不同頻率微振動對血管內(nèi)皮細胞生長因子表達及通透性的影響

朱卓立??馬瑞陽??楊揚??甘雪琦口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫(yī)院修復科（四川大學），成都?610041

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不同頻率微振動對血管內(nèi)皮細胞生長因子表達及通透性的影響

朱卓立??馬瑞陽??楊揚??甘雪琦
口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫(yī)院修復科（四川大學），成都?610041

[摘要]目的 研究微振動對血管內(nèi)皮細胞分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）及通透性的影響。方法 培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC），每日施加0.2、0.5、2、5?Hz?4種低頻率微振動30?min，通過Tagman探針實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）及蛋白質(zhì)印跡法檢測VEGF的表達，并檢測內(nèi)皮細胞的通透性。結(jié)果 加載0.2?Hz和0.5?Hz微振動可使血管內(nèi)皮細胞VEGF?mRNA及蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），加載2?Hz和5?Hz振動后VEGF?mRNA及蛋白表達下調(diào)（P＜0.01）；加載0.2?Hz和0.5?Hz微振動可使血管內(nèi)皮細胞通透性增強（P＜0.01），2?Hz和5?Hz微振動則使內(nèi)皮細胞通透性降低（P＜0.01）。結(jié)論 0.2~0.5?Hz的微振動可使血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF增高，并提高血管內(nèi)皮細胞的通透性。

[關(guān)鍵詞]低頻微振動； 內(nèi)皮細胞； 血管內(nèi)皮細胞生長因子； 通透性

近年來，骨組織工程技術(shù)成為骨缺損修復的研究重點，其過程包括血管化、骨再生、骨端融合3個基本環(huán)節(jié)，其中血管化是骨愈合過程中最基本的環(huán)節(jié)，它能將參與骨發(fā)生與修復的相關(guān)細胞、信號分子、營養(yǎng)物質(zhì)攜帶入微環(huán)境并帶走新陳代謝廢物及壞死分解產(chǎn)物以維持局部動態(tài)微環(huán)境。目前，組織工程骨血管化的主要方法包括利用血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，Ang）等與生物材料復合促進血管生長，但因其在體內(nèi)迅速降解，故很難達到理想的效應濃度[1]。因此，如何促進促血管生長因子的濃度增長成為增強骨缺損修復血管化的新的突破點。既往的實驗結(jié)果表明，低幅度的高頻振動能有效促進血管內(nèi)皮細胞的增殖能力[2]。因此本研究擬在細胞水平研究高頻率低強度的微振動對血管內(nèi)皮細胞VEGF表達及通透性的影響，以期為微振動在骨組織工程血管化的應用提供分子生物學基礎。

1??材料和方法

1.1??主要材料和儀器

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human?umbilical?vein?endothelial?cell，HUVEC）（美國標準生物品收藏中心提供），低糖培養(yǎng)基（L-glutamine?dulbecco’s?modified?eagle?medium，L-DMEM）（Gibco公司，美國），胎牛血清（fetal?bovine?serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），GJX-5型振動傳感器校準儀（北京森德格科技有限公司）。

校準儀可用于校準加速度傳感器、速度傳感器及渦流位移傳感器，并可在垂直、水平兩個方向測量，它包括正弦信號源、功率放大器、振動臺體、內(nèi)部基準加速度傳感器及測量和顯示的電路。

1.2??細胞培養(yǎng)與傳代

將HUVEC接種于25?mL培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS 的L-DMEM培養(yǎng)基中，于37?℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。當貼壁細胞達90%時，以質(zhì)量分數(shù)0.25%胰蛋白酶和質(zhì)量分數(shù)0.1%乙二胺四乙酸（ethylenediamine?tetraacetic?acid，EDTA）混合物進行消化傳代培養(yǎng)，復蘇后細胞傳代培養(yǎng)至2~3代用于實驗。將HUVEC以每毫升5×104個的密度接種于6孔板，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48?h后置于振動儀上，分別加載0.2、0.5、2、5?Hz?4種振動頻率，每日30?min，連續(xù)5?d，以正常HUVEC為對照組。

1.3??檢測指標

1.3.1??Tagman探針實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction，PCR）檢測VEGF?mRNA的表達 ??微振動處理后，靜置1?h，加入1?mL?Trizol試劑于每個6孔板孔中，反復吹打，常溫放置5?min。加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15?s至乳膠狀，室溫放置15?min，4?℃下12?000?r·min-1離心10?min。取上層水相于另一個EP管中，加入500 μL異丙醇，混合均勻，4?℃放置10?min，?4?℃下12?000?r·min-1離心10?min。移去上清液，加入1?mL用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl?pyrocarbonate，DEPC）水配制的預冷的75%乙醇，混勻。4?℃下7?500?r·min-1離心15?min，盡量去除上清液，RNA沉淀室溫干燥12~15?min，加入25 μL DEPC水溶解RNA。而后檢測RNA純度及濃度，在260?nm和280?nm波長下檢測吸光度值，若A260/A280為1.8~2.1，取RNA濃度為25～50 ng·μL-1進行下一步實驗。逆轉(zhuǎn)錄后，通過配制Tagman探針實時熒光定量PCR檢測體系，于ABI?7000熒光定量PCR儀（ABI）中進行反應，反應條件為：95?℃?3?min；95?℃?12?s，62?℃?40?s，40個循壞。

