麻黃-桂枝配伍對(duì)麻黃類生物堿、桂皮酸及桂皮醇在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

衛(wèi)　平，陳飛龍，馬欽海，任孟月，羅佳波

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州　510515；2. 深圳市坪山新區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳　518122)

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麻黃-桂枝配伍對(duì)麻黃類生物堿、桂皮酸及桂皮醇在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

衛(wèi)平1，2，陳飛龍1，馬欽海1，任孟月1，羅佳波1

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510515；2. 深圳市坪山新區(qū)婦幼保健院藥劑科，廣東 深圳518122)

摘要：目的建立UPLC-MS/MS法，對(duì)麻黃-桂枝藥對(duì)提取物、單味麻黃提取物和單味桂枝提取物中麻黃類生物堿、桂皮醇及桂皮酸的血漿藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行比較研究，探討中藥復(fù)方配伍對(duì)藥效成分體內(nèi)過(guò)程的影響。方法實(shí)驗(yàn)大鼠分別灌胃麻黃、桂枝及麻黃-桂枝提取物，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中麻黃類生物堿、桂皮醇和桂皮酸的濃度，采用DAS3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，SPSS13.0對(duì)兩組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果麻黃-桂枝組中去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿的達(dá)峰濃度(Cmax)均明顯大于麻黃組(P<0.05)；麻黃-桂枝組中去甲基偽麻黃堿的藥時(shí)曲線下面積(AUC0-t)明顯大于麻黃組(P<0.05)；麻黃-桂枝組中去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿的平均駐留時(shí)間(MRT0-t)均明顯小于麻黃組(P<0.05)；麻黃-桂枝組中去甲基麻黃堿、麻黃堿和甲基麻黃堿的半衰期(T1/2z)明顯小于麻黃組(P<0.05)。麻黃-桂枝組中桂皮醇、桂皮酸的AUC0-t和MRT0-t均明顯大于桂枝組(P<0.05)。結(jié)論麻黃與桂枝配伍后，增加了5種麻黃生物堿在體內(nèi)的吸收濃度，延緩了去甲麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿在體內(nèi)的消除，提高了桂皮醇和桂皮酸的生物利用度。

關(guān)鍵詞：麻黃；桂枝；麻黃-桂枝藥對(duì)；麻黃類生物堿；桂皮酸；桂皮醇；血漿藥動(dòng)學(xué)；UPLC-MS/MS

藥對(duì)又叫“對(duì)藥”，具備方劑的基本作用，是中醫(yī)遣方用藥的特色之一，是最簡(jiǎn)單、最基本和最常見(jiàn)的中藥配伍形式[1]。麻黃-桂枝藥對(duì)在多個(gè)經(jīng)典方劑中都有應(yīng)用，如麻黃湯、小青龍湯等，臨床上也具有較高的配伍使用頻率，具有發(fā)汗解表、疏風(fēng)散寒、止咳平喘功效[2]。課題組前期對(duì)麻黃-桂枝藥對(duì)的化學(xué)成分、藥理作用、代謝組學(xué)以及最佳配比等進(jìn)行了大量研究[3-4]。但麻黃-桂枝藥對(duì)體內(nèi)過(guò)程、單方及復(fù)方中各成分的藥動(dòng)學(xué)相互作用的影響還不明確，有待進(jìn)一步研究。麻黃為麻黃科植物草麻黃EphedrasinicaStapf、中麻黃EphedraintermediaSchrenk et C. A. Mey. 或木賊麻黃EphedraequisetinaBge.的干燥草質(zhì)莖，其主要含多種生物堿和少量的揮發(fā)油等[5]。桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥嫩枝，主要含有桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸和香豆素等[6]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)手段，UPLC-MS/MS法檢測(cè)分析麻黃提取物中具有代表性的麻黃類生物堿(甲基麻黃堿(norephedrine, NME)、去甲基偽麻黃堿(norpseudoephedrine, NMP)、麻黃堿(ephedrine, E)、偽麻黃堿(pseudoephedrine, PE)和甲基麻黃堿(methylephedrine, ME))和桂枝提取物中具有代表性的桂皮醇(cinnamic alcohol, CAL)、桂皮酸(cinnamic acid, CA)的濃度，研究麻黃-桂枝配伍前后血漿藥動(dòng)學(xué)特征的變化，探討復(fù)方中藥配伍對(duì)麻黃類生物堿、桂皮酸和桂皮醇代謝的影響，為該藥對(duì)更深層次的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器

