第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體在內(nèi)臟高敏性大鼠結(jié)腸中的表達(dá)

邵利梅， 劉雁冰， 肖軍華， 劉 菲

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200120)

?

·基礎(chǔ)研究·

第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體在內(nèi)臟高敏性大鼠結(jié)腸中的表達(dá)

邵利梅1，2， 劉雁冰2， 肖軍華2， 劉 菲2

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200120)

目的 探討第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體mGluR4、mGluR7、mGluR8在內(nèi)臟高敏性大鼠結(jié)腸中的表達(dá)變化。方法 12只SD雄性幼鼠分為母嬰分離(neonatal maternal separation， NMS)組和對照組(normal control， NC)組。利用結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention， CRD)刺激下的腹壁回縮反射(abdominal withdrawal reflex， AWR)評分和腹壁肌電活動(electromyography， EMG)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行?；?yīng)用RT-PCR、Western印跡法和免疫組化檢測第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體mGluR4、mGluR7、mGluR8在模型組和對照組大鼠結(jié)腸中的表達(dá)變化。結(jié)果 在 不同壓力CRD刺激下，NMS組大鼠的AWR評分(P<0.01)和腹壁肌電活動(P<0.05)明顯高于NC組；NMS組大鼠結(jié)腸中第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體mGluR4、mGluR7、mGluR8的mRNA(P<0.01，P<0.05，P<0.01)和蛋白水平表達(dá)(積分光度值integrated density， ID)(P<0.05，P<0.01，P<0.01)分別高于相對應(yīng)NC組的表達(dá)；NMS組mGluR4、mGluR7、mGluR8的陽性表達(dá)率明顯高于NC組。結(jié)論 第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體mGluR4、mGluR7、mGluR8在內(nèi)臟高敏性大鼠結(jié)腸中的表達(dá)明顯升高，腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)發(fā)病可能與第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體相關(guān)。

腸易激綜合征； 內(nèi)臟高敏性； 第Ⅲ組親代謝型谷氨酸受體； 大鼠

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome， IBS)臨床最常見的功能性胃腸病之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中內(nèi)臟高敏感性(visceral hypersensitivity)作為IBS的生物學(xué)標(biāo)記受到廣泛關(guān)注[1]，母嬰分離(neonatal maternal separation, NMS)模型能較好地模擬IBS的內(nèi)臟高敏性[2]。第Ⅲ組mGluR分為mGluR4、mGluR6、mGluR7、mGluR8，在中樞和外周均有分布，其中mGluR6特異性地表達(dá)于視網(wǎng)膜[3]。以往重視第Ⅲ組mGluR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，而在胃腸道功能性的疾病中作用尚不清楚，有限的研究[3-4]提示第Ⅲ組mGluR在胃腸道動力和分泌功能有調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于內(nèi)臟高敏性方面研究甚少，故本研究分析第Ⅲ組mGluR在NMS模型中的表達(dá)變化，探討IBS內(nèi)臟高敏性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD孕鼠4只，由上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供，有效新生雄鼠12只。飼養(yǎng)條件安靜，恒溫恒濕，12h自然光照與黑暗交替，食水持續(xù)供給，3～ 5只/籠。

1.1.2 主要試劑與儀器 mGluR4、mGluR7、mGluR8、GAPDH引物由生工生物工程股份有限公司設(shè)計和合成；SYBR Green Master Mix購自美國Life Technologies公司；mGluR4抗體購自英國Abcam公司；mGluR7、mGluR8抗體購自美國Novus Biologicals公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體購自北京博爾西科技有限公司；自制結(jié)直腸擴(kuò)張氣囊(由8號橡膠導(dǎo)尿管插入乳膠手套制成，長約6cm)及BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NMS模型制備 將新生鼠分為NMS組與對照組(NC組)，每組6只，NMS組新生鼠出生后第2～14天，每天與母鼠分離3h(9：00～12：00am)，NC組不做特殊處理。飼養(yǎng)至2月齡，雄鼠體質(zhì)量250～300g，進(jìn)行內(nèi)臟痛覺敏感性測定，備用。