1.3.2??蛋白質(zhì)印跡法檢測VEGF的表達 ?微振動處理后，靜置1?h再進行細胞裂解：4?℃下12?000?r·min-1離心15?min，取上清，裂解液裂解細胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4~15?min，4?℃下14?000?r·min-1離心15?min，棄沉淀，取上清備用。電泳分離：取15 μL上清液至10?cm×10?cm膠上電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1?h，1∶1?000加入VEGF抗體，再加入羊抗兔二抗，37?℃孵育45?min，緩沖液洗滌30?min，每10?min換液1次。在暗室中壓片，顯影、定影后進行圖像分析。

1.3.3???內(nèi)皮細胞通透性的檢測 ??將HUVEC接種到24孔帶濾網(wǎng)培養(yǎng)板上層小室中，培養(yǎng)使細胞鋪滿濾網(wǎng)表面后，施加微振動處理，而后培養(yǎng)基換為無酚紅DMEM，在上層小室中加入FITC-dextran（相對分子質(zhì)量為70?000）（2.5 μmol·L-1）。2?h后，移去濾網(wǎng)，下層培養(yǎng)板中的熒光量在494?nm激發(fā)光和521?nm發(fā)射光處定量測量。

2??結(jié)果

2.1??細胞形態(tài)學觀察

培養(yǎng)的HUVEC具有典型的血管內(nèi)皮細胞形態(tài)，體積較小，緊密排列在一起，呈鋪路石樣。細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)無明顯變化。

2.2??施加微振動對VEGF表達的影響

不同振動頻率下VEGF?mRNA和蛋白表達情況見圖1、2。由圖1、2可見，在連續(xù)培養(yǎng)5?d后，施加0.2?Hz和0.5?Hz微振動的HUVEC較對照組明顯上調(diào)了VEGF?mRNA及蛋白質(zhì)的表達（P＜0.05），而施加2?Hz和5?Hz微振動可使VEGF?mRNA及蛋白表達下調(diào)（P＜0.01）。0.2?Hz與0.5?Hz微振動組相比，2?Hz 與5?Hz微振動組相比，差異均無統(tǒng)計學意義。

2.3??內(nèi)皮細胞通透性

不同振動頻率對內(nèi)皮細胞通透性的影響見圖3。由圖3可見，施加0.2?Hz和0.5?Hz微振動的血管內(nèi)皮細胞，其細胞通透性明顯高于對照組（P＜0.01)，而施加2?Hz和5?Hz微振動的血管內(nèi)皮細胞通透性則低于對照組（P＜0.01)。0.2?Hz與0.5?Hz微振動組相比，2?Hz與5?Hz微振動組相比，差異均無統(tǒng)計學意義。

圖 ?1??不同振動頻率下VEGF?mRNA的表達?Fig?1??The?expression?of?VEGF?mRNA?under?different?frequency?of??microvibration

圖 ?2??不同振動頻率下VEGF蛋白的表達?Fig?2??The?expression?of?VEGF?protein?under?different?frequency?of??microvibration

圖 ?3??不同振動頻率對內(nèi)皮細胞通透性的影響?Fig?3??The?permeability?of?endothelial?cells?under?different?frequency???of?microvibration

3??討論

骨組織工程血管化是近年來的研究熱點，內(nèi)皮細胞是影響骨缺損修復血管化的因素之一，內(nèi)皮細胞的增殖、分化和遷移能促進血管的生成[3]。VEGF是作用最強的促血管生長因子，能特異性、多途徑地作用于血管內(nèi)皮細胞，使其增殖及毛細血管瓣生成，從而促進新生血管生成[4-5]。

微振動是一種極低幅度低強度（low-amplitude，LA≤50 μm；low-magnitude，LM<1×g）的力學信號。近年來，許多研究[6-8]表明微振動可以促進骨的愈合。

已有實驗證明，在微振動對骨愈合的實驗中，微振動刺激使骨折端血流量較對照組具有顯著的增加[9]。實施微振動可能是通過增加VEGF表達，使毛細血管再生增加，增進了骨痂的生長，但是其在體內(nèi)的確切分子生物學機理尚不清楚，且尚未有研究涉及微振動對內(nèi)皮細胞VEGF表達的影響。本研究選用HUVEC作為研究對象，因其具有一般內(nèi)皮細胞的性能。本研究以其為模型來研究微振動對內(nèi)皮細胞VEGF的表達以及細胞通透性的影響，具有一定意義。