1290Infinity-G6410型UPLC-MS/MS聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；XW-80A型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；CP225D型十萬(wàn)分之一天平(美國(guó)Denver公司)；CP3243型萬(wàn)分之一天平(美國(guó)Denver公司)；自制氮?dú)獯蹈裳b置。

1.2試劑與試藥

鹽酸麻黃堿(批號(hào)：171241-201007)，鹽酸偽麻黃堿(批號(hào)：171237-200807)，鹽酸甲基麻黃堿(批號(hào)：171247-200301)，桂皮酸(批號(hào)：110786-200503)，鹽酸金剛烷胺(IS1，批號(hào)：100426-201002)和鹽酸苯海拉明(IS2，批號(hào)：100066-200506)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；桂皮醇對(duì)照品(批號(hào)：30794)，購(gòu)自阿拉丁公司；鹽酸去甲基麻黃堿及鹽酸去甲基偽麻黃堿對(duì)照品(含量≥98%，赤峰艾克制藥科技股份有限公司，批號(hào)：20100412)；乙腈(色譜純，Merck公司)，甲酸(色譜純，Tedia公司)；乙醚、二氯甲烷均為分析純；雙蒸水由南方醫(yī)科大學(xué)純水中心提供；單味麻黃、單味桂枝和麻黃-桂枝提取物均為實(shí)驗(yàn)室自制(批號(hào)：20140110)，經(jīng)“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定得單味麻黃提取液中NME、NMP、E、PE和ME的濃度分別為0.12、0.22、2.70、1.12和0.27 g·L-1，麻黃-桂枝提取液中5種成分的濃度相應(yīng)為0.10、0.19、2.76、1.23和0.28 g·L-1；單味桂枝提取液中CAL和CA的濃度分別為34.25和352.48 mg·L-1，麻黃-桂枝提取液中2種成分的濃度相應(yīng)為31.30和334.30 mg·L-1。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawley (SD)大鼠18只，♂，體質(zhì)量(250±20)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵) 2011-0015。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

2方法

2.1液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件

2.1.1檢測(cè)麻黃生物堿的條件[10]色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 columm(3.5 μm, 2.1×100 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%的甲酸水溶液(B)，程序洗脫(0～3 min：97% B；3～5 min：97%～96% B；5～7 min：96% B；7～7.5 min：96%～82% B；7.5～9 min：82% B；9～9.1 min ：82%～97% B)；流速：0.40 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。離子源：ESI源；毛細(xì)管電壓：4 000 V，霧化器壓力：30 psi；干燥氣流溫度：350 ℃；干燥氣流速度：8.0 L·min-1；碰撞氣為高純氮?dú)猓徊杉Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；掃描離子：正離子。用于定量分析的離子對(duì)分別為：NME與NMPm/z152.1>134.1，E與PEm/z166.1>148.1，MEm/z180.1>162.1，ISm/z152.2>135.1。Fragmentor分別為75、88、110、95；碰撞能分別為8、12、12、20 V。

2.1.2檢測(cè)桂皮酸及桂皮醇的條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 columm(3.5 μm, 2.1×100 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A) ∶0.1%的甲酸水溶液(B)=30 ∶70，等梯度洗脫；流速：0.40 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；洗脫時(shí)間：3.9 min。離子源：ESI源；毛細(xì)管電壓：4 000 V，霧化器壓力：30 psi；干燥氣流溫度：350 ℃；干燥氣流速度：10.0 L·min-1；碰撞氣為高純氮?dú)?。采集模式：多反?yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。掃描離子：正離子。用于定量分析的離子對(duì)分別為：CAL m/z 117.1>117.1、CA m/z 149.1>131.1、IS m/z 256.2>167.1。Fragmentor分別為100、80、85；碰撞能均為7 V。

