視黃酸信號(hào)通路調(diào)控咽弓神經(jīng)嵴影響斑馬魚牙齒發(fā)育的研究

劉鑫??黃興??徐智云??楊德琴重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶?401147

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·基礎(chǔ)研究·

視黃酸信號(hào)通路調(diào)控咽弓神經(jīng)嵴影響斑馬魚牙齒發(fā)育的研究

劉鑫??黃興??徐智云??楊德琴
重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶?401147

[摘要]目的 研究視黃酸（RA）信號(hào)通路在斑馬魚顱神經(jīng)嵴遷移至咽弓神經(jīng)嵴對(duì)牙齒發(fā)育的影響。方法 將野生型斑馬魚胚胎與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎各分為3組，分別采用1×10-7~6×10-7mol·L-1梯度濃度的RA（RA處理組）、1× 10-7mol·L-1的4-二乙氨基苯甲醛（DEAB）（DEAB處理組）、與RA處理組相應(yīng)濃度的二甲基亞砜（DMSO對(duì)照組）處理24?hpf胚胎9?h。制備dlx2a、barx1、dlx2b基因的反義探針，運(yùn)用整胚原位雜交技術(shù)檢測(cè)野生型斑馬魚48~72?hpf胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表達(dá)，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚4?dpf胚胎。結(jié)果 獲得3個(gè)基因的反義mRNA探針。與DMSO對(duì)照組相比，1×10-7mol·L-1RA處理組barx1、dlx2a在咽弓神經(jīng)嵴的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并有由咽弓神經(jīng)嵴向后段咽弓牙齒萌出位點(diǎn)遷移的趨勢(shì)，綠色熒光向周邊咽弓擴(kuò)散；4×10-7mol·L-1RA處理組胚胎致畸率和死亡率極高，3×10-7mol·L-1RA處理組1/3胚胎發(fā)育遲緩。DEAB處理組神經(jīng)嵴發(fā)育不良，barx1、dlx2a表達(dá)降低，dlx2b在牙齒位點(diǎn)的表達(dá)有所延遲。結(jié)論 RA能夠通過(guò)調(diào)控咽弓神經(jīng)嵴發(fā)育過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控牙齒發(fā)育前體細(xì)胞，最終達(dá)到調(diào)控牙齒發(fā)育的過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]視黃酸信號(hào)通路； 牙齒發(fā)育； 神經(jīng)嵴； 斑馬魚

牙齒發(fā)育是顱神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞在牙齒形態(tài)發(fā)生時(shí)與牙源性上皮細(xì)胞相互作用的結(jié)果。研究[1-2]表明，神經(jīng)嵴細(xì)胞與牙本質(zhì)涎磷蛋白的調(diào)控、牙周韌帶的形成關(guān)系密切。人類正在發(fā)育的牙齒根尖段牙髓中可分離出神經(jīng)嵴干細(xì)胞[3]。在早期發(fā)育過(guò)程中，顱神經(jīng)嵴分化完成后由腦部遷徙至牙齒發(fā)生部位，參與牙齒的形成[4]。這一過(guò)程中涉及大量的生長(zhǎng)因子及信號(hào)介導(dǎo)，而信號(hào)通路的微小量變就可能導(dǎo)致繁復(fù)多樣的表型發(fā)生。在脊椎動(dòng)物中，牙齒形態(tài)表現(xiàn)出對(duì)進(jìn)化的高度敏感性，與進(jìn)化程度較高的鼠類或大型哺乳類不同，由于進(jìn)化程度較低，信號(hào)調(diào)控對(duì)斑馬魚牙齒的數(shù)量與形態(tài)更具多樣性。此外，斑馬魚的牙齒形態(tài)及發(fā)育過(guò)程與哺乳動(dòng)物相似，使其成為牙齒發(fā)育信號(hào)途徑機(jī)制研究的理想模式動(dòng)物。

