香蕉β—淀粉酶基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

董晨　李偉才　魏永贊　王弋　鄭雪文　胡會(huì)剛

摘 要 β-淀粉酶（beta-amylase，Bmy）是一類(lèi)關(guān)鍵的淀粉水解酶，在香蕉果實(shí)成熟淀粉降解轉(zhuǎn)化為可溶性糖的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。為了全面了解Bmy基因在香蕉基因組中的特征，研究基于香蕉基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)香蕉Bmy基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位、內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行初步的預(yù)測(cè)與分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：編碼香蕉β-淀粉酶的基因有15個(gè)，根據(jù)在染色體的位置命名為MaBmy1～15，MaBmy基因家族編碼的氨基酸范圍在68～1 453 aa，編碼的蛋白相對(duì)分子量介于7.8～162.6 ku之間，15個(gè)MaBmy蛋白中有10個(gè)偏酸性，5個(gè)偏堿性。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)MaBmy蛋白為穩(wěn)定蛋白；疏水性分析表明，所有的MaBmy蛋白為親水性蛋白；香蕉MaBmy家族內(nèi)含子最少含有2個(gè)，最多的含有10個(gè)；進(jìn)化分析表明，MaBmy家族分4個(gè)亞家族，且與水稻的親緣關(guān)系較近。研究結(jié)果為深入探討MaBmy基因的功能及調(diào)控香蕉果實(shí)成熟的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 香蕉；β-淀粉酶；基因家族；系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類(lèi)號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Bmy（EC3.2.1.2）是一種外切酶，作用于α-1，4-線性糖苷鏈的非還原末端，逐次以麥芽糖為單位切斷α-1，4-葡聚糖鏈，從而產(chǎn)生麥芽糖和有限糊精[1]。Bmy屬于糖苷水解酶家族14，含有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Glyco_hydro_14結(jié)構(gòu)域（PF01373）。這個(gè)保守結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)高度保守的區(qū)域，分別位于N端以及另外一個(gè)相對(duì)中心的位置[2]。研究證明，Bmy在許多植物中表現(xiàn)為多基因家族。例如，擬南芥基因組中可能含有9個(gè)Bmy基因（AtBmy1～9）[3]。水稻有10個(gè)，玉米13個(gè)，二穗短柄草11個(gè)，高粱和谷子各10個(gè)Bmy基因[4]。其中，AtBmy1～AtBmy4為葉綠體質(zhì)類(lèi)型，在淀粉降解中發(fā)揮不同的作用；AtBmy3是夜間葉片淀粉降解主要的催化基因；而AtBmy4對(duì)AtBmy1和AtBmy3基因編碼的酶活起到調(diào)控作用。擬南芥中2個(gè)在根系生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子AtBmy7和AtBmy8分別結(jié)合一個(gè)順式作用元件，其中都包含一個(gè)Gbox和一個(gè)類(lèi)似BR-反應(yīng)元件[5]。通過(guò)分子克隆等生物學(xué)方法已分別從水稻、大麥、黑麥、小麥、玉米中克隆出多個(gè)Bmy編碼基因[6]。

淀粉的降解是由α-淀粉酶和Bmy協(xié)同作用的結(jié)果；淀粉是香蕉果實(shí)以及其他許多肉質(zhì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中碳同化物的一種過(guò)渡形式，其降解代謝同果實(shí)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)[7-11]。汪永保研究菠蘿蜜成熟過(guò)程中Bmy基因的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bmy參與調(diào)控菠蘿蜜果實(shí)成熟中淀粉粒被降解成可溶性糖的過(guò)程，但Bmy基因相對(duì)于ɑ-淀粉酶基因來(lái)說(shuō)表達(dá)量相對(duì)較低，推測(cè)二者可能共同影響著菠蘿蜜果實(shí)質(zhì)地和品質(zhì)的形成[12]。在香蕉中，未成熟的果實(shí)果肉中有大量的淀粉存在，而在成熟期的果肉中這些淀粉被Bmy催化降解為可溶性糖[13]。王永章等[14]認(rèn)為Bmy可能參與了蘋(píng)果果實(shí)內(nèi)淀粉的降解，與果實(shí)成熟有一定關(guān)系。

