RNA干擾下調(diào)YAP基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞TPC-1功能的影響

楊衛(wèi)國(guó), 花開(kāi)堯, 金佳利, 房 林

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，上海 200072; 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

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·基礎(chǔ)研究·

RNA干擾下調(diào)YAP基因?qū)谞钕侔┘?xì)胞TPC-1功能的影響

楊衛(wèi)國(guó)1, 花開(kāi)堯1, 金佳利2, 房 林1

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，上海 200072; 2. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

目的 檢測(cè)siRNA沉默Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein，YAP)后的人甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞功能變化。方法 應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將靶向沉默YAP基因的siRNA序列轉(zhuǎn)染至甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR、Western印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TPC-1細(xì)胞YAP基因及蛋白表達(dá)，MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell小室、劃痕實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞周期及凋亡的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染siRNA后，YAP mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力受到抑制，細(xì)胞周期G0/G1阻滯，細(xì)胞凋亡未明顯上升。結(jié)論 抑制甲狀腺癌細(xì)胞YAP表達(dá)可有效降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，改變細(xì)胞周期分布，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。

甲狀腺腫瘤； Yes相關(guān)蛋白； siRNA； 細(xì)胞功能

YAP基因位于Hippo信號(hào)通路下游，是一重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子[1]和癌基因，在乳腺、肺、膀胱等癌中高表達(dá)[2-3]。研究[4]顯示，YAP基因在甲狀腺乳頭狀癌和未分化癌中高表達(dá)且與腫瘤增殖正相關(guān)。近年來(lái)，siRNA技術(shù)引起重視[5]。本研究觀察應(yīng)用siRNA敲除YAP基因后甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞功能的變化，以探討其作為甲狀腺癌基因治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Pharmingen公司；YAP抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。在NCBI上Genbank中檢索YAP基因的全部堿基序列，采用在線RNA干擾設(shè)計(jì)軟件并根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)干擾位點(diǎn)，siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成。靶向沉默YAP基因的siRNA順義鏈： 5′-GCAUCUUCGACAGUC-UUCUTT-3′；反義鏈為： 5′-AGAAGACUGUCGA-AGAUGCTT-3′。以siRNA NC序列作為與人類基因組序列無(wú)任何匹配的陰性對(duì)照，siRNA NC順義鏈為： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈為： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-TT-3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%澳洲胎牛血清及 100U/ml 雙抗DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4d更換培養(yǎng)基1次。選取活力較好的指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔1×105個(gè)TPC-1細(xì)胞分種于6孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)40%～50%后，應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染入TPC-1細(xì)胞，每孔siRNA終濃度為 50nmol/L，同時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA NC作為陰性對(duì)照，而未做任何處理組細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 總RNA提取試劑(TRIzol reagent)提取各實(shí)驗(yàn)組TPC-1細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量。將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃變性30s，57℃退火 1min，72℃延伸 1min，循環(huán)30次，最后72℃溫育10min。qRT-PCR引物YAP基因順義鏈為： 5′-ACCCACAGCTCAG-CATCTTCG-3′，反義鏈為： 5′-TGGCTTGTTCCC-ATCCATCAG-3′；β-actin基因順義鏈為： 5′-CGT-CTTCCCCTC CATCGT-3′，反義鏈為： 5′-GAAG-GTGTGGTGCCAGATTT-3′。

1.2.3 Western印跡法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解TPC-1細(xì)胞并全程于低溫下提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每孔加蛋白樣品20μg，用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶800稀釋一抗孵育，于4℃冰箱放置過(guò)夜。TBST洗膜三次，每次約 10min，按1∶1 500稀釋二抗孵育50min，TBST再次洗膜3次，每次約10min。上機(jī)操作，通過(guò)Odyssey熒光成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1細(xì)胞，按2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200μl，邊緣加200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁完全后轉(zhuǎn)染siRNA，轉(zhuǎn)染濃度為50nmol/L。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)4d，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為24、48、72和96h。每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)待側(cè)孔每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DMSO，均勻振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇 490nm 波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度值(D490)，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞消化，重懸后計(jì)數(shù)，按500個(gè)/孔接種于6孔板，十字形晃動(dòng)使細(xì)胞在培養(yǎng)基中分散均勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10d，期間換全培養(yǎng)基一次。當(dāng)觀察發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄上清液，PBS浸洗2次，95%乙醇固定10min后用0.1%結(jié)晶紫染色10min，蒸餾水沖洗3次，風(fēng)干后在顯微鏡下選取具有代表性的視野拍照。