視黃酸（retinoic?acid，RA）是維生素A家族的一員，為視黃醇在體內(nèi)經(jīng)多次氧化合成的代謝產(chǎn)物，是牙齒發(fā)育過(guò)程中的信號(hào)途徑之一。RA在心臟、神經(jīng)、骨骼和牙齒等器官中都有參與發(fā)育和維持生理功能的作用。Ritchie等[5]證實(shí)RA信號(hào)通過(guò)對(duì)大鼠牙本質(zhì)涎磷蛋白的調(diào)控對(duì)牙本質(zhì)礦化具有作用。Seritrakul等[6]研究發(fā)現(xiàn)，增加RA的攝入量可以使斑馬魚因退化而消失的牙齒重新萌出。Gibert等[7]認(rèn)為，微量改變RA的水平可以調(diào)節(jié)魚類牙齒的進(jìn)化方向。目前對(duì)于RA是否參與顱神經(jīng)嵴后遷至斑馬魚咽弓分化為咽弓神經(jīng)嵴、調(diào)控咽弓間充質(zhì)干細(xì)胞參與牙齒的發(fā)生，還不甚清楚。

本研究利用梯度濃度外源性視黃酸RA及其視黃醛脫氫酶2（raldh2）抑制劑4-二乙氨基苯甲醛（4-diethylaminobenzaldehyde，DEAB）對(duì)野生型斑馬魚進(jìn)行處理，選擇顱神經(jīng)嵴標(biāo)記物dlx2[8]、咽弓神經(jīng)嵴與咽間充質(zhì)標(biāo)記物barx1[9]、咽齒牙源性上皮特異性標(biāo)記物dlx2b[10]制備反義探針，檢測(cè)藥物處理后的各組胚胎，輔以dlx2b：GFP轉(zhuǎn)基因魚的的熒光觀察。本研究的目的是初步探索RA信號(hào)在神經(jīng)嵴遷移過(guò)程中的作用機(jī)理，為進(jìn)一步揭示RA信號(hào)在牙齒形態(tài)發(fā)生與牙列數(shù)目進(jìn)化中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1??材料和方法

1.1??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2種類型的斑馬魚：AB?Go野生型斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（dlx2b：GFP），均從西南大學(xué)分子發(fā)育實(shí)驗(yàn)室獲得。斑馬魚飼養(yǎng)于28.5?℃水溫、14?h光照、10?h黑暗的標(biāo)準(zhǔn)條件下，按雌雄比例1︰1或者1︰2放入交配缸內(nèi)并隔開(kāi)，次日8:30拉開(kāi)隔板，日光燈刺激產(chǎn)卵，9點(diǎn)收集斑馬魚受精卵并清洗，置于28.5?℃恒溫孵育箱中進(jìn)行孵育和培養(yǎng)。用于整胚原位雜交的胚胎培養(yǎng)液（egg?water）中添加0.04%的1-苯基-2-硫脲（phenylthiourea，PTU）孵育，控制色素形成。

1.2??主要試劑及設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）引物合成及測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司合作完成。PCR?purification?Kit試劑盒（Qiagen公司，美國(guó)），Prime?Star?DNA合成酶（Takara公司，日本），RA試劑、DEAB（Sigma公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司，瑞士），RNA提取試劑盒（Life?Technologies公司，美國(guó)），?RNA探針純化試劑盒（GE公司，美國(guó)），臺(tái)式離心機(jī)、PCR儀（Eppendorf公司，德國(guó)）。

1.3??藥物配置與分組處理

DEAB和RA分別先溶于100%二甲基亞砜（dimethyl?sulfoxid，DMSO）中，然后胚胎培養(yǎng)液稀釋成工作濃度待用。DEAB工作濃度為10-7mol·L-1，RA工作濃度梯度是1×10-7~6×10-7mol·L-1。

將野生型斑馬魚胚胎與轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎各分為3組：RA處理組、DEAB處理組、DMSO對(duì)照組，在胚胎24?hpf（hours?post?fertilization，受精后小時(shí)）按照不同方式進(jìn)行藥物處理，胚胎培養(yǎng)液中均加入0.04%?PTU。RA處理組在胚胎培養(yǎng)液中分別加入6× 10-7、5×10-7、4×10-7、3×10-7、1×10-7mol·L-1的RA，DEAB處理組加入1×10-7mol·L-1的RA合成酶抑制劑DEAB，DMSO對(duì)照組加入與RA處理組相應(yīng)濃度的DMSO，恒溫孵育箱（28.5?℃）中避光培養(yǎng)9?h。