香蕉是熱帶亞熱帶最重要的水果之一，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中淀粉的合成和降解是其重要的生理過(guò)程，這個(gè)過(guò)程不僅影響香蕉的產(chǎn)量，同時(shí)也影響香蕉果實(shí)的品質(zhì)。2012年已完成并公布了香蕉全基因組測(cè)序結(jié)果，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)家族基因進(jìn)行分析鑒定和進(jìn)化分析以及相關(guān)基因功能推測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持[15]。迄今為止，香蕉全基因組水平上E2基因家族[16]和ARF基因家族[17]已先后被鑒定出來(lái)，而關(guān)于Bmy家族的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)香蕉全基因組的分析，鑒定出其Bmy家族的全部基因，并且對(duì)鑒定出的家族基因進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)分析、序列比對(duì)分析、進(jìn)化分析及保守基序進(jìn)行分析，為更深入開(kāi)展MaBmy基因的功能及調(diào)控香蕉果實(shí)成熟的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以香蕉（Musa acuminata）為研究對(duì)象，基因數(shù)據(jù)來(lái)源于Phytozome11基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）及The Banana Genome Hub數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome.cirad.fr/）。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥、水稻和玉米Bmy基因序列的獲取

利用擬南芥TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/）和水稻RAP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）以及Phytozome11基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）通過(guò)基因查找和Blast序列比對(duì)，最終找出擬南芥、水稻和香蕉中所有Bmy基因序列并編號(hào)。

1.2.2 香蕉Bmy基因的氨基酸序列屬性分析

將獲得的香蕉Bmy的氨基酸序列投入ExPASy（http：//www.expasy.org/）站點(diǎn)，利用其中的ProtParam tool軟件分析Bmy蛋白的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質(zhì)。香蕉Bmy蛋白亞細(xì)胞定位采用Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析。所有參數(shù)均為默認(rèn)值。

1.2.3 香蕉Bmy基因結(jié)構(gòu)分析 從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得到的香蕉Bmy的基因序列和cDNA序列，利用Gene Structure Display Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析內(nèi)含子和外顯子組成。MaBmy保守結(jié)構(gòu)域采用PFAM（http：//pfam.xfam.org/search）在線工具查找。

1.2.4 多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用Clustal X1.83對(duì)香蕉、水稻和擬南芥中所有Bmy蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合MEGA6.0軟件構(gòu)建香蕉Bmy蛋白以及擬南芥、水稻蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數(shù)設(shè)置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建，選擇了成對(duì)刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項(xiàng)，Bootstrap method取值1 000。

1.2.5 香蕉Bmy蛋白的結(jié)構(gòu)和保守基序查找與注釋

香蕉Bmy蛋白家族蛋白的保守基序采用MEME4.0（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析，基序的最大數(shù)目設(shè)置為10，基序長(zhǎng)度設(shè)為6～200個(gè)氨基酸。對(duì)得到的保守基序運(yùn)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具進(jìn)行功能注釋，并且參照擬南芥和水稻的命名模式進(jìn)行命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-淀粉酶全基因組鑒定及基本理化性質(zhì)分析

通過(guò)分析驗(yàn)證共獲得編碼淀粉酶的基因15個(gè)，分別根據(jù)它們?cè)诿總€(gè)物種中的染色體位置命名（MaBmy1-15）。MaBmy均勻的分布在1/2/3/4/5/6/7/8/10號(hào)染色體上，其中有一條在染色體上無(wú)法定位，命名為MaBmy1。除了3號(hào)染色體上有3個(gè)MaBmy，2/5/6號(hào)染色體上有2個(gè)MaBmy，其余的染色體上均為1個(gè)，詳見(jiàn)表1。對(duì)序列的分析結(jié)果顯示，香蕉MaBmy基因的編碼區(qū)域（ORF）長(zhǎng)度范圍跨度較大，在 207（MaBmy12）～4362 bp（MaBmy14） 之間，對(duì)應(yīng)編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為68～1453個(gè)，對(duì)應(yīng)的編碼蛋白分子量在7.8～162.6 ku之間。等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：5個(gè)MaBmy蛋白等電點(diǎn)大于8.0顯堿性；10個(gè)MaBmy蛋白等電點(diǎn)小于6.5顯酸性，其中MaBmy15最小，為5.08。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)香蕉MaBmy（MaBmy-1，-4，-6，-7，-12，-15）蛋白不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，9個(gè)MaBmy大于40，為不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析表明，所有的MaBmy蛋白為親水性蛋白。

