü Yun-kai

Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province, College of Chemistry & Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China

The interaction between colistin sulfate (CS) with bovine serum albumin in physiological buffer (pH 7.4) was investigated with resonance light scattering spectroscopy at 298, 310, and 318 K.The analysis of data indicated that quenching mechanism of BSA-CS was probably static.The value of n was approximately 1, indicating there was only a single class of binding sites on BSA for CS compounds.The thermodynamic parameters were calculated at different temperatures, implying that the interaction was spontaneous and electrostatic force played major role in the binding between CS and BSA.The values ofnHwere equal to 1 at different temperatures, indicating there was non-cooperative reaction between BSA and CS.The feasibility of resonance light scattering spectroscopy was verified by fluorescence quenching spectroscopy.The quenching reactive parameters (KSV，Kq，n，Ka) from two methods were similar, suggesting resonance light scattering spectroscopy could be used to study the binding interaction between protein and drugs.Resonance light scattering spectroscopy can be used to explore the substance without intrinsic fluorescence, suggesting that the application of resonance light scattering spectroscopy broadens the understanding of the interaction between small molecules and protein.

Bovine serum albumin; Colistin sulfate; Resonance light scattering spectroscopy; Fluorescence quenching spectroscopy

2015-06-09，

2015-10-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21375032)資助

張秋菊，女，1990年生，河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生 e-mail: 15733232003@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: lbs@hbu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)09-2879-05