藥物處理后用相應(yīng)濃度的DMSO?胚胎培養(yǎng)液分別洗3遍，保證無(wú)藥劑殘留后放回恒溫孵育箱。收集野生型斑馬魚48~72?hpf的胚胎用于整胚原位雜交，收集轉(zhuǎn)基因魚4?dpf（days?post?fertilization，受精后天數(shù)）的胚胎用于熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.4??barx1、dlx2a、dlx2b反義探針的制備

收集野生型斑馬魚3~5?dpf的胚胎，用Trizol法提取胚胎的總RNA，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及完整性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成3~5?dpf胚胎的cDNA，-20?℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＠冒唏R魚cDNA文庫(kù)中barx1、dlx2a、dlx2b基因序列設(shè)計(jì)探針引物，分別為barx1正向：5’-ATGCAACATCCTT-TGGAGATTGG-3’，反向：5’-TTATTCCTCTTGGTTTGCATCAG-3’；dlx2a正向：5’-ATGACTGGAGTTTTTGACAGCCTC-3’，反向5’-TCAAAATATGGTCCCGGCGCTAA-3’；dlx2b正向：5’-CAGTGGGCTGCTCTGAAACTGT-3’，反向5’-ACTAGTGATCCTGGCACGGTGG-3’。以上述合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。連接產(chǎn)物于pGEMT載體上，利用DH5α感受態(tài)菌株進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化，篩選AMP抗性陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切反應(yīng)，驗(yàn)證重組質(zhì)粒中克隆片段的大小，確認(rèn)與目的片段一致后送上海英駿生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與3種基因CDS區(qū)域一致，插入片段連接方向?yàn)閎arx1 和dlx2b反向，限制性內(nèi)切酶SalⅠ酶切線性化質(zhì)粒，dlx2a正向，限制性內(nèi)切酶SphⅠ酶切線性化質(zhì)粒，T7及SP6?RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄體系加入地高辛標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后用DnaseⅠ酶消化殘留DNA，產(chǎn)物經(jīng)GE?Y50純化試劑盒純化后得到地高辛標(biāo)記的dlx2a、dlx2b、barx1反義探針，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA探針質(zhì)量并保存于-20?℃冰箱。

1.5??整胚原位雜交

運(yùn)用整胚原位雜交技術(shù)檢測(cè)3組野生型斑馬魚胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表達(dá)。收集48~72?hpf的胚胎，4%多聚甲醛4?℃過(guò)夜固定，甲醇梯度脫水，儲(chǔ)存于-20?℃、100%甲醇溶液中。按照脫水、復(fù)水、消化、終止消化、預(yù)雜交、雜交、封閉、顯色、顯色終止的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行原位雜交，顯微鏡下觀察顯色成功后終止染色，拍照儲(chǔ)存并進(jìn)行分析。

1.6??熒光顯微鏡檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)基因魚4?dpf的胚胎，麻醉劑tricaine麻醉后用熒光顯微鏡觀察胚胎，主要觀察咽弓位置是否有綠色熒光以及熒光表達(dá)范圍。觀察后使用胚胎培養(yǎng)液洗脫麻醉劑，放回恒溫孵育箱。

2??結(jié)果

2.1??反義探針的制備

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了特異性條帶，片段大小分別為499?bp（dlx2b）、813?bp（barx1）、747?bp （dlx2a），結(jié)果符合預(yù)期。將PCR片段連接pGEMT載體上，EcoRⅠ酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過(guò)上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序結(jié)果得知插入片段的方向，用SalⅠ和SphⅠ進(jìn)行對(duì)應(yīng)質(zhì)粒線性化，通過(guò)T7和SP6?RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得了dlx2b、dlx2a、barx1基因的反義mRNA探針。

2.2??整胚原位雜交

整胚原位雜交結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1??3組barx1與dlx2a的表達(dá) ?整胚原位雜交 ?×?75Fig?1??Expression?of?barx1?and?dlx2a?genes?in?three?groups??whole?in?situ?hybridization??×?75