對(duì)香蕉Bmy的15個(gè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（表2）發(fā)現(xiàn)：MaBmy蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種形式組成，且全部氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)都以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。在MaBmy-2，-4，-7，-8，-9，-11中各組成的百分比為無(wú)規(guī)則卷曲>α-螺旋>擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)>β-轉(zhuǎn)角，其余的9個(gè)MaBmy-1，-3，-5，-6，-10，-12，-13，-14，-15蛋白組成的百分比均為α-螺旋>無(wú)規(guī)則卷曲>擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)>β-轉(zhuǎn)角。用Plant-mPLoc對(duì)MaBmy基因家族的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，不同的MaBmy蛋白定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及線粒體、葉綠體、過(guò)氧化物酶體中。

2.2 香蕉Bmy家族基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用GSDS基因結(jié)構(gòu)作圖軟件對(duì)香蕉Bym家族基因成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1所示，香蕉15個(gè)Bmy基因均由外顯子和內(nèi)含子組成。內(nèi)含子數(shù)目范圍在2～10之間，其中MaBmy-5，-6，-9，-12內(nèi)含子數(shù)目最少，含有2個(gè)內(nèi)含子；內(nèi)含子數(shù)目最多的是MaBmy2。利用Pfam工具鑒定MaBmy基因編碼的蛋白均含有保守結(jié)構(gòu)域Glycosyl hydrolase family 14 domain（PF01373），結(jié)果見(jiàn)圖2黃色方框所示。

對(duì)香蕉Bmy進(jìn)行的基因結(jié)構(gòu)分析表明，該家族基因間發(fā)生了明顯的分化。為進(jìn)一步了解香蕉Bmy各基因之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究利用香蕉15個(gè)Bmy基因編碼的蛋白質(zhì)序列及雙子葉模式植物擬南芥、單子葉模式植物水稻的Bmy蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖3所示，15個(gè)MaBmy分為4個(gè)亞家族，且與水稻的親緣關(guān)系較近，聚類(lèi)聚在一起。香蕉Bmy進(jìn)化關(guān)系較近的在基因長(zhǎng)度大小，基因結(jié)構(gòu)等方面相似，例如MaBmy-5，-9均含有3個(gè)外顯子，氨基酸數(shù)目分別為-531，-547。

2.3 Bmy蛋白的結(jié)構(gòu)和保守基序分析

通過(guò)MEME軟件預(yù)測(cè)擬南芥、水稻、香蕉Bmy蛋白的保守基序， 結(jié)果見(jiàn)圖4所示；用SMART軟件對(duì)預(yù)測(cè)的保守基序進(jìn)行命名，結(jié)果見(jiàn)表3所示。結(jié)果顯示， 3個(gè)物種 Bmy蛋白家族中共有34個(gè)Bmy蛋白，其中有16個(gè)蛋白擁有9個(gè)基序（基序1，3～ 10）；擬南芥中9個(gè)Bmy蛋白其中有5個(gè)（AtBmy-1，-4，-5，-6，-7）含有9個(gè)基序，AtBmy-2，-3含有5個(gè)基序，其余2個(gè)AtBmy-9，-8蛋白分別含有8和4個(gè)基序；水稻中10個(gè)Bmy蛋白有6個(gè)（OsBmy-3，-5，-6，-7，-9，-10）含有9個(gè)基序，其余4個(gè)（OsBmy-1，-4，-8，-2）分別含有-8，-6，-5，-4個(gè)基序。15個(gè)香蕉Bmy蛋白有5個(gè)（MaBmy-8，-10，-13，-14，-15）含有9個(gè)基序，4個(gè)（MaBmy-4，-5，-9，-11）含有8個(gè)基序，其余的MaBmy-1，-2，-3，-7，-6，-12分別含有-6，-5，-4，-3，-2，-1個(gè)基序。在基序分析中，通過(guò)SMART在線工具進(jìn)行基序命名，詳見(jiàn)表4，基序-1，-2，-3，-6，-7，-8均注釋為為糖苷水解酶家族14（Glyco_hydro_14）。