2.2對(duì)照品溶液的配制

精密稱取NME、NMP、E、PE和ME對(duì)照品適量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。其中含NME、NMP、E、PE和ME分別為212.4、219.9、2044.1、1022.4和407.1 mg·L-1。精密稱取CA、CAL對(duì)照品適量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。其中含CA和CAL分別為125.00、200.00 mg·L-1。上述對(duì)照品儲(chǔ)備液依次稀釋得系列對(duì)照品溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞芊Q取鹽酸金剛烷胺(amantadine, IS1)對(duì)照品適量于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得11.32 mg·L-1的IS1對(duì)照品溶液。精密稱取鹽酸苯海拉明(diphenhydramine, IS2)對(duì)照品適量于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，得103.00 mg·L-1的IS2對(duì)照品溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血漿樣品預(yù)處理

2.3.1含麻黃生物堿的血樣預(yù)處理[10]5 mL EP管中加入血漿樣品100 μL，IS1溶液30 μL，甲醇100 μL，渦流30 s，加入40 μL的飽和碳酸鈉溶液，渦流30 s，加入1.2 mL乙醚-二氯甲烷(6 ∶4，V/V)溶液，渦流2 min，14 000 r·min-1離心10 min，分取上層溶液；再以1.2 mL乙醚-二氯甲烷(6 ∶4，V/V)溶液重復(fù)萃取1次，合并上層溶液于N2流下吹干，殘留物用200 μL 流動(dòng)相初始配比溶液(乙腈 ∶0.1%甲酸水溶液=3 ∶97，V/V)復(fù)溶，渦流2 min，14 000 r·min-1離心20 min，取上清進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)分析。

2.3.2含桂皮醇及桂皮酸的血樣預(yù)處理2 mL EP管中加入血漿樣品100 μL，IS2溶液20 μL，甲醇100 μL，渦流10 s，加入0.5 mL乙腈，渦流2 min，14 000 r·min-1離心10 min，分取上層溶液，于N2流下吹干，殘留物用100 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦流2 min，14 000 r·min-1離心10 min，取上清進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)分析。

2.4藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

將18只健康SD大鼠，按體重隨機(jī)分為單味麻黃提取物組、單味桂枝提取物組和麻黃-桂枝提取物組，給藥前禁食12 h，但可自由飲水。大鼠口服給予8.10 g·kg-1單味麻黃提取物，13.50 g·kg-1麻黃-桂枝提取物，5.4 g·kg-1單味桂枝提取物[4](根據(jù)給藥量進(jìn)行折合，前兩組均相當(dāng)于NME 0.95 mg·kg-1，NMP 1.81 mg·kg-1，E 21.98 mg·kg-1，PE 9.03 mg·kg-1，ME 2.15 mg·kg-1；后兩組均相當(dāng)于CAL 0.04 mg·kg-1，CA 1.09 mg·kg-1)，分別于給藥前和給藥后0.08、 0.25、 0.5、 0.75、 1.5、 3、 4、 6、 8、 12、 24、 48 h(其中單味桂枝組和麻黃-桂枝組增采36 h時(shí)間點(diǎn))經(jīng)眼眶靜脈叢采血約0.5 mL于肝素化的EP管中，4 000 r·min-1離心10 min，分離血漿置-20 ℃冰箱中保存。

