CDKN2A、CDKN2B、MEF2A、VEGF基因表達與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生的相關(guān)性

丁夏峰，胡申江

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，杭州310003）

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CDKN2A、CDKN2B、MEF2A、VEGF基因表達與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)生的相關(guān)性

丁夏峰，胡申江

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，杭州310003）

摘要目的比較細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A（CDKN2A）、CDKN2B、肌肉細胞特異性增強因子2A（MEF2A）以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因表達在冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）患者和健康人之間的表達差異，以期探尋CHD可能的發(fā)病機制。方法選取CHD患者154例（CHD組）和健康者123例（正常對照組），留取全部研究對象的血液標本。通過實時定量PCR法檢測CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表達；通過ELISA定量檢測血清中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF的含量。結(jié)果實時定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHD組CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA表達量分別為0.011 5± 0.002 1、0.003 3±0.000 4、0.302 6±0.035 6和0.022 1±0.004 2，均顯著低于正常對照組（分別為0.048 4±0.015 6、0.007 1±0.001 2、0.823 0±0.075 1和0.052 7±0.001 3），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。ELISA檢測結(jié)果表明，CHD組血清CDKN2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF的表達量分別為（121.60±7.96）、（65.07±5.42）、（6.51±0.83）和（19.41±1.62）μg/mL，均顯著低于正常對照組［分別為（236.90±29.13）、（155.70±22.52）、（15.96±2.86）和（39.87±4.54）μg/mL］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論CHD患者血液中有核細胞內(nèi)CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表達水平以及血清中蛋白的表達水平都顯著低于健康人群，提示這4個基因可能直接影響或間接參與CHD的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞冠狀動脈粥樣硬化性心臟??；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2B；肌肉細胞特異性增強因子2A；血管內(nèi)皮生長因子

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心血管疾病是全球?qū)е禄颊咚劳龅闹卮蠹膊≈?，在眾多致死病因中居?位，發(fā)病率約為319/ 10萬［1］。冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）簡稱冠心病，是最常見的心臟疾病。其發(fā)病機制十分復(fù)雜，既有環(huán)境因素，也有遺傳特征［2-3］，每年將近250萬的患者死于CHD相關(guān)疾?。?］。研究顯示，脂類代謝異常、吸煙、糖尿病和高血壓是CHD的主要致病因素，約占CHD發(fā)病的60%，且此結(jié)論已通過最新技術(shù)——全基因組關(guān)聯(lián)研究得到進一步確認［5］，同樣的證據(jù)在中國人體內(nèi)也得到驗證［6］。其中主要涉及到多個基因的單核苷酸多態(tài)性位點變化，涉及基因包括磷酸酶和肌動蛋白調(diào)控因子1（phosphatase and actin regu1ator 1，PHACTR1）、轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21，TCF21）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A（cyc1in - depedent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、CDKN2B、C12orf51等［7］。除此之外，也有報道稱血管內(nèi)皮生長因子（vascu1ar endothe1ia1 growth factor，VEGF）和肌肉細胞特異性增強因子2A（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）也與CHD發(fā)病具有相關(guān)性［8］。VEGF能夠促進血管增殖和增加血管壁透性，血液中VEGF濃度增高能夠刺激血管平滑肌細胞發(fā)生變化，這與CHD的發(fā)病有相關(guān)性［9］；MEF2A是MADS盒的轉(zhuǎn)錄因子，參與心肌發(fā)育、血管形成，在冠狀動脈內(nèi)皮細胞高表達，此基因的多態(tài)性與有CHD家族史的患者明顯相關(guān)。本研究通過檢測血細胞CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA及其血漿蛋白的表達水平，探討其與CHD發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在可能關(guān)聯(lián)。

1　材料與方法

1.1入選標準

收集2010年5月至2013年2月在上虞市人民醫(yī)院心內(nèi)科就診并進行冠狀動脈造影術(shù)的患者。入選標準：冠狀動脈造影術(shù)顯示冠狀動脈狹窄＞50%，或者經(jīng)臨床癥狀、心肌酶譜以及心電圖明確診斷為CHD的患者。以此標準篩選出患者共154例（男84例，女70例），作為CHD組。選取疑似CHD但經(jīng)本院心內(nèi)科診斷為CHD陰性，并且無心臟相關(guān)疾病、腫瘤、感染和糖尿病以外的內(nèi)分泌疾病等影響因素的健康者123例（男61例，女62例），作為正常對照組。記錄、統(tǒng)計納入研究中的所有研究對象的性別、年齡、吸煙、伴發(fā)糖尿病、高血壓、高血脂癥以及服藥史。