3 討論與結(jié)論

香蕉作為重要的熱帶亞熱帶水果，被世界糧農(nóng)組織列為第四大作物，淀粉作為采前香蕉果實(shí)的主要組成成分，后熟過(guò)程中淀粉降解為可溶性糖。淀粉水解酶在淀粉降解過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。然而目前為止，關(guān)于香蕉全基因鑒定Bmy基因家族尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，植物全基因組測(cè)序的完成加速對(duì)植物基因的全面了解，由單個(gè)基因研究上升到了基因組學(xué)以及功能基因組學(xué)的水平[18]。隨著植物基因組研究的深入，利用比較基因組學(xué)研究策略，通過(guò)廣泛的基因家族分析，奠定基因功能研究的基礎(chǔ)，現(xiàn)已成為基因功能研究的熱點(diǎn)。2012年香蕉的基因組已經(jīng)測(cè)序完成，為研究者深入發(fā)掘關(guān)鍵基因提供了大量的數(shù)據(jù)。本研究通過(guò)對(duì)香蕉進(jìn)行全基因組生物信息學(xué)分析，成功鑒定得到15個(gè)香蕉Bmy蛋白家族成員，該基因家族均含有糖苷水解酶家族14的保守結(jié)構(gòu)域Glycosyl hydrolase family 14 domain（PF01373），家族基因數(shù)目以及亞家族分類(lèi)與擬南芥、水稻類(lèi)似[3-4]，說(shuō)明Bmy不論是在單子葉植物還是雙子葉植物中是一類(lèi)植物進(jìn)化中相對(duì)較保守的家族。

基因家族是由祖先基因在基因的復(fù)制過(guò)程中通過(guò)重復(fù)和變異產(chǎn)生，研究基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化，分析家族基因的基因結(jié)構(gòu)組成具有重要意義。為了探索MaBmy基因家族的多樣性，筆者使用GSDS在線軟件預(yù)測(cè)MaBmy基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，香蕉Bmy基因家族成員均由外顯子和內(nèi)含子組成。香蕉Bmy基因家族內(nèi)含子數(shù)目范圍在2～10之間，而擬南芥家族成員內(nèi)含子數(shù)目范圍在2～9之間，水稻的內(nèi)含子數(shù)目范圍在1～10之間[3-4]；進(jìn)化分析表明，在4個(gè)亞家族中，進(jìn)化關(guān)系較近家族成員的聚在一起，其基因結(jié)構(gòu)和氨基酸組成相似，例如：Group I中MaBmy-11，-13，OsBmy1均含有3個(gè)內(nèi)含子，氨基酸組成分別為-542，-561，-566 aa，這類(lèi)基因在進(jìn)化過(guò)程中保守，這與楊澤峰等對(duì)禾本科Bmy基因的研究結(jié)果一致[4]。然而，還有一類(lèi)基因雖然在進(jìn)化過(guò)程中親緣關(guān)系較近，但是在基因結(jié)構(gòu)及氨基酸組成差異較大，產(chǎn)生這類(lèi)分化的原因是基因在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了新的生物學(xué)功能。

本研究基于香蕉gene bank database在全基因水平上鑒定分析了MaBmy基因家族，并對(duì)其氨基酸序列、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位以及保守基序進(jìn)行了全面分析，為今后進(jìn)一步研究香蕉Bmy基因家族的功能和調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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