本實驗利用Tagman探針實時熒光定量PCR高度特異性、靈敏性和精確性的特點，檢測血管內(nèi)皮細胞VEGF?mRNA的表達，并采用蛋白質(zhì)印跡法檢測血管內(nèi)皮細胞VEGF蛋白的表達。結(jié)果表明，微振動能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞VEGF?mRNA和蛋白的表達，其中，0.2~0.5?Hz的微振動較對照組明顯上調(diào)了血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達（P＜0.05），說明較低頻率的微振動能促進血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF，促進新生血管的生成，這可能是微振動增進骨缺損修復血管化的機制之一；而2~5?Hz的微振動較對照組明顯下調(diào)了血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達（P＜0.01）。

Lal等[10]的研究結(jié)果表明，VEGF通過激活蛋白激酶B（protein?kinase?B，PKB/akt）通路、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial?nitric?oxide?synthase，eNOS）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated?protein?kinases，MAPK）通路來增加內(nèi)皮細胞通透性。值得一提的是，參與該調(diào)控過程的細胞通路與VEGF誘導血管生成和細胞存活的通路相同，但其機制還有待闡明。Gavard等[11]發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過促進血管內(nèi)皮鈣黏蛋白β-arrestin2依賴的細胞內(nèi)吞作用來調(diào)控內(nèi)皮細胞通透性。本實驗對血管內(nèi)皮細胞通透性的檢測結(jié)果表明，0.2~0.5?Hz微振動組在提高VEGF表達的同時，明顯提高了血管內(nèi)皮細胞通透性；而2~5?Hz微振動組表現(xiàn)為VEGF表達下調(diào)，同時其血管內(nèi)皮細胞通透性下降。本研究揭示了微振動所致的VEGF表達改變與其所致的內(nèi)皮細胞通透性改變有所關(guān)聯(lián)，提示微振動可能是通過改變內(nèi)皮細胞的VEGF表達量從而調(diào)控細胞的通透性，然而其具體機制還有待進一步研究。不同頻率的微振動對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生不同的影響，有研究[12]表明，微振動的頻率不同，骨折愈合的結(jié)果也會不相同，但其機制尚未闡明。而大量研究[13-15]表明血管內(nèi)皮細胞對不同的力學信號刺激的反應不同。

綜上所述，本研究顯示，加載適當頻率的微振動能促進血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達進而影響內(nèi)皮細胞的通透性。深入了解微振動對血管內(nèi)皮細胞影響的分子機制以及如何更加有效地向有利于骨缺損修復血管化的方向調(diào)節(jié)尚有待進一步研究。

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（本文編輯 ?杜冰）

[中圖分類號]Q?68

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.006

[收稿日期]2015-08-03；?[修回日期] ?2016-01-16

[基金項目]高等學校博士學科點專項科研基金（20120181120007）

[作者簡介]朱卓立，主治醫(yī)師，博士，E-mail：zzl7507@126.com

[通信作者]甘雪琦，主治醫(yī)師，博士，E-mail：xueqigan@scu.edu.cn

Effects of different frequency microvibrations in the vascular endothelial growth factor expression and permeability of vascular endothelial cell

Zhu Zhuoli, Ma Ruiyang, Yang Yang, Gan Xueqi. (State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Prosthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Supported by: Specialized Research Fund for The Doctoral Program of Higher Education (20120181120007). Correspondence: Gan Xueqi, E-mail: xueqigan@scu.edu.cn.

[Abstract]Objective This?study?aimed?to?evaluate?the?vascular?endothelial?growth?factor?(VEGF)?expression?and?permeability?of?vascular?endothelial?cell?under?microvibration.?Methods???Human?umbilical?vein?endothelial?cell?(HUVEC)?were?cultured,?randomly?vibrated?under?low?frequency?of?0.2,?0.5,?2,?5?Hz,?30?min?per?day.?The?VEGF?mRNA?level?was?detected?by?Tagman?probe?real-time?fluorescence?quantitative?polymerase?chain?reaction?(PCR),?and?the?VEGF?protein?expression?level?was?detected?by?Western?blot.?The?permeability?of?vascular?endothelial?cell?was?evaluated.?Results???Compared?with?the?blank?control?group,?the?mRNA?and?protein?expression?level?of?VEGF?were?significantly?increased?under?0.2,?0.5?Hz?microvibration?(P＜0.05),?and?decreased?under?2,?5?Hz?microvibration?(P＜0.01).?The?vascular?endothelial?permeability?increased?under?0.2,?0.5?Hz?microvibration?(P＜0.01),?whereas?the?permeability?decreased?under?2,?5?Hz?microvibration?(P＜0.01).?Conclusion??0.2-0.5?Hz?microvibration?can?up-regulate?the?expression?of?VEGF?mRNA?and?protein?in?vascular?endothelial,?and?increase?the?permeability.

[Key words]low?frequency?microvibration; endothelial?cell; vascular?endothelial?growth?factor;??permeability