1.2.2 內(nèi)臟痛覺敏感性測定 結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention, CRD)刺激下腹壁回縮反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)評分： 8周齡時，對大鼠CRD刺激下AWR進(jìn)行半定量評分。測定前12h禁食不禁水，以便減少腸道糞便。將大鼠置于安靜的房間30min適應(yīng)環(huán)境后，自肛門內(nèi)置入抽空氣體氣囊，氣囊進(jìn)入后距肛門約1cm，用膠布將氣囊導(dǎo)管固定于尾巴，大鼠放于自制塑料盒制動，按從低到高壓力打入空氣，使氣囊內(nèi)壓力分別為20、40、60、80mmHg(1mmHg=0.133kPa)，每次擴(kuò)張持續(xù)20s，間隔4min，分別對各壓力CRD刺激下進(jìn)行AWR評分。以上操作重復(fù)3次，取平均值。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)參照Al-chaer的方法： 0分(對CRD刺激無反應(yīng))；1分(刺激后大鼠有動作停頓并有短暫頭部運(yùn)動)；2分(見有腹壁肌肉收縮)；3分(有腹部抬起行為)；4分(身體上拱并抬起盆腔和陰囊)[5]。

腹壁肌電活動(electromyography， EMG)評估腸道敏感性： 8周齡時，進(jìn)行電極埋置，電極埋置術(shù)已有實(shí)驗(yàn)[6]敘述，戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉下，旁正中切口，鈍性分離筋膜，將3根銀制電極線一端縫合到腹股溝韌帶上方，距中線1.5cm的一側(cè)腹外斜肌上，電極線相互間距0.5cm，電極游離端經(jīng)皮下隧道置于頸后，加以固定。術(shù)后5d記錄EMG，按照前述步驟將氣囊導(dǎo)管經(jīng)肛門插入到直腸內(nèi)，氣囊末端距離肛門1cm，用膠布固定導(dǎo)管和尾巴，然后將大鼠頸后電極連接于BL-420F生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，選擇肌電模塊。增益： 1mV，時間： 0.01s，高頻濾波： 1kHz，采樣率： 50kHz，掃描速度： 250ms/div。同上從低到高進(jìn)行各壓力CRD刺激(20、40、60、80mmHg)，記錄EMG，以上操作重復(fù)3次，取平均值。統(tǒng)計的數(shù)據(jù)為各梯度壓力下，波幅面積改變量(area under curve， ΔAUC)=CRD刺激下波幅面積(AUC during CRD)-基線水平波幅面積(AUC baseline)[7]。

進(jìn)行痛覺敏感性測定后，NMS組中剔除各壓力梯度CRD刺激下AWR評分和EMG差異不明顯的大鼠，并且電極埋置術(shù)大鼠頸后電極易咬斷，無法進(jìn)行EMG的檢測，故最終有效NMS組大鼠6只，NC組大鼠6只。

1.2.3 樣本采集 戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，動物深昏迷狀態(tài)下打開腹腔，截取乙狀結(jié)腸近直腸2cm的組織，PBS(10×)清洗，部分置于4%多聚甲醛，4℃冰箱固定過夜，部分立即置于液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃冰箱備用。

1.2.4 實(shí)時定量PCR檢測 TRIzol法提取結(jié)腸RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時定量PCR，mGluR4、mGluR7、mGluR8、GAPDH上下游引物見表1。實(shí)時定量PCR反應(yīng)總體系為10μl，SYBR Green Master Mix 5μl，mGluR4、7、8上下游引物各1μl，dd H2O 1μl，模板cDNA 1μl，反應(yīng)條件為95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)，溫度變化速率為20℃/s；然后95℃ 15s，60℃ 15s，以0.1℃/s的速率升溫至95℃ 15s。每個樣本做3個副孔，并做空白對照(以雙蒸水代替cDNA模板)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用相對定量2-ΔΔCt表示基因表達(dá)的差異。

表1 RT-PCR所用的引物序列

1.2.5 Western印跡法 提取結(jié)腸樣本組織的總蛋白，定量后確定每孔樣品上樣量50μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濕法轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，后5%脫脂奶粉封閉1h，特異性mGluR4，mGluR7，mGluR8抗體1∶1000稀釋后4℃孵育過夜，TBST漂洗3次(共30min)，熒光二抗(1∶2000)稀釋后孵育1h，TBST漂洗3次(共30min)，β-actin作為內(nèi)參蛋白同時檢測。