1.2實驗方法

1.2.1血細胞中RNA的抽提：取全血50 μL加入1 mL紅細胞裂解液（0.15 mo1/L的NH4C1、10 mmo1/L的NaHCO3、1 nmo1/L的EDTA）混勻并室溫靜置30 min，10 000 r/min離心1 min后加入1 mL Trizo1，靜置5 min，加入200 μL的氯仿，渦旋震蕩均勻，靜置5 min后12 000 r/min、4℃離心10 min，取上清并加入等體積異丙醇，室溫靜置沉淀RNA約30 min，12 000 r/min、4℃離心15 min，用DEPC水配置的75%乙醇洗滌1遍后風(fēng)干，加入30 μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2實時定量-PCR測定血細胞中相關(guān)基因mRNA含量：應(yīng)用日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Rea1 Time）快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作流程，將抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并應(yīng)用TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（T1i RNaseH P1us）熒光定量PCR試劑盒，定量檢測CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA在血細胞中的相對表達量。引物［14］：MEF2A F 3′-GGTCTGCCACCTCAGAACTTT-5′，R 3′-CCCTGGGTTAGTGTAGGACAA-5′；Cdkn2aF 3′-GGGTTTTCGTGGTTCACATCC-5′，R 3′-CTAGACG CTGGCTCCTCAGTA-5′；Cdkn2bF 3′-CCCACAACG ACTTTATTTTC-5′，R 3′-GCAGCCTTCATCGAATTA-5′；VEGF F 3′-CGCAGCTACTGCCATCCAAT-5′，R 3′-GTGAGGTTTGATCCGCATAATCT-5′；GAPDHF 3′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-5′，R 3′-TCTAGA CGGCAGGTCAGGTC-5′。

1.2.3ELISA測定血清中相關(guān)蛋白含量：分別取2組患者10 μL血清，加入樣品稀釋液40 μL，每孔加入辣根過氧化物酶標記的CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF的檢測抗體（100 μL），封板膜封住并37℃培養(yǎng)箱靜置60 min；棄掉上清液，吸水紙拍打吸干，每孔加入約300 μL洗滌液，靜置1 min，棄去，重復(fù)5次，洗凈抗體殘留，每孔順序加入底物溶液各50 μL，并在37℃培養(yǎng)箱避光孵育15 min；最后，加入終止液（50 μL /孔），在450 nm波長處檢測吸光值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般資料比較

CHD組患者的年齡顯著高于正常對照組（P＜0.01），說明年齡與CHD的關(guān)系密切。CHD組92例（59.7%）患者伴發(fā)高血壓，113例（73.4%）患者伴發(fā)高血脂，CHD組伴發(fā)高血壓患者的比例和伴發(fā)高血脂患者的比例均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。此外，2組的性別比例、吸煙情況、伴發(fā)糖尿病和伴發(fā)高膽固醇的比例均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1　CHD組和正常對照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general characterizations between CHD group and control group

2.2血細胞CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA表達的比較

CHD組患者CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF mRNA表達水平分別為0.011 5±0.002 1、0.003 3±0.000 4、0.302 6±0.035 6和0.022 1±0.004 2，均低于正常對照組（分別為0.048 4±0.015 6、0.007 1± 0.001 2、0.823 0±0.075 1和0.052 7±0.001 3），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.000 1）。見圖1。

2.3血漿中MEF2A、CDKN2A、CDKN2B和VEGF蛋白表達的比較

ELISA結(jié)果顯示，CHD組患者血漿中CDK2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF蛋白濃度分別為（121.60±7.96）、（65.07±5.42）、（6.51±0.83）、（19.41± 1.62）μg/mL，正常對照組分別為（236.90±29.13）、（155.70±22.52）、（15.96±2.86）、（39.87±4.54）μg/mL，CHD組均顯著低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.000 4、0.000 3、0.002 7、0.000 1）。

圖1　2組CDKN2A、CDKN2B、VEGF和MEF2AmRNA表達Fig.1 The mRNA expressions of CDKN2A，CDKN2B，VEGFand MEF2Ain 2 groups