由圖1可見(jiàn)，1）1×10-7mol·L-1RA處理組的胚胎，較DMSO對(duì)照組在咽弓神經(jīng)嵴至咽弓牙齒部位可見(jiàn)到增強(qiáng)的褐色陽(yáng)性信號(hào)，其中barx1的表達(dá)量在48?hpf胚胎明顯升高，在72?hpf胚胎信號(hào)持續(xù)強(qiáng)烈表達(dá)，并有由咽弓神經(jīng)嵴向第七咽弓的牙齒萌出位點(diǎn)遷移的趨勢(shì)，DMSO對(duì)照組信號(hào)仍局限于咽弓前段；RA處理組胚胎在48?hpf時(shí)dlx2a的表達(dá)明顯增強(qiáng)，除前腦部信號(hào)明顯外，咽弓后段牙齒位置也出現(xiàn)表達(dá)。dlx2b的表達(dá)與對(duì)照組差異不明顯，胚胎48?hpf均有信號(hào)位于牙齒萌出位置。2）DEAB處理組胚胎外形稍有畸形，與DMSO對(duì)照組及RA處理組相比，胚胎神經(jīng)嵴發(fā)育遲緩，完整性不良；barx1在48?hpf表達(dá)明顯降低，72?hpf開(kāi)始逐漸消失，無(wú)向咽弓牙齒附著位點(diǎn)擴(kuò)展的趨勢(shì)；dlx2a在前腦表達(dá)量下降，咽弓牙齒處無(wú)明顯表達(dá)；dlx2b在牙齒位點(diǎn)的表達(dá)有所延遲。

不同濃度的RA處理組原位雜交結(jié)果表明，4× 10-7mol·L-1RA處理組胚胎致畸率和死亡率極高，3× 10-7mol·L-1RA處理組胚胎約1/3出現(xiàn)發(fā)育遲緩的表型，主要體現(xiàn)在48?hpf胚胎外形與24?hpf的DMSO對(duì)照組類似，尾部呈扭曲狀，頭部與卵黃接近，眼部未見(jiàn)輪廓（圖2）。經(jīng)dlx2a、dlx2b、barx1探針染色后發(fā)現(xiàn)，48?hpf的RA處理組barx1無(wú)表達(dá)，dlx2a與dlx2b的表達(dá)均與24?hpf的DMSO對(duì)照組表達(dá)模式一致，與同期對(duì)照組形成鮮明對(duì)比（圖2）。

圖 2??3×10-7?mol·L-1?RA處理組和DMSO對(duì)照組dlx2a、dlx2b的表達(dá) ?整胚原位雜交 ?×?75Fig?2??Expression?of?dlx2a?and?dlx2b?genes?in?3×10-7?mol·L-1?RA?group?and?DMSO?group??whole?in?situ?hybridization??×?75

2.3??熒光顯微鏡檢測(cè)

3組的熒光表達(dá)見(jiàn)圖3。RA處理組的dlx2b綠色熒光除在牙齒位點(diǎn)表達(dá)外，出現(xiàn)了向周邊咽弓擴(kuò)散的現(xiàn)象（圖3中），疑似第七、第六咽弓均有dlx2b表達(dá)，DMSO對(duì)照組僅局限于牙胚上皮（圖3左）。DEAB?處理組胚胎在4?dpf仍未觀測(cè)到熒光表達(dá)（圖3右）。

圖 3??3組的熒光表達(dá) ?熒光顯微鏡 ?×?80Fig?3??Expression?of?fluorescence?in?three?groups??fluorescence?microscope??×?80

3 ?討論

RA信號(hào)是貫穿斑馬魚發(fā)育至成熟，乃至維護(hù)成年斑馬魚生態(tài)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的非常重要的信號(hào)通路。視黃酸的命名源于最初發(fā)現(xiàn)其與視網(wǎng)膜內(nèi)視紫紅質(zhì)受體相結(jié)合有關(guān)，深入研究后發(fā)現(xiàn)，視黃酸在整個(gè)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的分化成熟和功能發(fā)揮上都具有非常重要的作用，過(guò)多或缺乏均可導(dǎo)致不同種類的疾病。Mark等[11]在小鼠體內(nèi)敲除RA受體后見(jiàn)小鼠胚胎發(fā)生大面積顱頜骨發(fā)育畸形、腭裂，但牙齒與牙列并未出現(xiàn)明顯異常，猜測(cè)有兩種可能，第一是在顱神經(jīng)嵴遷移的過(guò)程中，該受體并無(wú)表達(dá)，即在這個(gè)期間RA信號(hào)可能有其他途徑或受體代償；第二，該受體經(jīng)敲除后影響最明顯的是顱神經(jīng)嵴在遷移的過(guò)程中正在發(fā)育的組織，而小鼠不同于斑馬魚，其牙齒為第一咽弓發(fā)育來(lái)的口齒，從顱神經(jīng)嵴遷移至頜部前已開(kāi)始發(fā)育，且RAR敲除突變體小鼠第一咽弓來(lái)源的組織未見(jiàn)明顯變化。但Lohnes等[12]的體外實(shí)驗(yàn)卻得到小鼠的牙齒發(fā)育過(guò)程中RA是必不可少的結(jié)論。