1.2.6 免疫組化 切片常規(guī)烤片，脫蠟，進(jìn)行DAB染色。具體步驟如下： 3% H2O2室溫靜置孵育10min；置于檸檬酸鈉溶液100℃熱修復(fù)抗原20min；5滴封閉液(加正常山羊血清)室溫下靜置20～30min，甩去多余液體，不洗；滴加一抗(GluR4、7、8均為1∶500)室溫靜置2h，陰性對照以BSA代替一抗，滴加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(1∶1000)，20～37℃靜置1h；滴加SABC，20～37℃ 靜置20min；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察控制反應(yīng)時間。以上步驟間均用0.01mol/L PBS(pH 7.2)緩沖液洗滌5min×3次。蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。結(jié)果分析： 胞漿或者包膜為淡黃色、棕黃色或褐色為陽性標(biāo)記。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)臟痛覺敏感性測定

2.1.1 不同壓力CRD刺激對NMS組和NC組大鼠AWR評分的影響 20、40、60、80mmHg CRD刺激時，NMS組AWR評分為(0.72±0.29)、(2.56±0.36)、(3.44±0.19)、(3.95±0.06)分，均高于NC組的(0.27±0.10)、(1.78±0.21)、(2.22±0.16)、(2.50±0.22)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 不同壓力CRD刺激對NMS組和NC組大鼠EMG的影響 結(jié)果顯示： 以基線為基準(zhǔn)，不同壓力CRD刺激下NMS組腹壁肌電活動較NC組明顯增強(qiáng)，見圖1。20、40、60、80mmHg CRD刺激時，NMS組△AUC為(0.03±0.41)、(1.38±0.82)、(6.60±1.05)、(21.76±3.76)，低于NC組的(2.09±0.48)、(21.11±2.68)、(78.81±13.62)、(162.54±28.53)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 腹壁肌電活動圖Fig.1 Electromyogram activity

2.2 第Ⅲ組mGluR在內(nèi)臟高敏感性大鼠結(jié)腸中的表達(dá)

mRNA的相對表達(dá)量顯示： NMS組大鼠結(jié)腸上mGluR4，mGluR7，mGluR8 mRNA的相對表達(dá)量(1.92±0.52、3.13±0.46、3.71±0.40)較NC組(1±0.24、1±0.18、1±0.32)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。Western印跡法結(jié)果顯示： NMS組大鼠結(jié)腸上mGluR4、mGluR7、mGluR8蛋白表達(dá)量(689607±135221、2623910±423215、2932104±110739)較NC組(461357±83622、1313684±313093、1555675±315704)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，見圖2。NMS組大鼠結(jié)腸黏膜上mGluR4、mGluR7、mGluR8的陽性表達(dá)較NC組增多，尤以mGluR7、mGluR8顯著，見圖3～5。

圖2 大鼠結(jié)腸第Ⅲ組mGluR蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of group Ⅲ mGluR proteins

圖3 大鼠結(jié)腸mGluR4的表達(dá)Fig.3 Expression of mGluR4 in colon(×200)

圖4 大鼠結(jié)腸mGluR7的表達(dá)Fig.4 Expression of mGluR7 in colon(×200)

圖5 大鼠結(jié)腸mGluR8的表達(dá)Fig.5 Expression of mGluR4 in colon(×200)

3 討 論

親代謝型谷氨酸受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體(GPCRs)超家族中第3家族成員，激活后通過產(chǎn)生第二信使而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。其可分為8個不同亞型： mGluR1～mGluR8，根據(jù)氨基酸序列的同源性及其藥理學(xué)特征和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的不同，可將其分為3組，Ⅰ組： mGluR1、mGluR5；Ⅱ組： mGluR2、mGluR3；Ⅲ組： mGluR4、mGluR6～mGluR8[4]。Ⅲ組mGluR主要位于突觸前與Gi蛋白耦聯(lián)，通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，從而抑制cAMP和PKA的生成，表現(xiàn)為對谷氨酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[8]。Ⅰ組和Ⅱ組mGluR在各種神經(jīng)病理學(xué)疾病中已研究得比較透徹，Ⅲ組mGluR研究最少。

在胃腸道功能中，使用第Ⅱ組和第Ⅲ組mGluR的激動劑可抑制胃腸道迷走神經(jīng)傳入功能方面的敏感性，而第Ⅰ組mGluR的激動劑無此作用；Ⅰ組中mGluR5能拮抗胃食管反流病下食管下括約肌(low esophageal sphincter， LES)的一過性松弛[9]；第Ⅲ組mGluR4激動劑L-AP4可抑制括約肌松弛。谷氨酸也與十二指腸黏膜的保護(hù)機(jī)制有關(guān)[10]，通過免疫組化已在人體結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)mGlu4受體。近年來，研究發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸黏膜表達(dá)mGluR7的mRNA及蛋白，且選擇性mGluR7激動劑AMN082在一應(yīng)激所致的排便中增加糞便中含水量；另有研究[3]發(fā)現(xiàn)mGluR8對結(jié)腸收縮有作用。