3結(jié)果

3.1專屬性考察

取空白血漿、空白血漿加麻黃生物堿混合對(duì)照品溶液和IS1溶液以及給藥后大鼠的含藥血漿，分別按“2.3.1”項(xiàng)下預(yù)處理方法處理樣品，在“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，獲得色譜圖Fig 1；另取空白血漿、空白血漿加CAL、CA混合對(duì)照品溶液和IS2溶液以及給藥后大鼠的含藥血漿，分別按“2.3.2”項(xiàng)下預(yù)處理方法處理樣品，在“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，獲得色譜圖Fig 2。由結(jié)果可見(jiàn)，空白血漿的內(nèi)源性物質(zhì)在待測(cè)物出峰時(shí)間處干擾小，專屬性強(qiáng)；待測(cè)物L(fēng)LOQ的血漿樣品出峰時(shí)間合適，峰型良好、分離度恰當(dāng)；適合大鼠血漿樣品的測(cè)定。

3.2線性關(guān)系考察

取空白血漿100 μL，加入系列對(duì)照品混合溶液100 μL，除不加100 μL甲醇外，按“2.3.1”項(xiàng)下處理，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，按“2.1.1”項(xiàng)方法測(cè)定，記錄樣品峰面積，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)Y，待測(cè)物的濃度為橫坐標(biāo)X，用加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線NME：Y=0.0014X+0.0039(r2=0.9919)、NMP：Y=0.0016X-0.0035(r2=0.9971)、E：Y=0.0010X+0.1212(r2=0.9982)、PE：Y=0.0015X+0.0439(r2=0.9995)、ME：Y=0.0006X+0.0037(r2=0.9998)，線性范圍分別為0.11～1062.00、0.11～1099.50、1.23～12205.00、0.51～5112.00、0.21～2035.50 μg·L-1，定量下限分別為0.11、0.11、1.23、0.51、0.21 μg·L-1。同法得標(biāo)準(zhǔn)曲線CA：Y=0.0008X+0.0836(r2=0.9977)、CAL：Y=0.0012X+0.0531(r2=0.9955)，其線性范圍分別為1.61～6042.00、2.11～211.20 μg·L-1，定量下限分別為1.61、2.11 μg·L-1。

3.3精密度和準(zhǔn)確度

取空白血漿100 μL，加入系列對(duì)照品混合溶液，制備麻黃類生物堿高、中、低濃度(NME：531.00、53.10、1.06 μg·L-1；NMP：549.75、54.98、1.10 μg·L-1；E：6102.50、610.25、12.21 μg·L-1；PE：2556.00、255.60、5.11 μg·L-1；ME：1017.75、101.78、2.04 μg·L-1)的質(zhì)控樣品(QC)，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3日，根據(jù)當(dāng)日的隨行標(biāo)曲算得QC樣品濃度，與配制濃度對(duì)照，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度(RSD)和準(zhǔn)確度(RE)，結(jié)果5種麻黃類生物堿的日內(nèi)RSD均小于10.9%、RE為-6.6%～8.2%，日間RSD均小于13.1%、RE為-8.1%～2.3%。同法制得CA：3222.40、161.12、6.04 μg·L-1；CAL：105.60、21.12、5.28 μg·L-1高、中、低濃度的質(zhì)控樣品(QC)，得CA和CAL的日內(nèi)RSD均小于9.6%,、RE為-3.8%～-1.1%，日間RSD均小于7.3%、RE為-6.5%～-2.3%。由上述結(jié)果可見(jiàn)，均符合生物樣品分析方法的要求。

Fig 1　Representative UPLC-MS/MS chromatograms of plasma samples

A:Rat blank plasma; B:Rat blank plasma spiked with standard solutions in LLOQ; C:The rat plasma sample collected at 1.5h after oral administration of Ephedrae extract; D:The rat plasma sample collected at 1.5 h after oral administration of Ephedrae-Cinnamomi extract; 1.NME/NMP; 2.E/PE; 3.ME; 4. IS1

Fig 2　Representative UPLC-MS/MS chromatograms of plasma samples

A: Rat blank plasma; B: Rat blank plasma spiked with standard solutions in LLOQ; C: The rat plasma sample collected at 0.75h after oral administration of Cinnamomi extract; D: The rat plasma sample collected at 0.75 h after oral administration of Ephedrae-Cinnamomi extract; 1.CAL; 2.CA ; 3.IS2.