1.2.6 劃痕試驗(yàn) 取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的TPC-1細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12h待細(xì)胞貼壁牢固后轉(zhuǎn)染siRNA，將全培養(yǎng)基換為含2%澳洲胎牛血清的DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿6孔板后，用槍頭在細(xì)胞表面筆直劃一條直線，PBS清洗2次去除脫落細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12、24h后鏡下觀察各組劃痕的愈合情況，顯微鏡下選取具有代表性的視野拍照。

1.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好的TPC-1細(xì)胞消化后離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入一定量的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取 0.2ml 接種于Transwell小室內(nèi)，將小室置于24孔板內(nèi)，上室為含2%滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含15%滅活血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用消毒棉簽緩慢擦除上層小室內(nèi)細(xì)胞，95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，蒸餾水浸洗3次，風(fēng)干后熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。

1.2.8 細(xì)胞周期和凋亡測(cè)定 將已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好TPC-1細(xì)胞消化后離心，一部分用預(yù)冷的PBS洗滌3次后離心，加入預(yù)冷的70%乙醇固定過(guò)夜，再次離心并洗滌后用含RNase及碘化丙啶(PI)的染色液室溫下避光孵育30min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。另一部分加500μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加1μl Annexin V-PI熒光染料充分混勻，室溫下避光孵育20min，1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR和Western印跡法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后YAP基因和蛋白的表達(dá)

qRT-PCR和Western印跡法結(jié)果顯示，與NC組和空白對(duì)照組相比，siRNA處理組TPC-1細(xì)胞的YAP mRNA和YAP蛋白表達(dá)均受到顯著抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 MTT檢測(cè)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的變化

MTT測(cè)定和平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示： 隨時(shí)間延長(zhǎng)，空白組與NC組細(xì)胞增殖能力和克隆數(shù)無(wú)差異，YAP-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力和克隆數(shù)則明顯減緩或減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2；劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示： 與空白對(duì)照組和NC組比較，siRNA-YAP組細(xì)胞愈合速度較慢，Transwell小室下層細(xì)胞數(shù)減少(均P<0.05)，見(jiàn)圖3；表明siRNA沉默YAP基因可抑制TPC-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA后的甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞YAP mRNA和蛋白表達(dá)Fig.1 Relative expression of YAP mRNAand protein in TPC-1 thyroid cancer cells after transfected with siRNA demonstrated by qRT-PCR and Western blottingA： qRT-PCR；B： Western印跡法

圖2 MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后TPC-1細(xì)胞增殖能力Fig.2 Proliferation of TPC-1 cells demonstrated by MTT assay and colony formation assayA： MTT；B： 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

圖3 劃痕試驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后TPC-1細(xì)胞遷移、侵襲能力Fig.3 The migration and invasion of TPC-1 cellsdemonstrated by Cell scratch assay and Transwell assayA： 劃痕試驗(yàn)；B： Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化

與空白對(duì)照組(53.60±0.73)%和NC組(55.27±2.10)%相比，siRNA-YAP組G0/G1期細(xì)胞數(shù)(64.40±1.69)%明顯上升(P<0.01)，S期和G2/M期細(xì)胞明顯下降，但細(xì)胞凋亡率則無(wú)差異，表明siRNA沉默YAP可使TPC-1細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響(表1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)所示，siRNA干擾YAP基因后TPC-1細(xì)胞周期受到明顯影響，見(jiàn)圖4。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)blank、NC、siRNA組TPC-1細(xì)胞周期分布