第Ⅲ組mGluR在調(diào)節(jié)痛覺方面的作用存在爭議，并且在IBS中內(nèi)臟高敏性研究甚少。實(shí)驗(yàn)[11]證明，mGluR7選擇性激動劑AMN082能抑制疼痛引起的炎癥和切口痛引起的敏感性。在本實(shí)驗(yàn)中，綜合AWR評分及EMG結(jié)果，NMS模型在CRD刺激下內(nèi)臟高敏感性顯著增高，提示造模成功，NMS模型能較好地模擬早期精神因素對于IBS的影響，造成內(nèi)臟高敏感性，AWR評分和EMG從兩方面驗(yàn)證了該模型的有效性；NMS模型中第Ⅲ組mGluR的mRNA水平、蛋白水平及免疫組化與對照組相比明顯升高，說明第Ⅲ組mGluR與IBS的內(nèi)臟高敏性方面可能具有一定的相關(guān)性。內(nèi)臟感覺信號由內(nèi)臟感覺傳入神經(jīng)，經(jīng)脊髓背根神經(jīng)元傳至大腦皮層特定的內(nèi)臟感覺區(qū)域，該區(qū)域主要分布在大腦皮層第二感覺相關(guān)區(qū)域和運(yùn)動輔助區(qū)域，其神經(jīng)元興奮性升高造成了內(nèi)臟高敏[1]。在本實(shí)驗(yàn)中，第Ⅲ組mGluR表達(dá)升高，改變了谷氨酸的釋放，使感覺傳入產(chǎn)生異常，可能參與中樞痛覺信號的傳遞，造成內(nèi)臟高敏感，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近年來，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的大量研發(fā)，為Ⅲ組mGluR的研究提供了平臺[6]，可選用第Ⅲ組mGluR拮抗劑MOSP[12]下調(diào)Ⅲ組mGluR的表達(dá)，觀察內(nèi)臟高敏性的變化，進(jìn)一步探討Ⅲ組mGluR在IBS內(nèi)臟高敏性方面的機(jī)制。

總而言之，第Ⅲ組mGluR在NMS模型中表達(dá)增加，證明了第Ⅲ組mGluR與IBS的內(nèi)臟高敏性方面有一定聯(lián)系，為將來的IBS的機(jī)制研究提供了一些方向，具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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Expression of group Ⅲ metabotropic glutamate receptors in the intestine of visceral hypersensitivity rats

SHAOLi-mei1，2，LIUYan-bing2，XIAOJun-hua2，LIUFei2

(1. Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China；2. Dept. of Gastroenterology， East Hospital， Tongji University， Shanghai 200120， China)

Objective To study the expression of group Ⅲ metabotropic glutamate receptors(Ⅲ mGluRs) in intestine of visceral hypersensitivity rats. Methods Twelve male neonate SD rats were randomly assigned into NMS group and NC group， the neonatal maternal separation model was induced in NMS group. The scores of abdominal withdrawal reflex(AWR) and electromyography(EMG) by colorectal distention(CRD) were used to test the model. The expression of Ⅲ mGluRs mRNA and proteins in intestine of visceral hypersensitivity rat was observed with Real time PCR， Western blot and immunohistochemistry， respectively. Results The scores of AWR and EMG activity in NMS group were higher than those in NC group(P<0.01 andP<0.05). The mRNA and protein expressions of mGluR4， mGluR7 and mGluR8 in NMS group were significantly higher than those in NC group(P<0.01 orP<0.05)； the positive rates of mGluR4， mGluR7 and mGluR8 in NMS group were significantly higher than those in NC group. Conclusion The expression of Ⅲ group metabotropic glutamate receptors in the intestine of visceral hypersensitivity rats is significantly up-regulated， indicating that episode of irritable bowel syndrome is related to Ⅲ group metabotropic glutamate receptors.

irritable bowel syndrome； visceral hypersensitivity； Ⅲ group mGluR； rat

10.16118/j.1008-0392.2016.05.004

2016-04-11

邵利梅(1990—)，女，碩士研究生.E-mail： 18267952034@163.com

劉 菲.E-mail： 13301921052@163.com

R 574.62

A

1008-0392(2016)05-0020-05