3　討論

冠心病是目前影響人類健康的重大疾病之一，具有高發(fā)病率和高致死率，至今仍未明確其發(fā)生的病理學(xué)及生理學(xué)分子機制。近年來在基因組學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的先進技術(shù)（如全基因組關(guān)聯(lián)研究），使得全基因組分析CHD的致病基因成為可能［10］。眾多遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，9號染色體p21區(qū)（約51 kb長度）與CHD的患病風(fēng)險有顯著相關(guān)性。研究［11］顯示，CDKN2A和CDKN2B基因即位于此區(qū)間附近；另外，MEF2A和VEGF基因的突變也與CHD發(fā)病相關(guān)。在眾多報道中，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF這4個基因的基因多態(tài)性（如單核苷酸多態(tài)性）是主要的關(guān)注點，而關(guān)于這4個基因的表達水平在CHD患者及健康人之間存在差異已得到科學(xué)論證，但其表達水平是否有種族差異、地域差異、量的差異并沒有得到相應(yīng)的關(guān)注［12］。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在CHD患者血液有核細胞中，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的表達下降，且與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異；同時在血清中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF蛋白含量也顯著下降。CDKN2A和CDKN2B是細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，位于9p21區(qū)上游大約115 kb處，已經(jīng)證明這2個基因可能是CHD敏感基因區(qū)基因，其表達可能與CHD的易感相關(guān)。MEF2A基因?qū)儆诩〖毎鰪娨蜃?家族成員，可能參與血管發(fā)生，并對血管形態(tài)形成具有重要作用［13］，可能是CAD的易感基因之一，能夠通過其他基因為中介間接參與細胞周期調(diào)節(jié)［14］。VEGF是血管發(fā)生、增殖、形成最重要的調(diào)節(jié)因子，能夠通過清除基質(zhì)、促進內(nèi)皮細胞移動和內(nèi)皮細胞出芽，從而誘導(dǎo)膠原酶分泌，啟動血管發(fā)生，對于CHD的發(fā)生有著重要作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在CHD患者血細胞中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA表達下降，而且表達水平與健康者比較差異極其顯著，說明血細胞內(nèi)CHD相關(guān)基因CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA的低表達是CHD患者的特征。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGF蛋白含量在CHD患者血漿中顯著下降，且VEGF蛋白的表達下降與其他報道結(jié)果一致［8］。CDKN2A、CDKN2B、MEF2A及VEGF蛋白在CHD組患者表達顯著低于正常對照組，與其mRNA檢測結(jié)果一致。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在CHD患者血細胞與血漿中CDKN2A、CDKN2B、MEF2A和VEGFmRNA以及蛋白含量較健康者顯著降低，這是CHD的重要特征，可以作為篩查CHD患者的一個重要指標。這4種蛋白在血漿中的含量降低是CHD發(fā)病的結(jié)果還是其發(fā)病的誘因，以及其中的分子機制至今仍不清楚，仍需進一步研究。

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（編輯陳姜）

Correlationof CDKN2A，CDKN2B，MEF2Aand VEGFGene Expressionsand Coronary Heart Disease

DINGXiafeng，HUShenjiang
（Departmentof Cardio1ogy，The First Affi1iated Hospita1，Schoo1of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou310003，China）

AbstractObjective To exp1ore the re1ationship between coronary heart disease（CHD）and expressions of cyc1in-depedent kinase inhibitor 2A （CDK2A），CDK2B，myocyte enhancer factor 2A（MEF2A）and vascu1ar endothe1ia1 growth factor（VEGF）genes.Methods A tota1 of 154 CHD patients（CHD group）and 123 hea1thy contro1 cases（contro1 group）were enro11ed in the study. A11 b1ood samp1es from patients and contro1 cases were centrifuged for serum co11ection，and the RNA was extracted after red ce11 1ysis. The gene expressions and protein 1eve1s were detected by qua1itative rea1-time PCR（qRT-PCR）and enzyme-1inked immunosorbent assay（ELSIA）. Results Expressions ofCDKN2A，CDKN2B，MEF2A and VEGF mRNA（0.0115±0.0021，0.0033±0.0004，0.3026±0.0356and0.0221±0.0042，respective1y）inb1oodce11sofCHDpatientsweresignificant1y 1ower than those of contro1 cases（0.048 4±0.0156，0.007 1±0.001 2，0.823 0±0.075 1 and 0.052 7±0.001 3，P ＜ 0.05）. Meanwhi1e，serum concentrations of CDKN2A，CDKN2B，MEF2A and VEGF（121.60±7.96，65.07±5.42，6.51±0.83 and 19.41±1.62 μg/mL，respective1y）of CHD patients were a1so 1ower than those of contro1 cases（236.90±29.13，155.70±22.52，15.96±2.86 and 39.87±4.54 μg/mL，P ＜ 0.05）. Conclusion CHDpatientshad1owerexpressionofCDKN2A，CDKN2B，MEF2A andVEGF thanhea1thypeop1e

Keywordscoronary heart disease；cyc1in-depedent kinase inhibitor 2A；cyc1in-depedent kinase inhibitor 2B；myocyte enhancer factor 2A；vascu1ar endothe1ia1 growth factor

中圖分類號R743

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0550-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.018

作者簡介：丁夏峰（1979 -），女，主治醫(yī)師，碩士研究生.

通信作者：胡申江，E-mai1：dxfjy@163.com

收稿日期：2015-08-28