Tab.1 Cell cycle distribution detected by Flow cytometry in TPC-1 cell line (%)

組別G0/G1G2MSBlank53.60±0.7330.40±1.1016.00±1.00NC55.27±2.1029.00±1.0015.73±1.00siRNA64.40±1.6924.00±1.0011.60±1.00

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的TPC-1細(xì)胞周期分布和凋亡Fig.4 Cell cycle distribution and apoptosis in TPC-1 cells shown by flow cytometryA： 細(xì)胞周期分布；B： 凋亡；圖B中右下象限AnnexinV(+)PI(-)代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限AnnexinV(+)PI(+)代表晚期凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞

3 討 論

甲狀腺癌的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果。利用siRNA沉默相關(guān)關(guān)鍵基因治療惡性腫瘤已取得一定的進(jìn)展[6]。

Hippo通路最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控器官發(fā)育，近年不少研究表明與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)[7]。YAP作為Hippo通路的主要效應(yīng)因子，其上游的轉(zhuǎn)錄因子如Mast1/2、Ww45、Lats1/2、Mob1等通過(guò)磷酸化和促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核轉(zhuǎn)位對(duì)YAP起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。這些調(diào)控因子的表達(dá)缺失能使YAP過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致其下游的轉(zhuǎn)錄因子cyclinE、DIAP1、TEAD1、TEAD2等表達(dá)增加，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[8]。研究[9-12]報(bào)道，YAP基因在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌等過(guò)表達(dá)。Tschaharganeh等[13]證實(shí)，肝癌細(xì)胞YAP能上調(diào)Notch信號(hào)通路的配體Jagged-1(Jag-1)、激活Notch信號(hào)通路，從而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)siRNA下調(diào)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞YAP表達(dá)，以觀察細(xì)胞功能的變化。轉(zhuǎn)染siRNA-YAP后，mRNA和蛋白水平Y(jié)AP表達(dá)均被顯著抑制；隨著YAP下調(diào)，TPC-1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲也均受到抑制，細(xì)胞周期阻滯在G1期，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯作用。本實(shí)驗(yàn)只是應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)的YAP特異性siRNA的甲狀腺癌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，對(duì)基因抑制狀態(tài)不穩(wěn)定；且實(shí)驗(yàn)只在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞TPC-1中進(jìn)行驗(yàn)證，也未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此相關(guān)的研究有待進(jìn)一步進(jìn)行。

綜上所述，siRNA能特異性沉默人甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞YAP基因，下調(diào)其mRNA及蛋白表達(dá)水平，抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為甲狀腺癌的基因治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of RNA interference targeting YAP gene on thyroid cancer TPC-1 cells

YANGWei-guo1,HUAKai-yao1,JINJia-li2,FANGLin1

(1. Dept. of Breast and Thyroid Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China;2. Medical College, Tongji University， Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the effect of small interfering RNA (siRNA) targeting Yes associated protein (YAP) gene on thyroid cancer TPC-1 cells. Methods siRNA targeting YAP gene was transfected in thyroid cancer TPC-1 cells with LipofectamineTM2000. qRT-PCR and Western blotting were conducted to determine YAP suppression at mRNA and protein levels by siRNA. MTT assay, colony formation assay, Transwell migration assay wound healing assay and flow cytometry were used to study the effects of siRNA on cell proliferation, migration, cell cycle and apoptosis, respectively. Results Expression of YAP was suppressed after interference of YAP siRNA (P<0.05), proliferation, migration and invasion of TPC-1 cells were inhibited; cells were arrested at G0/G1phase, but cellular apoptosis rate was not significantly changed. Conclusion The results indicate that YAP gene exerts a vital role in biological behaviors of thyroid cancer TPC-1 cells.

thyroid cancer; Yes associated protein; siRNA; cellular function

10.16118/j.1008-0392.2016.01.006

2015-10-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272240)

楊衛(wèi)國(guó)(1981—)，男，碩士研究生.E-mail： changning021@163.com

房 林.E-mail： fanglin_f@126.com

R 736.1

A

1008-0392(2016)01-0028-05