不同于小鼠的發(fā)育模式，斑馬魚的牙齒是第七咽弓的咽上皮與顱神經(jīng)嵴遷移至咽弓的咽弓神經(jīng)嵴分化的間充質(zhì)干細(xì)胞所形成的。國(guó)外學(xué)者Gibert等[13]做了調(diào)節(jié)斑馬魚RA表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)斑馬魚的牙齒發(fā)育是需要RA信號(hào)的，其主要觀點(diǎn)是圍繞鯉形目魚類牙齒進(jìn)化方向是需要RA信號(hào)進(jìn)行調(diào)控的。但牙齒的發(fā)育并不是單一信號(hào)通路所能決定的，關(guān)于RA信號(hào)與其他信號(hào)之間的相互作用也有諸多研究。Wehner等[14]研究證實(shí)RA在組織再生過(guò)程中接受來(lái)自Wnt/β-catenin的激活信號(hào)，向下傳遞給Fgf，并通過(guò)Wnt信號(hào)與Notch信號(hào)、HH信號(hào)相互作用。Gibert 等[7]通過(guò)分別和共抑制Fgf信號(hào)和RA信號(hào)發(fā)現(xiàn)二者在斑馬魚體內(nèi)是獨(dú)立調(diào)控牙齒發(fā)育的，但在青鏘魚和墨西哥脂鯉體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明牙齒發(fā)育存在RA依賴性，F(xiàn)gf處于下游，接受RA的調(diào)控，他提出不同進(jìn)化程度的生物體內(nèi)調(diào)節(jié)信號(hào)存在差異。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適量給予外源性RA信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的barx1在咽弓神經(jīng)嵴的信號(hào)增強(qiáng)，增強(qiáng)的信號(hào)意味著細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)，結(jié)合胚胎處于發(fā)育早期，增殖分化活動(dòng)活躍，RA也可能增強(qiáng)神經(jīng)嵴細(xì)胞的分裂和分化為牙齒前體細(xì)胞。dlx2a在咽弓神經(jīng)嵴的表達(dá)因RA信號(hào)的加入而提前，其在前腦區(qū)的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。dlx2b的表達(dá)在RA處理下，熒光發(fā)生亮度增強(qiáng)，表達(dá)范圍向咽弓周圍擴(kuò)散，本來(lái)僅為第七咽弓能夠表達(dá)dlx2b的牙齒特異性基因，卻出現(xiàn)在了周圍咽弓的咽上皮，這一結(jié)果與Seritrakul等[6]的結(jié)果相一致，證實(shí)了RA能夠使進(jìn)化消失的咽齒再次表達(dá)牙胚上皮特異性標(biāo)記物。在被DEAB阻斷后無(wú)法合成RA的斑馬魚體內(nèi)，barx1的表達(dá)出現(xiàn)了下調(diào)，dlx2a則僅在前腦表達(dá)，無(wú)明顯跡象表明其在咽弓神經(jīng)嵴有表達(dá)，提示顱神經(jīng)嵴后遷的過(guò)程受到抑制，沒(méi)有完成咽弓神經(jīng)嵴的形成和間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。此外，dlx2b探針在RA處理的整胚原位雜交的結(jié)果并不顯著，而在轉(zhuǎn)基因魚系中與對(duì)照組有明顯差異，除dlx2b本身表達(dá)量較低外，可能與熒光蛋白的光穩(wěn)定性有關(guān)。相較而言，原位雜交實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、步驟繁瑣，期間mRNA可能發(fā)生不同程度降解，靈敏度較熒光蛋白有所差距。