3.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取空白血漿100 μL,經(jīng)“2.3.1”項(xiàng)下處理后分別加入高、中、低濃度QC樣品溶液復(fù)溶，進(jìn)樣后所得峰面積為分子，對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣后所得峰面積為分母，計(jì)算得基質(zhì)效應(yīng)；另取高、中、低濃度QC樣品，經(jīng)“2.3.1”項(xiàng)下處理后，所得峰面積與空白血漿經(jīng)“2.3.1”項(xiàng)下處理后加相應(yīng)對(duì)照品溶液進(jìn)樣所得的峰面積相比，計(jì)算得提取回收率。各成分3種濃度的基質(zhì)效應(yīng)為NME：94.06%～100.96%、NMP：91.23%～100.98%、E：89.02%～96.16%、PE：87.17%～94.91%、ME：96.87%～102.41%(n=5，RSD均小于9.7%)，IS1：95.52%(n=5，RSD=6.9%)；3種濃度下的提取回收率為NME：94.6%～96.4%、NMP：90.9%～98.6%、E：89.3%～96.3%、PE：81.9%～99.5%、ME：82.8%～96.1%(n=5，RSD均小于5.6%)，IS1：91.8%(n=5，RSD=2.8%)。同法得3種濃度下CA和CAL的基質(zhì)效應(yīng)分別為86.00%～95.50%、89.11%～90.40%(n=5，RSD均小于9.6%)，IS2：89.67%(n=5，RSD=5.4%)；3種濃度下的提取回收率為CA：81.96%～92.83%、CAL：82.64%～87.44%(n=5，RSD均小于9.4%)，IS2：92.48%(n=5，RSD=6.2%)。由結(jié)果可見(jiàn)，該方法無(wú)明顯離子增強(qiáng)或抑制效應(yīng)；IS的提取回收率與分析物的回收率相近，平行性好，起到了很好的校正作用，提高了方法的準(zhǔn)確度。

3.5穩(wěn)定性考察

取空白血漿100 μL，按“3.1.3”項(xiàng)下制備含待測(cè)物高、中、低濃度的血漿樣品各5份，考察樣品處理前3次反復(fù)凍融，置于-20 ℃保存30 d和經(jīng)處理后室溫放置10 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，樣品處理前3次反復(fù)凍融后血漿中麻黃類生物堿濃度的RE為-5.6%～3.8%，-20 ℃保存30 d后血漿濃度的RE為-2.8%～1.0%，經(jīng)處理后室溫放置10 h后血漿濃度的RE為-3.9%～1.2%。同法得樣品處理前3次反復(fù)凍融血漿中桂皮醇、桂皮酸濃度的RE為-9.7%～-1.3%，-20 ℃保存30 d后血漿濃度的RE為-8.5%～1.7%，經(jīng)處理后室溫放置10 h后血漿濃度的RE為-9.0%～1.0%。由結(jié)果可見(jiàn)，在以上條件下，待測(cè)物均能保持穩(wěn)定。

3.6藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

麻黃類生物堿、桂皮醇和桂皮酸的平均C-T曲線分別見(jiàn)Fig 3和Fig 4，采用DAS3.0軟件對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)Tab 1，Tab 2。

4討論

在桂枝與麻黃-桂枝提取物血漿藥動(dòng)學(xué)的研究中，桂枝的檢測(cè)成分選擇了桂皮酸和桂皮醇，而沒(méi)有選擇桂皮醛。因?yàn)樵谘芯康那捌诿麟A段，發(fā)現(xiàn)桂皮醛對(duì)照品極不穩(wěn)定，很難達(dá)到生物樣品檢測(cè)方法學(xué)的要求；另由相關(guān)研究報(bào)道，桂皮醛進(jìn)入體內(nèi)后迅速氧化為桂皮酸，經(jīng)β-氧化作用后生成苯甲酸[7]，并與甘氨酸結(jié)合，再在ATP與酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成代謝物馬尿酸，經(jīng)尿液排出體外[8]。