本實(shí)驗(yàn)利用較高濃度RA進(jìn)行了同步實(shí)驗(yàn)，在保證胚胎有較高的生存率的同時(shí)觀察胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育延遲約24?h，barx1于48?hpf的胚胎未見(jiàn)表達(dá)，dlx2a、dlx2b的表達(dá)則基本與24?hpf的胚胎無(wú)明顯變化，均集中于斑馬魚的前腦、間腦和端腦，顱神經(jīng)嵴、咽弓神經(jīng)嵴及咽弓間充質(zhì)無(wú)信號(hào)表達(dá)，牙齒無(wú)形成跡象。

本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度RA可以促進(jìn)斑馬魚顱神經(jīng)嵴遷移至咽弓，分化為咽弓神經(jīng)嵴和間充質(zhì)干細(xì)胞，為進(jìn)一步與牙源性上皮相互作用形成牙齒提供細(xì)胞來(lái)源。RA在脊椎動(dòng)物的牙齒發(fā)育中作為信號(hào)分子的一員，發(fā)揮著穩(wěn)健的推動(dòng)作用，與牙列排布、牙齒形態(tài)有密切的聯(lián)系，但更為深入的信號(hào)間錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及信號(hào)與生物牙齒進(jìn)化的復(fù)雜機(jī)制亟待進(jìn)一步揭示。

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（本文采編 ?李彩）

[中圖分類號(hào)]Q?78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.002

[收稿日期]2015-08-12；?[修回日期] ?2015-10-16

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（31571508，31371473）；重慶市第七批重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目《牙體牙髓病學(xué)》（2011）

[作者簡(jiǎn)介]劉鑫，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：tijiuwei@outlook.com

[通信作者]楊德琴，教授，博士，E-mail：yangdeqin@gmail.com

Retinoic acid signal pathway regulation of zebra fish tooth development through manipulation of the differentiation of neural crest

Liu Xin, Huang Xing, Xu Zhiyun, Yang Deqin. (Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (31571508, 31371473); The Seventh Batch of Key Discipline Construction Project of Chongqing—Endodontics and Operative Dentistry (2011). Correspondence: Yang Deqin, E-mail: yangdeqin @gmail.com.

[Abstract]Objective To?investigate?the?mechanism?of?retinoic?acid?(RA)?signal?in?dental?evolution,?RA?is?used?to?explore?the?influence?of?the?mechanism?on?neural?crest’s?migration?during?the?early?stage?of?zebra?fish?embryos.?Methods??We?divided?embryos?of?wild?type?and?transgenic?line?zebra?fish?into?three?groups.?1×10-7to?6×10-7mol·L-1RA?and?1×10-7mol·L-14-diethylaminobenzaldehyde?(DEAB)?were?added?into?egg?water?at?24?hpf?for?9?h.?Dimethyl?sulfoxid?(DMSO)?with?the?concentration?was?used?as?control?group.?Then,?antisense?probes?of?dlx2a,?dlx2b,?and?barx1?were?formulated?to?perform?whole-mount?in?situ?hybridization?to?check?the?expressions?of?the?genes?in?48?hpf?to?72?hpf?embryos.?We?observed?fluorescence?of?transgenic?line?in?4?dpf?embryos.?Results??We?obtained?three?mRNA?probes?successfully.?Compared?with?DMSO?control?group,?a?low?concentration?(1×10-7mol·L-1)?of?RA?could?up-regulate?the?expression?of?mRNA?(barx1,?dlx2a)?in?neural?crest.?Obvious?migration?trend?was?observed?toward?the?pharyngeal?arch?in?which?teeth?adhered.?Transgenic?fish?had?spreading?fluorescence?tendency?in?pharyngeal?arch.?However,?a?high?concentration?(4×10-7mol·L-1)?of?RA?malformed?the?embryos?and?killed?them? after?treatment.?One?third?of?the?embryos?of?middle?concentration?(3×10-7mol·L-1)?exhibited?delayed?development.?DEAB?resulted?in?neural?crest?dysplasia.?The?expression?of?barx1?and?dlx2a?were?suppressed,?and?the?appearance?of?dlx2b?in?tooth?was?delayed.?Conclusion??RA?signal?pathway?can?regulate?the?progenitors?of?tooth?by?controlling?the?growth?of?the?neural?crest?and?manipulating?tooth?development.

[Key words]retinoic?acid?signal?pathway;??tooth?development;??neural?crest;??zebrafish