Tab 1　Pharmacokinetic parameters for NME, NMP, E, PE, ME in rats plasma after oral administration of Ephedrae and Ephedrae-Cinnamomi±s,n=6)

*P<0.05vsEphedrae

Tab 2　Pharmacokinetic parameters for CAL, CA in rats plasma after oral administration of Cinnamomi and Ephedrae-Cinnamomi±s,n=6)

*P<0.05vsCinnamomi

生物樣品檢測(cè)方法的建立和驗(yàn)證是藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)，由于在藥動(dòng)學(xué)研究中，生物藥品存在濃度較低，基質(zhì)環(huán)境復(fù)雜等問(wèn)題，因此，建立快速、靈敏可靠的生物樣品測(cè)定方法是本課題擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一，以實(shí)現(xiàn)高通量的生物樣品分析，滿足藥動(dòng)學(xué)研究大樣本量的要求[9]。本文麻黃類生物堿UPLC-MS/MS檢測(cè)方法采用了本課題組前期的分析方法[10]。為了改善色譜分離并同時(shí)提高質(zhì)譜響應(yīng)，在檢測(cè)桂皮酸和桂皮醇時(shí)，借鑒了麻黃類生物堿的研究方法對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。分別對(duì)甲醇-水及乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行了探索，并向其中加入一定量的甲酸，這樣有利于提高待測(cè)物在正離子檢測(cè)方式下的質(zhì)譜響應(yīng)。分析時(shí)發(fā)現(xiàn)含乙腈的流動(dòng)相更能提高待測(cè)物的響應(yīng)，改善了峰形以及降低了背景噪音，最終選擇了乙腈-0.1%甲酸水(30 ∶70)等梯度洗脫來(lái)檢測(cè)分析桂皮酸和桂皮醇。在內(nèi)標(biāo)物的選擇上，根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，分別對(duì)鹽酸苯海拉明、苯丙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等[11-14]進(jìn)行了考察，最終確定了鹽酸苯海拉明為檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)物。

Fig 4　Mean plasma concentration-time profiles of CAL and CA after oral administration of Cinnamomi and Ephedrae-Cinnamomi±s,n=6)

結(jié)果顯示，麻黃類生物堿在麻黃-桂枝藥對(duì)和單味麻黃給藥的情況下，兩者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、MRT0-t(NMP除外)、T1/2z(NMP和PE除外)、Vz/F(NMP和PE除外)差異具有顯著性，NMP的AUC0-t和CLz/F差異具有顯著性，其中NME、E和ME具有相似的藥動(dòng)學(xué)趨勢(shì)。提示麻黃-桂枝藥對(duì)中的其他成分在藥物的吸收上起到了促進(jìn)作用，而在藥物的消除上有起到了延緩作用。另麻黃類生物堿的藥動(dòng)學(xué)趨勢(shì)還與本身的藥物結(jié)構(gòu)存在一定的關(guān)系。桂皮酸和桂皮醇在麻黃-桂枝藥對(duì)和單味桂枝給藥的情況下，兩者的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-t、MRT0-t、Vz/F和CLz/F差異均具有顯著性，提示麻黃-桂枝藥對(duì)中的其他成分可提高桂皮酸和桂皮醇的生物利用度，延緩二者在體內(nèi)的分布和消除。

中藥復(fù)方在中國(guó)具有悠久的使用歷史，在臨床上中藥配伍給藥有其內(nèi)在的合理性。本研究從血漿藥動(dòng)學(xué)的角度，探討了麻黃與桂枝配伍使用后，效應(yīng)成分起到了協(xié)同的作用，復(fù)方配伍給藥可能影響其他藥物有效成分的吸收程度及消除速率，其內(nèi)在的作用機(jī)制有待大量的實(shí)驗(yàn)研究。

(致謝：感謝廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本實(shí)驗(yàn)的開展提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)耗材與儀器設(shè)備。真誠(chéng)感謝實(shí)驗(yàn)室各位同學(xué)、老師在實(shí)驗(yàn)中給予我的指導(dǎo)和幫助。)

參考文獻(xiàn)：

[1]胥慶華. 中藥藥對(duì)大全[M]. 北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社, 1997, 1.

[1]Xu Q H.EncyclopediaoftraditionalChineseMedicine[M].Beijing: Chinese Press of Traditional Chinese Medicine, 1997, 1.

[2]陳華章.《千金方》麻黃與桂枝相伍探析[J]. 中醫(yī)藥通報(bào), 2006, 4(5): 23-5.

[2]Chen H Z. Analysis on the combined Ephedra with Cinnamomi in thousand golden prescriptions[J].TraditChinMedJ, 2006, 4(5): 23-5.

[3]徐文杰, 陳飛龍, 謝穎, 羅佳波. 不同配伍配比對(duì)麻黃-桂枝藥對(duì)有效成分含量的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2012, 10(18):84-8.

[3]Xu W J, Chen F L, Xie Y, Luo J B. Content of active compounds in water extracts of ephedra with cinnamomi by compatibility of different ratio[J].ChinJExpTraditMedForm, 2012, 10(18):84-8.

[4]徐文杰. 麻黃類藥對(duì)組成規(guī)律的基礎(chǔ)研究—麻黃桂枝藥對(duì)I[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué), 2012.

[4]Xu W J. Basic Research on the composition rules of herba ephedrae couplet medicines—couplet medicines of Herba Ephedrae-Ramulus Cinnamomi I[D]. Guangzhou: Southern Medical University, 2012.

[5]李佳蓮, 方磊, 張永清,等. 麻黃的化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2012, 7(14):21-7.

[5]Li J L, Fang L, Zhang Y Q, et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological activities of Ephedra[J].ModChinMed, 2012, 7(14):21-7.

[6]劉江云, 楊學(xué)東, 徐麗珍, 楊世林. 桂枝的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥, 2002, 8(33):681-3.

[6]Liu J Y, Yang X D, Xu L Z, Yang S L. Studies on chemical constituents in dried tender stem of Cinnamomum cassis[J].ChinTraditHerbDrugs, 2002, 8(33):681-3.

[7]Yuan J H, Dieter M P, Bucher J R. Toxicokinetics of cinnamic aldehyde in F344 rats[J].FoodChemToxicol, 1992, 30(12):997.

[8]楊軍, 鄭法雷. 馬尿酸與尿毒癥[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊(cè), 1989, 9(4):145.

[8]Yang J, Zheng F L. Hippuric acid and Uremia[J].UrolNephrolForeignMedSci, 1989, 9(4):145.

[9]甘萍, 霍仕霞, 白鵬, 等. 類葉升麻苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(3)：417-20.

[9]Gan P, Huo S X, Bai P, et al. Pharmacokinetics and tissue distribution study on acetoside in rats[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(3)：417-20.

[10]Wei P, Huo H Y, Ma Q H, et al. Pharmacokinetic comparisons of five ephedrine alkaloids following oral administration of four different Mahuang-Guizhi herb-pair aqueous extracts ratios in rats[J].JEthnopharmacol, 2014, 155(1):642-8.

[11]王睿, 孫天慧, 景丹,等. 高效液相色譜法測(cè)定家兔血漿中桂皮酸的濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)初探[J]. 色譜, 2005, 23(3):273-5.

[11]Wang R, Sun T H, Jing D, et al. High performance liquid chromatographic determination of cinnamic acid in rabbit plasma and application in study of pharmacokinetics[J].ChinJChromatogr, 2005, 23(3):273-5.

[12]陳瑩蓉, 馬越鳴, 張寧,等. 高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中桂皮酸和馬尿酸[J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(2):212-6.

[12]Chen Y R, Ma Y M, Zhang N, et al. HPLC determination of cinnamic acid and hippuric acid in rat plasma[J].JPharmAnal, 2009, 29(2):212-6.

[13]Bogan D P, Kennedy R. Simultaneous determination of coumarin, 7-hydroxycoumarin and 7-hydroxycoumarin glucuronide in human serum and plasma by high-performance liquid chromatography[J].JChromatogrBiomedAppl, 1996, 686:267-73.

[14]Zhang J, Chen M, Ju W Z, et al. Liquid chromatograph/tandem mass spectrometry assay for the simultaneous determination of chlorogenic acid and cinnamic acid in plasma and its application to a pharmacokinetic study[J].JPharmBiomedAnal, 2010, 51:685-90.

Effects of combined administration of Ephedrae-Cinnamomi on pharmacokinetics of ephedra alkaloids, cinnamic acid and cinnamic alcohol in rats

WEI Ping1，2, CHEN Fei-long1, MA Qin-hai1, REN Meng-yue1, LUO Jia-bo1

(1.KeyLaboratoryofChineseDrugsPharmaceuticsofGuangdongProvince,CollegeofChineseTraditionalMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2.ShenzhenPingshanMaternalandChildHealthHospital,Shenzhen518122,China)

Abstract:AimsTo compare the pharmacokinetics of ephedra alkaloids, cinnamic acid and cinnamic alcohol in Ephedrae, Cinnamomi and Ephedrae-Cinnamomi herb couple through UPLC-MS/MS in rats respectively, and to investigate the effect of combination on physiological disposition.MethodsPlasma samples were collected at different times after oral administration of Ephedrae, Cinnamomi and Ephedrae-Cinnamomi herb couple extracts. The concentrations of ephedra alkaloids, cinnamic acid and cinnamic alcohol in plasma samples were determined by UPLC-MS/MS. DAS 3.0 was used to calculate pharmacokinetic parameters. The differences of samples in two groups were conducted with univariate statistical analysis using SPSS 13.0.ResultsCompared with Ephedrae group, theCmaxof norephedrine hydrochloride, norpseudoephedrine hydrochloride, ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, and methylephedrine hydrochloride in Ephedrae-Cinnamomi herb couple group were significantly greater (P<0.05); the AUC0-tof norpseudoephedrine hydrochloride was significantly greater (P<0.05); the MRT0-tof norephedrine hydrochloride, phedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, and methylephedrine hydrochloride were significantly less (P<0.05); theT1/2zof norephedrine hydrochloride, phedrine hydrochloride, and methylephedrine hydrochloride were significantly less (P<0.05). The AUC0-tand MRT0-tof cinnamic acid and cinnamic alcohol were significantly greater than those in Cinnamomi group(P<0.05).ConclusionThe combination of Ephedrae and Cinnamomi improves the absorption concentration of five ephedra alkaloids, Slows down the elimination of norephedrine hydrochloride, phedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, and methylephedrine hydrochloride, and increases the bioavailability of cinnamic acid and cinnamic alcohol.

Key words:Ephedrae; Cinnamomi; Ephedrae-Cinnamomi herb couple; ephedra alkaloids; cinnamic acid; cinnamic alcohol; plasma pharmacokinetics; UPLC-MS/MS

收稿日期:2016-01-11,修回日期:2016-02-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81030066)

作者簡(jiǎn)介：衛(wèi)平(1981-), 女, 博士, 主管藥師, 研究方向: 藥物分析及中藥藥代動(dòng)力學(xué), Tel:0755-66858751,E-mail:weiping1238@126.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.026

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0873-08

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R282.71；R289.1；R969.1

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.052.html

羅佳波(1947-), 男, 教授, 研究方向:中藥復(fù)方制劑組方原理及配伍規(guī)律,Tel:020-61648266,E-mail: Luojb_smu@163.com